THU NHẬN ENZYME PEPSIN từ động vật

Hình 1: Cấu tạo phân tử Pepsin
THU NHẬN ENZYME PEPSIN TỪ ĐỘNG VẬT
I. TỔNG QUAN
Enzyme từ nguồn động vật và khả năng ứng dụng:
Enzyme Nguồn gốc Ứng dụng
Trypsin
Pepsin
Α-chymotripsin
Rennet
Protease tuyến tụy
Tụy tạng động vật
Dạ dày động vật
Dạ dày động vật
Dạ dày bê
Tụy tạng động vật
Y học, mềm thịt, làm trong beer
Trợ tiêu hóa, mềm thịt
Y học
Sản xuất cheese
Trợ tiêu hóa, tẩy, thuộc da, tẩy lông, cải thiện
thức ăn
Bảng 1: Các loại Enzyme từ động vật
1. Pepsin
Vào năm 1713, Reaumur và Spallanzaai đã chứng minh bằng kết quả thí nghiệm
là có “sự tồn tại một nguyên lý tiêu hóa thịt trong dịch vị”. Sau này, Braconnol và đặc
biệt Paulo nghiên cứu về cơ chế tiết dịch vị ở dạ dày, nhưng mãi đến 1836, Schwann mới
phát hiện ra là chất men phân giải protein của dịch vị.
Vào năm 1882, Langley đã thu được pepsinogen, tiền pepsin bằng cách trích dịch
vị dạ dày heo với dung dịch kiềm sau đó dùng acid để chuyển pepsinogen thành pepsin.
Đến năm 1930, Nothrop đã thu nhận được pepsin dạng tinh thể.
a. Enzyme pepsin

Pepsin là một enzyme quan trọng của tuyến tiêu hóa động vật thuộc nhóm enzyme
thủy phân (hydrolase). Số phân loại E.C.3.4.4.1, pepsin có tên hệ thống là peptide-
peptidohydrolase. Enzyme này hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát
và cá. Ở heo thì pepsin tập trung chủ yếu ở phần đáy dạ dày.
Cấu tạo: Pepsin là một sợi polypeptid đơn giản có thể cuộn lại thành hình cầu
-1-
Pepsin là một protein vững chắc bởi các mối liên kết Hydro, hydrophobic, liên kết
điện tử và 3 liên kết S-S.
Hình 2: Các liên kết trong phân tử Pepsin
Pepsin gồm một mạch polypeptid hợp thành bởi 329 amino acid, mà đầu C là
alanin và đầu N là isoleucin. Theo Williamson và Dassmamn, nhóm N cuối của pepsin là
chuỗi liên kết peptid gồm 6 amino acid như sau:
Leu – Gly – Asp – Asp – His – Glu
Thứ tự đầu cuối C của pepsin đã được xác định bởi Van Vunatcis và Herriott
(1966) và bởi Willamson, thứ tự là:
Val – Gly – Ala
-2-
Trung tâm hoạt động của pepsin gồm 1 hoặc 2 nhóm carboxyl của acid glutamic,
một nhân thơm (phenol) của Tyrosin.
Hình 3: Trung tâm hoạt động của pepsin
Thành phần hóa học: hàm lượng N chiếm 14.7%
Thành phần amino acid:
Tên
amino acid
Số gam
a.a/100g
pepsin
Số gốc a.a
trong 1 pt
pepsin

Tên
amino acid
Số gam
a.a/100g
pepsin
Số gốc a.a
trong 1 pt
pepsin
Cystin
Cystein
Mehtionin
Arginin
Histtidin
Lysin
Acid aspatic
Acid glutamic
Serin
Threonin
1.64
0.50
0.70
1.00
0.90
0.90
16.00
11.90
12.20
9.60
4
2

4
2
2
2
41
28
40
28
Glycin
Valin
Leucin
Prolin
Phenylalanin
Isoleucin
Tyrosin
Tryptophan
Amide N
6.40
7.10
10.40
5.00
6.40
10.80
8.50
2.40
1.32
20
21
27
15

13
28
16
4
32
Bảng 2: Thành phần Amino acid trong phân tử pepsin
Pepsin chứa nhiều nhóm amino acid có các đặc điểm:
-3-
- Có tính acid → pepsin thể hiện tính acid mạnh.
- Kỵ nước
- Mạch nhánh không phân cực → pepsin dễ tan trong rượu etylic nồng độ
cao và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực.
Do đặc điểm về thành phần amino acid, pepsin tinh khiết mang điện tích (-) ngay
cả trong môi trường HCl 0.1N
Phân loại: dựa theo nguồn gốc hình thành (từ màng nhầy hay các phần khác của
dạ dày) chia thành 4 loại pepsin A, B, C và D với các pepsinogen (tiền pepsin) tương ứng
Pepsin được tách từ các nguồn động vật khác nhau (heo, bò) và các pepsin khác
nhau được tách từ cùng một nguồn (A, B, C, D) thì có đôi chút khác nhau về thành phần
hóa học.
Trọng lượng phân tử: 34500 Dalton, pepsin của heo lớn hơn một chút khoảng
35000 Dalton.
Loại TLPT (Dalton) Amino acid ở đầu N
Pepsinogen A
Pepsin A
Pepsinogen B
Pepsin B
Pepsinogen C
Pepsin C
Pepsinogen D
Pepsin D

40 400 ± 1600
32 700 ± 1200
39 000
38 600
41 400
36 000
41 000
35 000
Leu
Ile
Met, His
Ala
Ser
Ser và Leu hoặc Ile
Leu
Ile
Bảng 3: Khối lượng phân tử của các loại pepsinogen và pepsin
Đặc tính: Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng
hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi
chua, nếu thêm lactose, glucose hay saccarose thì có vị ngọt (Dược điển Việt Nam).
Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước cho một dung dịch đục lờ, không tan trong cồn
95
o
, ester, chloroform. Pepsin ở cả 2 dạng: kết tinh và thô. Pepsin thô là một hỗn hợp của
pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin heo thô chứa một pepsin chính A,
pepsin phụ B, C, D và gastricsin (E.C.3.4.4.22)
Pepsin xúc tác sự thủy giải protein, tạo các polypeptide, proteose, pepton và vết
amino acid. Pepsin chủ yếu thủy phân liên kết peptid trong đó có sự tham gia của amino
-4-
1

10
20
30
:
:
acid mạch vòng và liên kết Ala-Ser, Ala-Ala,… Pepsin không cắt ở liên kết chứa Valin,
Alanin, và Glycin.
Pepsin phân cắt một cách dễ dàng các protein tan trong nước như albumin,
hemoglobin, mystin, globulin, caxin… còn những protein không tan hay các
nucleprotein, protein hình sợi như keratin, neucin, glagen, gluten, các nucleoprotein…
pepsin khó hoặc không phân cắt được.
Pepsin bị ức chế bởi cơ chất dạng epoxides.
Điểm đẳng điện của pepsin ở gần pH = 1 do sự có mặt của gốc phosphoric acid
trong phân tử enzyme, khi loại bỏ gốc này pH đẳng điện của pepsin là 1.7
Pepsin thủy phân protein trong vùng acid khá rộng từ 1 – 4. pH hoạt động tối ưu
của pepsin thay đổi tùy theo trạng thái và bản chất của cơ chất, thường trong khoảng 1.8-
2.2 . VD: Với cơ chất là protein biến tính, pH tối ưu của hoạt tính xúc tác của pepsin hơi
chuyển về vùng có pH kiềm so với protein nguyên thể (do sự biến tính của protein đã làm
thay đổi tính chất của liên kết thủy phân).
Pepsin bền nhất trong khoảng pH từ 4 – 5, nhưng trong vùng pH này hoạt lực của
enzyme có phần thay đổi giảm đi, từ pH = 5.5 trở lên, pepsin không hoạt động.
Khả năng hòa tan pepsin phụ thuộc vào độ tinh khiết.
Tính đặc hiệu của pepsin phụ thuộc vào loại pepsin. Pepsin A và D tính đặc hiệu
xảy ra trong phạm vi rộng hơn pepsin B và C. Pepsin A, D thủy phân lên cả hai cơ chất
Hb và APD ( acetyl-L-phenylalanyl-L-diiodtyrosine) còn pepsin B chỉ có hoạt động lên
APD, pepsin C chỉ hoạt động lên cơ chất Hb.
Đặc tính thủy phân chuyên biệt đối với chuỗi Insulin B: Chuỗi insulin B oxy hóa
được thủy giải bằng pepsin A-1 và A-3. Hai vị trí nhạy cảm nhất để thủy giải là nối:
Ala14-Leu15 và Leu15-Tyr16. Tỷ số của mức độ phân cắt nối Ala14-Leu15 và Leu15-
Tyr16 khác nhau ở pepsin các loài. Vị trí phân cắt thứ 2 là Leu11-Val12 và Phe25-Tyr26.

Quá trình ủ lâu với pepsin có thể cắt những nối khác như Tyr16-Leu17 và Phe24-Phe25.
-5-
FNNEHLCaGSHL VEA L Y LVCaGERGF F YTPKA
R1 – CO – NH – R2 + R3 – COOH → R3 – CO – NH – R2 + R1 – COOH
Gốc R2 là: – CH – CH2 – C6H4 – OH
COOH
Cũng như nhiều protease khác, ngoài việc phân cắt được liên kết peptid, pepsin có
khả năng phân cắt cả liên kết ester hay những hợp chất ester sulfite có nhân thơm và có
thể làm đông tụ sữa. Ngoài ra pepsin còn gây ra sự phân giải protein ở một số enzyme
như trypsin, pepsin, amilase…
Ngoài khả năng thủy phân các protein tự nhiên, pepsin còn thủy phân nhiều cơ
chất tổng hợp. Trong đó có các liên kết peptide chứa p-nitrophenylalanin, 3,5-
dibromotyrosine hay 3,5-dinitrotyrosine và diiodtyrosine đều bị thủy phân và chúng được
dùng trong nghiên cứu động học phản ứng của pepsin. Pepsin không tác dụng lên
nucleoprotein, hoặc các protein không tan như: keratin, neucin…
Một số trường hợp đặc biệt trong thủy phân protein của pepsin phải kể đến như
sau:
- Chất tạo keo tự nhiên collagen natif chịu sự thủy phân của pepsin, trong khi đó
chất tạo keo tinh sạch lại tỏ ra kháng pepsin
- Các peptide có phân tử lượng nhỏ đặc biệt có thể kháng enzyme.
- Một vài protein khác dễ bị tấn công khi ở dạng tự nhiên hơn là khi đã qua một
lần bị biến tính, trường hợp của ovalbumin là một ví dụ điển hình.
Sự chuyển peptide do pepsin xúc tác
Với sự có mặt của các chất nhận chứa 1 carboxyl tự do, pepsin có thể thực hiện sự
chuyển đổi gốc tyrosin, phản ứng này tiến hành dựa trên sự chuyển amino của phần
amine của chất cho là tyrosin sang chất nhận.
Sơ đồ phản ứng sau:
Quá trình dự trữ pepsin:
- Pepsinogen ổn định 12 – 18 tháng ở 2 – 8
o

C
- Pepsin ổn định 1 – 2 năm ở 2 – 8
o
C
- Dự trữ ở 2 – 8
o
C.
-6-
Chế phẩm pepsin thô có thể giữ hoạt tính được trong nhiều năm ở nhiệt độ 0 - 4
o
C.
Pepsin dạng dung dịch không bền ở pH = 6. Pepsin ở trạng thái khô khá bền, ngay cả
trong điều kiện môi trường nhiệt độ thường, dung dịch pepsin kém bền nhất là khi ở pH
quá thấp. Khi đó, ta thấy xảy ra hiện tượng tự tiêu (tự phân giải của enzyme) kèm theo sự
tạo thành các phân tử nhỏ (vì pepsin hoạt động mạnh trong môi trường khá acid).
Sự tự tiêu:
Pepsin vừa là protein vừa là enzyme phân giải protein nên có khả năng phân hủy
chính nó. Sự tự tiêu được coi là nguyên nhân của tính không đồng nhất khi điện di của
nhiều loại chế phẩm enzym pepsin.
Theo Ingram, trong quá trình pepsin tự tiêu hóa ở nhiệt độ 45
o
C , pH=4 trong 24h,
có 45% tyrosin của phân tử enzyme được giải phóng và kết tinh, ngoài ra còn xuất hiện
các peptide có phân tử lượng nhỏ từ 1000 – 2000.
Theo Perlmann, sự tự tiêu hóa của pepsin tạo ra những sản phẩm có thể thẩm tích
và có hoạt động phân giải protein, tuy nhiên sẽ chỉ còn được 64% hoạt tính gốc, hoạt tính
này được thực hiện trên hemoglobin.
Nói chung, sự tự tiêu của pepsin thường xảy ra trong trường hợp pepsin ở dạng
dung dịch, pH thấp, nhiệt độ thích hợp, tạo ra nhiều thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn
pepsin, giảm lượng tyrosin và chỉ thành phần nào có đặc tính của pepsin gốc thì mới hoạt

động.
b. Tiền enzyme Pepsinogen
Ở phần màng nhầy dạ dày của động vật, có các tế bào chứa zymogen hay
pepsinogen.
Pepsinogen là một protein được cấu tạo từ 400 gốc amino acid và ở dạng mạch
polypeptide đơn, pepsinogen chứa nhiều lysin hơn pepsin.
Northrop và Herriot đã thu được pepsinogen dạng tinh thể hình kim và xác định
pepsinogen không những có trong dịch vị mà còn hiện diện trong máu, nước tiểu, tinh
dịch. Lượng pepsinogen trong máu tăng giảm theo một tỷ lệ nhất định với lượng
pepsinogen trong dịch vị.
Trọng lượng phân tử pepsinogen heo khoảng 42000 còn pepsin heo khoảng
35000Da. Theo Oke Khovitch thì trọng lượng phân tử pepsinogen = 42240Da; trọng
lượng phân tử của pepsin = 39930Da.
Khối lượng phân tử của pepsinogen A-1/2/3 và C-1/2 được xác định tương ứng là
-7-
41, 40, 40, 39 và 39 kDa xác định bằng phương pháp SDS-PAGE.
Pepsinogen có 3 loại A và 2 loại C gọi là pepsinogen A-1, A-2, A-3, C-1, C-2,
được kết tinh từ dạ múi khế dê trưởng thành. Mức độ liên quan của chúng trong dạ múi
khế của dạ dày tương ứng là 27,19, 14, 25 và 15%. Thành phần amino acid hoàn toàn
giống nhau giữa các isozymogen của các loại tương ứng nhưng khác nhau giữa 2 loại đặc
biệt ở Glx/Asx và Leu/Ile. Sự khác nhau này được đặc trưng cho các loại pepsinogen từ
các nguồn gốc động vật khác nhau.
Ở pH = 4.7 không có hoạt động đông tụ, ở giá trị pH<6 pepsinogen có tính acid
kém hơn pepsin. Pepsinpgen ổn định được trong môi trường trung tính và kiềm yếu
pH=7-9, nhưng sẽ bị phá hủy nếu pH>9 và bị hủy nếu ngâm trong dung dịch ethanol 50%
trong 24h, pepsinogen chỉ ổn định trong một thời gian ngắn với pH môi trường <6.
Pepsinogen bền trong dung dịch có pH thấp hơn 8.5. Trong vùng pH = 8.5 – 10.5
khi giữ trong một thời gian ngắn, sự biến tính kiềm của pepsinogen thuận nghịch, nhưng
giữ lâu trong môi trường kiềm thị biến tính không thuận nghịch. Về cơ chế, sự biến tính
kiềm của pepsinogen là sự phá vỡ một số liên kết hydro trong phân tử protein – enzyme.

Trong hỗn hợp nước – dung môi hữu cơ, phân tử pepsin và pepsinogen mất khả năng
hoạt hóa thành pepsin hoạt động
c. Sự hoạt hóa pepsinogen thành pepsin
Sự hoạt động của các enzyme thủy phân theo một trong hai con đường chủ yếu:
- Tự hoạt hóa (pepsin và trypsin…)
- Cần một hoặc vài loại ion kim loại chuyên biệt để hoạt hóa.
Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin tức là pepsinogen bất hoạt. Khi tiếp xúc
với môi trường acid tự nhiên của dạ dày hoặc chính pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hóa
thành pepsin. Quá trình hoạt hóa pepsinogen là quá trình thủy phân liên kết peptid giữa
acid glutamic 41 và isoleucin 42, giải phóng peptid kìm hãm, thành phần amino acid của
peptide kìm hãm này tương ứng với 41 amino acid của pepsinogen và phản ứng được
xúc tác bởi chính ion H
+
và cũng chính bởi pepsin.
Phần môn vị của dạ dày gồm những tế bào đỉnh vách có thể tiết ra acid HCl, dẫn
đến sự tiết pepsinogen và tự hoạt hóa thành pepsin trong dạ dày. Quá trình này xảy ra ở
pH<6. Khi trong môi trường có pH cao hơn, có thể xảy ra sự tái kết hợp ngược lại.
Từ môi trường trung tính chuyển sang môi trường acid, đầu tiên pepsinogen sẽ
chuyển thành pepsin ở pH = 5.1; 40
o
C. Ở pH = 4.1, mức độ chuyển hóa tăng gấp 10 lần.
-8-
Pepsin
4 pepde
Chất ức chế
Pepsin + chất ức chế
Phức hợp pepsin-chất ức chế
pH = 5.4
Pepsin-chất ức chế + 5 pepde
Pepsinogen phức hợp

pH = 5.4
Pepsin được tạo thành lại tiếp tục quá trình giải phóng peptid kìm hãm, chuyển
pepsinogen thành pepsin hoạt động. Vì vậy quá trình này mang tính chất của một quá
trình tự xúc tác. Sự hoạt hóa pepsinogen chỉ xảy ra trong môi trường acid có pH<5.6. Khi
pH>5.6 peptide kìm hãm lại có thể kết hợp thuận nghịch với pepsin tạo thành phức hợp
không hoạt động.
Việc hoạt hóa pepsinogen bao gồm sự loại bỏ khoảng 1% phân tử, như vậy phần
được loại bỏ đi là phải có tính kiềm trội hơn hẳn phần còn lại. Quá trình động học của sự
hoạt hóa này đã được nghiên cứu, bắt đầu bằng sự acid hóa hoặc bằng cách cộng thêm
pepsin vào môi trường. Ở pH = 5.4 quá trình này xảy ra theo cơ chế tự xúc tác. Kết quả
trọng lượng phân tử giảm 20%.
Toàn bộ quá trình tạo thành pepsin từ pepsinogen (heo) có thể biểu diễn như sau:
Trong quá trình hoạt hóa pepsinogen, bằng phương pháp chuẩn độ, người ta đã chỉ
ra rằng, một liên kết pepsin được tạo thành kèm theo với sự bẻ gãy 9 liên kết peptide. Sáu
peptide đã được sản sinh ra trong quá trình hoạt hóa gồm 5 peptide nhỏ và 1 peptide lớn:
-9-
- Peptide lớn nhất là một chất ức chế pepsin (trọng lượng phân tử 5000) ; ở
pH=5.4 chất ức chế này vẫn kết hợp với phân tử pepsin; do đó với những điều
kiện như vậy, quá trình này không thể thực hiện cơ chế tự xúc tác. Ở những pH
thấp hơn, chất ức chế có thể phân ly thuận nghịch ra khỏi phân tử enzyme.
Dưới tác dụng của pepsin, chất ức chế (inhibitor) được thủy phân thành 4
peptide nhỏ ở pH khoảng từ 5, mức độ phân hủy cao ở pH gần bằng 4.
- Cùng với chất ức chế này, quá trình hoạt hóa còn giải phóng ra 5 peptide nhỏ
khác như đã nói trên. Đây là những peptide trung tính, trung bình có khoảng 10
gốc amino acid; trọng lượng phân tử trung bình của cả 5 peptide vào khoảng
4000. Như vậy, cùng với sự thủy phân chất ức chế, toàn bộ quá trình hoạt hóa
đã được thực hiện với việc bẻ gãy 9 liên kết peptide.
Hình : Sự hoạt hóa pepsinogen thành pepsin
d. Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin
Ảnh hưởng của pH: pepsin là 1 protease acid điển hình, hoạt động ở vùng pH

acid từ 1 – 4, pH thích hợp của pepsin khoảng 1.5 – 2.4. Đối với mỗi cơ chất thì pH thích
hợp có thể thay đổi.
Cơ chất là hemoglobin thì pH tối ưu là 2.2
-10-
Cơ chất là albumin thì pH tối ưu là 1.5
Pepsin bền vững ở vùng pH rất acid, nó có độ bền tối đa ở pH=4 – 5 nhưng trong
vùng pH này hoạt lực của enzyme rất thấp. từ pH>5.5 pepsin không hoạt động vì có sự
biến tính của protein enzyme mà cụ thể là phá vỡ một số liên kết hydro trong phân tử làm
cho cấu trúc của enzyme bị biến đổi. Ở pH quá thấp thì pepsin xảy ra hiện tượng tự phân.
Pepsin đã bị vô hoạt trong môi trường kiềm có thể phục hồi hoạt tính một phần khi đưa
pH về vùng thích hợp với nó. Pepsin có điểm đẳng điện pI từ 1 – 1.4. Pepsin của heo có
điểm đẳng điện pI là 1.
Ảnh hưởng pH lên các loại pepsin khác nhau, như pepsin B bền ở pH=6.9 và 25
0
C
và cũng điều kiện này pepsin C sẽ bền hơn pepsin A. còn ở pH=8.5 pepsin C bị vô hoạt
nhanh chóng, pepsin D thì không bền ở pH>6. Đối với pepsin có nguồn gốc khác nhau
hay các loại pepsin (A, B,C, D) có cùng nguồn gốc, pH tối thích cho chúng hoạt động là
khác nhau. Ví dụ: pepsin A và C tách chiết từ dạ dày bê có hoạt tính thủy phân Hb cao
nhất ở pH=2-3, pepsin A-2/3 vẫn duy trì hoạt tính ở vùng có pH>3 nhưng pepsin A-1 thì
không. Tương tự pepsin, pepsinogen khác nhau chịu ảnh hưởng của pH môi trường khác
nhau.
Pepsin dê A và C hoạt động ở pH thấp tương tự những enzyme từ nguồn động vật
khác. pH thích hợp khoảng 2 đối với pepsin A và khoảng 3 đối với pepsin C. Những hoạt
tính của pepsin A chỉ bằng một nửa pepsin C. pH phụ thuộc hoạt tính pepsin A-2 và A-3
hoàn toàn giống nhau nhưng khác với pepsin A-1. Hoạt tính của pepsin A-2 và A-3 lớn
hơn A-1, đặc biệt khoảng pH 3-4. Hoạt tính cao nhất của pepsin A heo tương tự như
pepsin C của dê và cao gấp 2 lần pepsin A dê.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: đa số enzyme hoạt động tốt ở nhiệt độ 30-40
o

C, một số
enzyme chịu nhiệt có thể hoạt động ở nhiệt độ cao hơn tới 70
o
C, khi nhiệt độ lên tới 90
o
C
thì hầu như tất cả các enzyme đều ngưng hoạt động.
Pepsin là một enzyme hoạt động ở nhiệt độ khá cao. Nhiệt độ thích hợp tối ưu
khoảng từ 40-50
o
C. Ở 70
o
C, pepsin mất khả năng tiêu đạm. Tốc độ xúc tác phản ứng thủy
phân của pepsin không cao bằng các protease khác, nhưng độ bền nhiệt của pepsin cao
hơn, nhất là khi cơ chất có mặt một số ion kim loại đặc biệt như Ca
2+
.
Ảnh hưởng của các loại muối và các dung môi hữu cơ
Tùy theo bản chất hóa học của muối mà ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của
pepsin. Ví dụ, các muối trung tính như NaCl, KBr, MgSO
4
ít tác động trên pepsin, chúng
chỉ ức chế pepsin ở liều cao.
Các chất hữu cơ kiềm hay dung dịch muối kiềm như NaHCO
3
làm chậm sự pepton
hóa của pepsin. Trong sự pepton hóa, HCl là acid gây ra sự thủy phân mạnh nhất, kế đó
là HNO
3
, HBr, H

2
SO
4
, H
3
PO
4
, các acid lactic, formic,… gây tác động kém hơn.
-11-
Các muối kim loại nặng như Pb, Hg, Pt ở nồng độ rất thấp vẫn có thể gây kết tủa
và làm biến tính enzyme. Nguyên nhân là do muối kim loại nặng tạo nên các phức hệ với
các nhóm quan trọng của protein-enzyme, làm thay đổi cấu trúc của protein dẫn tới sự
biến tính enzyme.
Các dung môi hữu cơ ít phân cực, cũng như các chất hoạt động bề mặt có tác dụng
phá vỡ cấu trúc bậc III và làm tăng độ xoắn của mạch polypeptid trong phân tử pepsin, do
đó làm giảm hoạt tính của pepsin. Một số nghiên cứu cho thấy pepsin bị bất hoạt bởi
sodium-lauryl-sulfonate hay bởi nitric acid.
Ảnh hưởng của chất sát khuẩn: các chất sát khuẩn như HCN, salisilic acid,
cloroform… với lượng nhỏ thì không ảnh hưởng đáng kể đến pepsin. Nhưng khi với liều
cao, chúng làm giảm đáng kể hoạt tính của pepsin.
Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: tất cả các chất gây biến tính protein đều là
những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzyme nói chung và pepsin nói riêng. Ngoài ra
có nhiều chất không làm biến tính protein enzyme nhưng vẫn làm giảm hoạt độ xúc tác
do cơ chế kìm hãm cạnh tranh và kìm hãm không cạnh tranh…
Với chất kìm hãm p-bromophenacyl bromide, hoạt tính của protease nói chung bị
phá hủy từ 70-80%. Tương tự hợp chất α-diazo-p-bromoacetophenone cũng làm vô hoạt
hoàn toàn pepsin. Nồng độ vô hoạt của 2 chất trên là 1mol/1 mol pepsin. Còn hợp chất
diphenyldiazomethane (2 mol ức chế 1 mol enzyme) làm giảm 50% hoạt tính của pepsin
khi tác dụng trên cơ chất Hb, các chất này cũng ngăn cản sự hoạt hóa của pepsinogen. Sự
vô hoạt cũng xảy ra khi có ion Cu

2+
trong các hợp chất béo diazocarbonyl, những hợp
chất này có cấu trúc tương tự các cơ chất của pepsin. Ví dụ L-1-diazo-4-phenyl-3-
tosylamidobutanone sẽ làm vô hoạt hoàn toàn pepsin khi có mặt của ion Cu
2+
với nồng độ
1 mol/1 mol pepsin nhưng không làm biến tính nó. Benzilloxycarbon-L-
phenylalanyldiazomethane cũng làm ức chế pepsin mà không cần sự có mặt của Cu
2+
.
Ngoài ra pepsin cũng bị ức chế bởi pepstatin nhưng tùy mức độ, pepsin A bị vô
hoạt hoàn toàn khi nồng độ pepstatin khoảng 1 mol/ 1 mol pepsin A, còn pepsin C cần
phải 100 mol pepstatin/1 mol pepsin C để vô hoạt hoàn toàn.
Sự khác nhau về tính nhạy cảm của pepsin A và pepsin C đối với pepstatin thì
tương tự nhau ở các loài. Sự khác nhau này giúp phân biệt pepsin A và C.
2. Dạ dày heo
a. Cấu trúc, chức năng
-12-
Hình : Mô hình dạ dày heo
Dạ dày là một đoạn phình ra của ống tiêu hoá có tác dụng: chứa đựng thức ăn,
nhào trộn thức ăn để thấm qua dịch vị. Thức ăn sẽ chịu sự tiêu hoá của các enzyme tiêu
hoá chứa trong dịch vị, chuẩn bị cho giai đoạn chính của việc tiêu hoá ở ruột non.
Chức năng cơ học:
- Chứa thức ăn.
- Co bóp, trộn thức ăn với dịch vị tạo thành dịch trấp.
- Đưa dịch trấp xuống ruột non với tốc độ thích hợp.
Cấu tạo: 5 vùng
- Thực quản nhỏ
- Manh nang (chứa 1 số loại vi sinh vật)
- Thượng vị  tuyến nhầy

- Thân vị
- Hạ vị
b. Sự tiêu hóa thức ăn ở dạ dày heo
-13-
Hình: Hệ tiêu hóa ở heo
Đặc điểm tiêu hóa ở dạ dày heo trưởng thành
* Đặc điểm phân tiết
- Tiết liên tục (khi ăn tăng tiết, sáng > chiều)
- Lượng dịch vị tùy thuộc vào thức ăn:
Thức ăn rang > ngâm,
Thức ăn sống > chín
Thức ăn ủ men > không ủ
* Nhu động yếu, xếp lớp  pH các lớp khác nhau  hoạt tính men khác nhau
Quá trình tiêu hóa
- Protein: (xảy ra ở sát vách thân vị, hạ vị )
- Glucid : amilase từ nước bọt, thức ăn (manh nang, thượng vị và vùng giữa)
- Lipid : lipase không đáng kể (pH thích hợp = 7 – 8)
VSV manh nang, thượng vị (lợn con chưa có) phân giải glucid, tinh bột, cellulose
tạo glucose  axit hữu cơ (lactic 48%, acetic 31%) vào máu.
VSV phân giải protein và sử dụng ure tạo a.a vsv  giá trị dinh dưỡng cao
c. Enzyme pepsin trong dạ dày heo
Pepsin hình thành từ màng nhầy của dạ dày, phân bố trên các phần khác nhau của
dạ dày ở dạng tiền pepsin (pepsinogen) nhưng tập trung chủ yếu ở phần đáy mỏng của dạ
dày(75%).
-14-
II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME PEPSIN
1. Nguyên liệu thu nhận pepsin
Màng nhầy dạ dày heo.
Hình: dạ dày heo
2. Các phương pháp thu nhận pepsin

a. Thu nhận dung dịch pepsin
Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhầy dạ dày là sự phối hợp
của ba quá trình: phá vỡ tế bào, hoạt hóa và chiết tách enzyme.
- Sản xuất pepsin hiện nay có hai phương pháp là phương pháp chiết và
tự phân, đều dựa trên nguyên tắc: pepsin được giải phóng từ màng nhầy
dạ dày của động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng (theo
Konne và Muraviep, 1960; Covalines và cộng sự, 1966) hay nhờ sự tự
phân trong môi trường acid (theo Covalenco, 1966).
- Khi so sánh sự thu nhận pepsin của hai phương pháp cho thấy phương
pháp tự phân cho hiệu suất thu enzyme cao hơn phương pháp chiết là 5
– 7 lần (theo Teply và cộng sự,1980). Nguyên nhân là do phương pháp
tự phân có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào. Mặt khác,
phương pháp tự phân còn có ưu điểm là cùng với pepsin, ta còn thu
đựơc pepton, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu protein của dạ dày
trong sản xuất.
- Muốn pepsin có hoạt tính cao thì phải cách ly từ niêm mạc dạ dày lấy
từ động vật mới mổ hoặc có thể bảo quản niêm mạc ở nhiệt độ lạnh 0-
240C trong thời gian ngắn.
-15-
•Phương pháp chiết:
Dạ dày rửa sạch, tách màng nhầy, nghiền, ngâm vào nước có 5% butanol
hay glyceryl, có cloroform để tránh nhiễm khuẩn sau chế hóa bằng
ethanol để pepsin kết tủa. Thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường.
•Phương pháp tự phân:
Niêm mạc dạ dày bảo quản ở nhiệt độ lạnh hay vừa tách ra khỏi heo mới
mổ, xay nhỏ, dùng HCl hay H3PO4, H2SO4 với nồng độ thích hợp để
chiết xuất và hoạt hóa pepsinogen thành pepsin.
Theo nhiều thực nghiệm, việc dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường sẽ
cho hoạt tính cao nhất. Nguyên nhân là do HCl là acid vô cơ quan trọng
có trong thành phần dịch vị dạ dày động vật, trong cơ thể sống

pepsinogen được hoạt hóa thành pepsin nhờ HCl dịch vị.
Thời gian tự phân: 48 giờ ở 40 – 420C.
Ngoài ra một số tác giả đã sử dụng nguyên lý hấp thụ enzyme trên một
chất kết tủa. Cho hình thành chất kết tủa phosphattricalci từ niêm mạc dạ
dày heo (ngâm nước) có mặt H3PO4. Sau đó chất kết tủa được hòa tan
bằng HCl và dung dịch thu được mang đi thẩm tích (dialyz). Dung dịch
pepsin thô thu được sau khi xử lý bằng ester sẽ thu lại chất cặn có thành
phần cấu tạo là pepsin sơ lọc (phương pháp Bruches)
b. Các phương pháp thu pepsin thô từ dịch chiết
•Phương pháp tủa.
 Phương pháp tủa bằng muối (diêm tích): Các muối trung tính ở nồng độ
cao có thể kết tủa thuận nghịch các enzyme mà không gây biến tính hay
giảm hoạt tính enzyme. Các protein khác nhau sẽ có tính hòa tan khác
nhau trong dung dịch. Do đó khi tăng dần nồng độ muối, các protein
riêng biệt sẽ kết tủa theo các trình tự khác nhau.
Người ta thường dùng các muối trung tính khác nhau như
(NH¬4)2SO4, NaCl… ở nồng độ gần bão hòa để làm tủa pepsin. Ly
tâm lấy tủa, trộn với tá dược như lactose, glucose hay tinh bột là các
chất phụ gia có tính chất ổn định enzyme, đồng thời rút ngắn thời gian
sấy, hạn chế sự giảm hoạt tính enzyme trong khi sấy, thường sấy ở
nhiệt độ ≤ 450C hay sấy kèm chân không.
 Phương pháp tủa bằng cồn hay dung môi hữu cơ: Với dung dịch pepsin
thô được cô dưới áp suất thấp, ở nhiệt độ ≤ 450C đến khi chỉ còn lại 1/8
-16-
so với thể tích ban đầu thì đem tủa với cồn 950C hay aceton (tỷ lệ 1:3)
(Có thể tủa bằng cồn cao độ hay các dung môi hữu cơ thích hợp như:
metylic, etylic, aceton ở nhiệt độ gần 0 – 30C). Sau đó ly tâm, sấy tủa ở
nhiệt độ ≤ 450C. Phương pháp tủa cần đựơc tiến hành ở nhiệt độ thấp 0
– 50C để đảm bảo hoạt tính của enzym.
•Phương pháp hấp phụ

Có thể dùng một số chất hấp phụ đặc hiệu để hấp phụ enzyme. Cơ sở
khoa học của phương pháp này là cho enzyme hấp phụ chọn lọc lên các
chất hấp phụ như: caolin, oxit sắt, than… Sau đó, dùng các chất giải hấp
phụ đặc biệt để tách enzyme ra khỏi chất hấp phụ và thu nhận enzyme
mong muốn.
Ví dụ: Phương pháp hấp phụ Pepsin. Bổ sung NH4OH 0.1N vào dung
dịch pepsin thô cho đến phản ứng kiềm nhẹ, rồi thêm hỗn hợp photphat
gồm: dung dịch CaCl2 10%, dung dịch dinatriphotphat 5.5% với tỷ lệ
1:1. Pepsin được kết tủa từ từ nhờ dung dịch NH4OH và được hấp phụ
trên mặt mỏng của tricalciphosphat và cùng với tricalciphosphat lắng
xuống. Để sự nhả hấp phụ không xảy ra, người ta cần tiếp tục cho
NH4OH để giữ môi trường phản ứng cần thiết, lọc lấy tủa và rửa với
nước cất. Tiếp theo, lấy tủa xử lý với dung dịch oxalic acid 4%,
tricalciphosphat sẽ chuyển thành calcioxalat không tan, pepsin tan trong
dung dịch, lọc lấy dung dịch pepsin. Dùng NH4OH để điều chỉnh đến
pH = 2.4 – 2.6. Sau đó, thêm 5 thể tích hỗn hợp cồn: ete (tỷ lệ 1:1) để tủa
pepsin. Kết tủa thu đựơc rửa với cồn, rồi với ete và sấy khô ở nhiệt độ ≤
45
0
C.
•Phương pháp cô dưới áp suất thấp để được dung dịch pepsin đậm đặc
Với phương pháp này người ta tiến hành ở nhiệt độ ≤ 450C, áp suất thấp
để enzyme không bị giảm hoạt tính, tạo dung dịch pepsin thô sẽ đậm
đặc, sau đó được trộn với tá dược như lactose, tinh bột, sấy nhẹ tạo dạng
bột khô.
Ví dụ: Pajagopalanetal thực hiện xử lý dạ dày heo bằng cách tách màng
nhày và trữ ở trạng thái đông, rồi đưa đến pH = 2.7 – 2.9 bằng HCl và
được ủ ở 500C trong vài giờ. Dịch thủy phân được trộn đều và để yên
phần nhẹ hơn sẽ nổi lên trên bề mặt, để lạnh 40C và cô đặc dưới áp suất
thấp, enzyme bị tủa bởi alcohol và đựơc tách ra. Sau khi pepsin bị tủa

bằng alcohol, đem lọc và làm khô.
Các phương pháp chiết tách trên đều cho phép thu chế phẩm pepsin chưa tinh
-17-
khiết, có lẫn protein lạ và các protease khác. Pepsin này hoàn toàn có thể sử
dụng điều trị trong y học hay trong công nghiệp.
Quy trình thu nhận enzyme từ dạ dày heo ( Payeba và cộng sự)
-18-
Dạ dày
Tách màng nhầy
Tự phân
Ly tâm
10-15 phút, 5000-6000 vòng/phút
Bảo quản
( ở nhiệt độ lạnh)
Sấy đông khô
Pepsin thô
Bã
Kết tủa
Xay nhuyễn
Lọc
NaCl 25%
Chất độn
-19-
Giải tích quy trình:
1. Nguyên liệu: dạ dày heo vừa mới giết mổ để thu được pepsin có họat tính cao,
bảo quản ở nhiệt độ lạnh đông (0- 3
0
C) trong một thời gian ngắn trước khi thực
hiện.
2. Tách màng nhầy: rửa sạch bên ngòai trước khi lộn ngược dạ dày, rửa thật nhẹ

tay màng nhày bằng nước lạnh chỉ để lọai bỏ thức ăn thừa không làm tổn thất
lớp màng nhày chứa pepsin và tiến hành bóc màng nhầy.
3. Xay nhuyễn: Màng nhày dạ dày sau khi tách, cắt nhỏ và xay nhuyễn đồng nhất.
Cân chính xác một lượng nhất định màng nhầy.
4. Tự phân: Màng nhầy sau khi xay nhỏ sẽ được trộn với HCl 0,5% với tỷ lệ 1:2
theo khối lượng, nhiệt độ 40-500C, khuấy đều; thời gian 24-28 giờ.
5. Lọc: vớt bỏ lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua lớp vải mùn thu dung dịch
enzym.
6. Kết tủa enzyme: kết tủa bằng NaCl nồng độ bão hòa 25%. Cho muối từ từ,
khuấy nhẹ cho đến khi dung dịch bão hòa, để yên dịch thủy phân 30 phút. Có
thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulphat, cồn 85%, aceton, izopropanol,
polyetylenglycol – PEG 6000.
Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ sinh ra một nhiệt lượng lớn, có
thể làm mất hoạt tính enzym. Do đó, dung dịch sau tự phân đựơc lọc cùng dung
môi đã làm lạnh và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự
tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5 – 10 phút, nhiệt độ ≤ 50C.
Tác nhân PEG 6000: (tương tự như muối vô cơ). Cho PEG dạng rắn cho từ từ
vào dung dịch enzym và khuấy liên tục cho tan hết.
7. Ly tâm: Hỗn hợp dung dịch sau khi để yên đem ly tâm 10-15 phút với tốc độ
5000-6000
vòng/phút.
8. Sấy đông khô:
-20-
Nguyên tắc cuả phương pháp sấy đông khô là nước ra khỏi nguyên liệu bằng
cách chuyển từ trạng thái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không qua giai đọan lỏng
(nước). Nhờ vậy nước được đưa ra khỏi nguyên liệu mà không làm hỏng nguyên liệu.
Quá trình sấy đông khô gồm 3 giai đọan:
-GĐ 1- làm lạnh: đây là giai đọan quan trọng làm lạnh nguyên liệu xuống điểm
eutecti- điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng và pha rắn cùng tồn tại-đảm bảo
cho quá trình thăng hoa xảy ra ở giai đọan kế tiếp.

-GĐ 2- sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống -40
0
C để nước
trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh.
-GĐ 3- sấy bậc 2: giai đọan này có nhiệt độ sấy cao hơn giai đọan sấy bậc một
để giúp cho các nguyên liệu giữ nguyên các tính chất hóa lý. Giai đọan này áp suất
chân không tiếp tục thúc đẩy quá trình thăng hoa.
* Phương pháp này giúp enzym giữ nguyên được tính chất hóa lý và có thể bảo
quản trong thời gian dài. Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzym hư hỏng mất đi tính
chất ban đầu.
* Để tránh bị mất hoạt tính ngừơi ta trộn thêm vào chế phẩm enzym các chất
độn như tinh bột hòa tan, maltose dextrin… trong quá trình sấy.
9. Bảo quản:
Chế phẩm pepsin thô cần được bảo quản ở điều kiện khô, kín, lạnh, tránh
tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng và các tác nhân lý, hóa học có ảnh hưởng đến
họat tính của enzym.
Phương pháp tinh sạch pepsin
″ Phương pháp kết tinh pepsin của Northrop[/i]:
-21-
Northrop đã bắt đầu từ dung dịch pepsin tinh sạch của Parke và Davis, lấy
dung dịch này cho kết tủa bằng dung dịch sulfuric với MgSO4 bán bão hào,
chất kết tủa được rửa sạch với dung dịch MgSO4, sau đó hòa tan bằng dung
dịch NaOH N/2, rồi lại cho kết tủa lần 2 bằng cách gia thêm H2SO4 N/2
pha loãng trong nước 450C, sau một lần làm lạnh nữa, tinh thể pepsin xuất
hiện và phải qua một loạt các quy trình hòa tan trong kiềm và tái kết tủa
trong dung dịch acid sẽ điều chế được tinh thể pepsin hoàn toàn tinh khiết
và hoạt tính cao.
″ Phương pháp lọc qua gel sephadex:
Nguyên tắc
Khi cho một hỗn hợp nhiều chất chảy qua cột chứa gel sephadex đã trương

nước, những phân tử nào lớn sẽ không chui vào trong hạt gel đựơc mà chỉ di
động ở ngoài gel, do đó di chuyển ra khỏi cột sephadex nhanh. Còn những
phần tử nhỏ hơn chui vào trong các hạt với mức độ khác nhau tùy theo kích
thước của chúng. Do đó những kỹ thuật này dùng để tách các chất có phân
tử lượng khác nhau, phân tử lượng càng lớn ra khỏi cột càng nhanh, phân tử
lượng càng nhỏ ra càng chậm.
Hóa chất và dụng cụ:
Tùy theo đặc điểm cột và loại gel sephadex dùng trong thí nghiệm mà ta
ngâm một lượng gel sephadex thích hợp.
Ở đây dùng 1 buret có đường kính 1 cm, cao 35cm và gel sepphadex G-100,
cân 1.2g gel ngâm trong 1 lượng thừa dung dịch NaNO3 0.028 trong 72 giờ
để gel trương nở hoàn toàn. Gel sau khi ngâm NaNO¬3 đựơc rửa sạch bằng
nước cất sau đó nhồi vào cột, hay dùng gel sepphadex G-75.
Dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 2.2. Cách pha đệm p.H 2.2: X: dung dịch
acid citric 0.1M (hòa tan 21,008g acid citric trong 1 lít nứơc cất), Y: dung
dịch dianatri hydrophotphat 0.2M (hòa tan 35.6 g Na2HPO4.2H2O hay
71.7g Na2HPO4.12H2O trong 1 lít nứơc cất). Pha 98 ml dung dịch X và 2
-22-
ml dung dịch Y, ta có dung dịch đệm pH = 2.2. Chọn cột có Φ = 1.8 cm,
chiều cao h = 80cm.
Kỹ thuật nhồi cột
Cột sau khi rửa sạch (rửa cột để đổ gel): cột đựơc rửa sạch bằng HNO3 50%
rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng aceton, đem sấy khô.
Rửa các dụng cụ khác: các ống nghiệm được rửa sạch rồi ngâm vào dung
dịch sulfo cromic trong một ngày, rửa sạch lại, tráng nước cất rồi sấy khô.
Tiến hành nhồi cột với G- 75 đã trương nở hoàn toàn: gel được đưa vào cột
cùng với dung dịch đệm qua phễu một cách từ từ và tránh tạo bọt khí và
phân lớp.
Sau khi đã cho một ít gel lắng thành lớp cao khoảng 5 cm mới mở khóa cho
dung dịch đệm chảy ra từ từ. Sau đó tiếp tục cho gel vào cột cho đến khi đạt

độ cao cần thiết. Bề mặt dung dịch bên trên của cột phải phẳng, trên mặt gel
luôn có một lớp dung dịch đệm cao khoảng 2 cm để gel không bị khô.
Khóa ống mao dẫn lại, để cột gel ổn định trong 3 giờ, sau đó rửa cột bằng
dung dịch đệm p H = 2.2 khoảng 24 giờ ( thể tích dung dịch đệm dùng để
rửa gấp khoảng 3 lần thể tích cột).
Đưa mẫu vào cột
Đem kết tủa 50 ml dung dịch enzym thu đựơc sau quá trình tự phân đã qua
lọc bằng 283 ml cồn 85%. Sau đó ly tâm, kết tủa đựơc hòa tan lại bằng 50
ml dung dịch đệm pH 2.2 ta thu được dung dịch A.
Hút 3 ml dung dịch A, thêm vào khoảng 2 ml dung dịch đệm pH 2.2, đem ly
tâm bỏ cặn.
Ngưng khóa dòng dung dịch đệm chảy qua cột, khi lớp dung dịch đệm vừa
cạn đến mặt gel thì cho mẫu vào cột, lượng mẫu cho vào cột là 5 ml (từ 1 –
5% thể tích cột.). Sau khi cho mẫu vào cột hết thì tiếp tục cho dung dịch
đệm chảy qua cột.
Thu mẫu qua cột
-23-
Sau khi mẫu đã vào hết trong cột, bắt đầu hứng dung dịch chảy qua cột. Số
phân đoạn làn ống (ví dụ khoảng 30 ống), mỗi phân đoạn ta thu khoảng 4
ml, các phân đoạn thu được, đem đo mật độ quang OD ở bước sóng 280nm.
Vẽ đồ thi biểu diễn mối quan hệ giữa từng phân đoạn và giá trị OD tương
ứng, ghi nhận các peak chính được tạo thành. Sau đó xác định hoạt tính
pepsin của các ống tương ứng với peak chính. Theo kết quả tính hiệu suất
về hoạt tính enzym và hàm lượng protein thu được qua lọc gel.
III.ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM ENZYME
1. Khảo sát hàm lượng protein theo phương pháp Bradford:
• Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự đổi màu khi cho Coomassie Brilliant Blue-G250
liên kết với protein trong môi trường acid. Thuốc nhuộm này sẽ tạo với protein, tương
tác với các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện dương trên phân tử protein thành

một phức chất màu xanh, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 595nm. Cường độ màu
này tỉ lệ thuận với hàm lượng protein, nên bằng phương pháp so màu có thể xác định
được lượng protein.
Ưu điểm: đây là phương pháp có độ nhạy cao, chình xác vài μg, hoá chất đơn
giản, ít tốn kém.
Xác định hàm lượng protein có trong mẫu:
10
3−
××
−∆
=
V
F
a
bOD
P
PU
Xác định hàm lượng prtein tổng trong mẫu enzyme:
10
3−
×××=
m
m
V
P
enzyme
mau
mau
t
P

P: hàm lượng protein của mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein (mg/mL)
∆OD: hiệu suất mật độ quang của mẫu enzyme đo được ở λ = 605 nm (A)
-24-
F: độ pha loãng mẫu enzyme
V
pu
: thể tích mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein
V
mau
: thể tích mẫu đich enzyme (mL)
m
mau
: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)
m
enzyme
: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)
P
t
: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg protein)
3. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến
Mục đích: khảo sát hoạt lực proteolytic để biết được khả năng thủy phân liên kết
peptide.
Nguyên tắc: Cho protease tác dụng với cơ chất casein hoặc hemoglobin, sau đó kết tủa
protein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm được tạo thành bằng phản ứng màu với
thuốc thử Folin-Ciocalteu. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với
sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme.
Hoạt lực proteolytic của enzyme trong 1mL
t
Vmoltyro
PU

H
×
=
sin
µ
(UI/mL)
Tổng hoạt lực proteolytic của mẫu enzyme
10
3−
×××=
m
m
V
H
enzyme
mau
mau
t
H
(UI)
Hoạt lực proteolytic riêng của enzyme
P
H
H
t
t
R
=
(UI/mg protein)
V

PU
: thể tích tòan bộ hỗn hợp phản ứng
t: thời gian thủy phân (phút)
H
t
: tổng hoạt proteolytic của mẫu enzyme (UI)
-25-