Luận văn : PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR part 3 pptx

37
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng
Hoa lan cũng giống nhƣ các loại cây cảnh khác thƣờng xuyên bị sâu bệnh gây hại
làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng bình thƣờng, năng suất, phẩm chất trong đó có màu
sắc, hƣơng vị, độ tƣơi bền dẫn đến làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng
hóa và xuất khẩu trên thị trƣờng trong và ngoài nƣớc, thậm chí còn làm chết cây. Hiện
nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết cây địa lan đã gây thiệt hại rất lớn cho ngƣời
nông dân trồng địa lan tại TP. Đà Lạt. Do đó, việc tiến hành điều tra tình hình bệnh hại và
xác định tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra có ý nghĩa quan trọng trong công
tác bảo vệ thực vật.
4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan: Qua điều tra cho thấy một số bệnh thƣờng
xuất hiện trên địa lan với triệu chứng bệnh nhƣ sau:
Trên chồi địa lan

(a)
(b)
Hình 4.1.Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan.
a. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu vàng.
b. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu đen.


38
Trên giả hành


















Trên phát hoa

(a)
(b)
(c)
(d)
Hình 4.2. Các triệu chứng bệnh trên giả hành.
a. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng thối nâu vàng. b. Giả hành đƣợc
cắt dọc với triệu chứng thối nâu đen. c. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu
chứng khô giả hành. d. Chậu địa lan với giả hành và chồi bệnh.
(a)
(b)
Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh trên phát hoa.
a. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Phát hoa địa
lan với triệu chứng thối nâu đen.


39
4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu
điều tra tháng 10 năm 2005)


Vƣờn điều tra
Tổng số chậu
Số chậu bệnh

do vi khuẩn
Số chậu bệnh
do virus
Số chậu bệnh
do nấm
1
200
60
100
0
2
15.000
3.000
750
3.000
3
1.000
500
100
0
4
7.000
2.800
210
0
5
2.000
1.400
400
800

6
150
0
15
8
7
150
60
15
15
8
20.000
0
0
600
9
300
0
0
0
10
2.500
0
1.750
1.000
11
1.000
800
0
200

12
400
160
80
120
13
400
80
40
100
14
450
45
405
135
15
2.000
0
1.200
200
16
3.500
2.450
350
350
17
500
150
50
50

18
1.000
100
0
100
Tổng cộng
57.550
11.605
5.465
6.678

Qua đánh giá kết quả từ bảng 4.1, tỉ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra nhƣ sau: bệnh do
vi khuẩn: 20,17%, bệnh do virus: 9,5%,bệnh do nấm: 11,6%.

Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra.


40

Bệnh thối làm chết cây địa lan đang ảnh hƣởng rất nghiêm trọng và gây thiệt hại
lớn cho ngƣời trồng lan. Qua điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn gây ra cao
hơn hẳn so với tỉ lệ nhiễm bệnh do nấm và virus gây ra qua các vƣờn điều tra (bảng 4.1 và
đồ thị 4.1), có vƣờn không bị nhiễm bệnh hoặc chỉ bị nhiễm bệnh do hai tác nhân gây ra.
Nhƣ thế, không thể kết luận đƣợc vƣờn đó là hoàn toàn sạch bệnh mà nó có thể bị bệnh
tiềm ẩn, chƣa biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân
góp phần làm cho bệnh lây lan và phát triển mạnh. Ngoài các yếu tố tự nhiên thì kỹ thuật
trồng và chăm sóc của nông dân cũng ảnh hƣởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh.
Họ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chƣa có quy trình kỹ thuật hợp lý.
4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn
Theo Nguyễn Văn Minh (2005), qua điều tra và phỏng vấn ở những vƣờn địa lan
có bệnh chết cây xuất hiện và vƣờn không có bệnh, cho thấy nhận thức của các chủ vƣờn
về bệnh này còn kém. Phần lớn các chủ vƣờn đều nhận biết đƣợc triệu chứng bệnh và
điều kiện giúp cho bệnh phát triển mạnh, nhƣng đa số các hộ trồng chƣa phân biệt đƣợc
bệnh có bao nhiêu triệu chứng và nguyên nhân gây ra.
Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra.
0
5
10
15
20
25
Tỉ lệ nhiễm bệnh (%)
Vi khuẩn Virus Nấm
Tác nhân gây bệnh

41
Kết quả điều tra cho thấy, bệnh do vi khuẩn gây ra chiếm tỉ lệ cao hơn cả. Trƣớc
tình hình đó, chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu chồi địa lan có triệu chứng bệnh do vi

khuẩn gây ra và tiến hành phân lập. Kết quả là phân lập đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu
khuẩn lạc rất đặc trƣng trên môi trƣờng PGA (Hình 4.4):
a. Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
b. Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
Erwinia carotovora subsp. carotovora là vi khuẩn gram âm. Cho nên chúng tôi
tiến hành kiểm tra gram âm, gram dƣơng để loại bỏ những dòng vi khuẩn gram dƣơng
bằng cách sử dụng KOH 3%. Tuy nhiên, cách kiểm tra này cũng không cho kết quả thật
chính xác. Có thể bị nhầm lẫn giữa gram âm và gram dƣơng đối với những vi khuẩn có
thời gian nuôi lâu, nó cũng tạo nhớt khi huyền phù trong KOH.












4.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC
4.3.1. Trên môi trƣờng KB
Môi trƣờng KB đƣợc dùng để xem sự phát sáng của vi khuẩn khi chiếu dƣới tia
UV. Theo Fiori và Schiaffino (2003), vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora
không phát sáng trên môi trƣờng KB. Do đó, chúng tôi đã chọn lọc đƣợc những dòng
không phát sáng để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình 4.5.1).
Hình 4.4. Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh trên môi trƣờng PGA.
a. Khuẩn lạc màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
b. Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.

(a)
(b)

42
4.3.2. Trên môi trƣờng YDC
Theo Seo và ctv (2001), khi thử nghiệm sinh lý, sinh hóa trên 87 dòng vi khuẩn
Erwinia carotovora subsp. carotovora thì thấy trong 22 dòng Thái Lan có 5 dòng sản sinh
sắc tố vàng trên môi trƣờng YDC, 23 dòng Hàn Quốc và 24 dòng Nhật Bản đều không
sản sinh sắc tố vàng trên môi trƣờng YDC. Nhƣ vậy, giữa các dòng vi khuẩn Erwinia
carotovora subsp. carotovora có sự đa dạng về đặc tính kiểu hình phenotyp, do chúng có
phổ ký chủ và sự phân bố địa lý rộng.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn lên môi trƣờng YDC để
xem sự sản sinh sắc tố vàng và hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn. Sau 24 giờ quan sát thấy
trên môi trƣờng YDC, khuẩn lạc vi khuẩn có màu rất đặc trƣng (Hình 4.5.2).
- Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
- Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.

a
Hình 4.5.2. Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC
sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng).
b


a. Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng
trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép
khuẩn lạc tròn nhẵn.
b. Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng
đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép
khuẩn lạc tròn nhẵn.
a
a
b
a a
Hình 4.5.1. Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng KB chiếu dƣới tia UV
sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng).

a. Khuẩn lạc vi khuẩn
phát sáng khi chiếu dƣới
tia UV, tạo thành quầng
sáng xung quanh.
b. Khuẩn lạc vi khuẩn
không phát sáng khi
chiếu dƣới tia UV.
b

a

43
4.4. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây, lá địa lan
Từ nguồn vi khuẩn cấy lên môi trƣờng YDC, chúng tôi tiến hành chủng lên củ
khoai tây và lá địa lan.
4.4.1. Trên củ khoai tây: sau 48 giờ chủng bệnh, quan sát thấy triệu chứng bệnh biểu
hiện nhƣ sau:


















Sau 48 giờ chủng vi khuẩn, quan sát thấy 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây hại mạnh:
EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06-17, EC06-18 và
EC06-19 với các triệu chứng nhƣ hình 4.6.1. Ngoài ra, các dòng còn lại khả năng gây
bệnh yếu hoặc không gây bệnh. Điều này có thể do phân lập, cấy chuyền nhiều lần nên

độc tính của vi khuẩn bị giảm.
(a)
(b)
(c)
(d)
Hình 4.6.1. Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây chủng vi khuẩn
sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng).
a. Vết bệnh lõm xuống, màu vàng kem, nhày. b. Vết bệnh lõm xuống, màu nâu đen, nhày.
c. Vết bệnh có dịch nhày kèm theo bọt màu trắng. d. Vết bệnh hơi lõm xuống, nhày, xung
quanh vết bệnh có đƣờng viền màu nâu nhạt.



44
4.4.2. Trên lá địa lan: Sau 10 ngày chủng bệnh, quan sát thấy hầu nhƣ các dòng vi khuẩn
không gây bệnh trên lá địa lan. Chỉ duy nhất có dòng EC06-8 gây bệnh. Vết bệnh có màu
vàng xanh, lan theo chiều rộng của phiến lá. Ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe có viền
màu nâu đen (Hình 4.6.2).










Sau đó, chúng tôi đã tiến hành phân lập lại từ lá địa lan chủng bệnh vi khuẩn có biểu hiện
bệnh. Kết quả thu nhận đƣợc vi khuẩn có hình thái, màu sắc khuẩn lạc giống với ban đầu

(Hình 4.6.3).











4.5. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn
DNA là vật chất cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Do đó, chúng ta phải
ly trích đƣợc DNA tách khỏi tế bào và các chất nhƣ RNA, protein,…Có nhiều phƣơng
Hình 4.6.3. Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh sau khi chủng vi khuẩn
10 ngày trên môi trƣờng PGA.
Hình 4.6.2. Triệu chứng bệnh trên lá địa lan chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 25
0
C).
a. Ranh giới giữa mô
bệnh và mô khỏe có màu
nâu đen.
b. Vùng bị bệnh có màu
vàng xanh.
a
b

45
pháp ly trích DNA nhƣng mục đích cuối cùng là làm sao thu đƣợc lƣợng DNA đủ lớn và

đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Tuy giai đoạn tách chiết DNA là một giai
đoạn khá đơn giản nhƣng nó lại đóng vai trò vô cùng quan trọng.
Chúng tôi đã tiến hành ly trích một số dòng vi khuẩn. Sau khi ly trích xong, chúng tôi tiến
hành điện di kiểm tra DNA. Kết quả ly trích đƣợc thể hiện ở hình 4.6.


















Qua hình trên cho thấy các mẫu ly trích có độ tinh sạch chƣa cao. Ngoài DNA tổng số còn
có phần tạp (RNA và protein) ở phía dƣới. Có thể loại bỏ đƣợc phần tạp này bằng cách sử
dụng enzyme RNAse. Có một số mẫu DNA bị đứt gãy tạo thành vệt sáng dài. Tuy nhiên,
DNA thu đƣợc tƣơng đối sạch để thực hiện phản ứng PCR. Trƣớc khi tiến hành thực hiện
phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành pha loãng DNA gốc trong nƣớc cất vô trùng hoặc TE
1X. Do lƣợng DNA mẫu dùng trong phản ứng PCR khoảng từ 10 – 100 ng. Nếu lƣợng
DNA mẫu quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. Sau khi pha loãng,
chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose để kiểm tra.

Hình 4.7. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn.
1. EC06-1, 2. EC06-3, 3. EC06-5, 4. EC06-6, 5. EC06-7, 6. EC06-8, 7. EC06-9, 8. EC06-10. Điện
di trên gel agarose 0,8% ở hiệu điện thế 100V/15 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 3 μl
mẫu/giếng.
DNA tổng số
Phần tạp nhiễm
1 2 3 4 5 6 7 8

46
4.6. Phản ứng PCR
4.6.1. Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322
Chúng tôi đã tiến hành chạy PCR trên các dòng vi khuẩn: EC06-1, EC06-5, EC06-
6, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-19 với cặp primer
Xan 1330 và Xan 322.












Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc sản
phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1,5 kb. Tuy nhiên thấy xuất hiện 2 band điều đó chứng

tỏ có sự tạp nhiễm. Lý do của sự tạp nhiễm này có thể đƣợc giải thích có thể tạp nhiễm
trong khi ly trích hoặc tạp nhiễm khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Để khắc phục hiện
tƣợng này, chúng tôi đã nâng nhiệt độ bắt cặp từ 56
0
C lên 58
0
C. Kết quả là thu đƣợc một
band.






1 2 3 4
Hình 4.8. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 56
0
C).
1. EC06-1, 2. EC06-8, 3. EC06-9, 4. EC06-19. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40
phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4μl mẫu/giếng.

Sản phẩm PCR
1 2 3 4
Hình 4.9. Sản phẩm PCR với cặp
primer Xan 1330 và Xan 322
(nhiệt độ bắt cặp 58
0
C).
1. EC06-8. Điện di trên gel agarose
1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong

dung dịch đệm TAE 0,5X, 4μl
mẫu/giếng.

Sản phẩm PCR
1

47
Trình tự 16S rDNA là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa , phân loại
vi khuẩn và đã đƣợc xác định cho nhiều loài vi khuẩn. Trình tự 16S rDNA và vùng hoạt
động giữa 16S – 23S rDNA chỉ ra sự biến đổi giữa các dòng trong cùng một loài. Dựa vào
vùng này để phát hiện ra sự khác nhau giữa các loài vi khuẩn.Cặp primer chúng tôi sử
dụng đƣợc thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA, cho phép khuếch đại đoạn DNA có kích
thƣớc 1,5 kb. Khi kiểm tra trên Genbank chúng tôi thấy cặp primer này có thể khuếch đại
trên một số loài khác. Nhƣ thế, chúng tôi chƣa thể khẳng định đƣợc vi khuẩn chúng tôi
đang nghiên cứu chính xác là Erwinia carotovora subsp. carotovora. Do đó, chúng tôi
tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2.
4.6.2. Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2
Primer Y1 (5
'
-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3
'
), Y2 (5
'
-
CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT- 3
'
) đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn DNA có
kích thƣớc 434bp. Trình tự của mỗi mồi đã đƣợc kiểm tra trên Genbank và EBML
(Darrasse và ctv, 1994).
Trong thí nghiệm này, chúng tôi cũng sử dụng cặp primer có trình tự giống nhƣ

mô tả của Darrasse và ctv (1994) nhƣng có tên khác là Erw1 và Erw2. Chúng tôi đã tiến
hành thực hiện phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 với chu kỳ nhiệt nhƣ đã nêu
ở mục 3.2.7. Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy không có sản phẩm khuếch đại nào
đƣợc tạo ra. Điều đó chứng tỏ phản ứng PCR không xảy ra (Hình 4.10).












Hình 4.10. Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2.
Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE
0,5X, 4 μl/giếng.

48
Theo chúng tôi có nhiều nguyên nhân khiến cho phản ứng PCR không xảy ra:
- Nhiệt độ nóng chảy (melting) của hai primer tƣơng đối cao (84,9
0
C và 73,7
0
C) do trong
thành phần có nhiều GC (66% và 50%). Quy trình ban đầu chúng tôi thực hiện nhiệt độ
giai đoạn bắt cặp là 65
0

C nhƣ thế là tƣơng đối cao. Nhƣng kết quả vẫn không có sản phẩm
khuếch đại. Do đó, chúng tôi tiến hành giảm xuống 62
0
C, 60
0
C, 58
0
C nhƣng vẫn không có
kết quả.
- Nguyên nhân thứ hai có thể do nồng độ các chất tham gia phản ứng quá thấp nên không
đủ cho phản ứng PCR xảy ra. Lƣợng Taq ban đầu chúng tôi sử dụng là 0,1μl/UI, có thể là
thấp không đủ để xúc tác cho phản ứng xảy ra. Chúng tôi tiến hành tăng lƣợng Taq từ
0,1μl/UI lên 0,2μl/UI đồng thời tăng nồng độ primer từ 10 pmol lên 20 pmol. Nồng độ
Mg
2+
cũng là một nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến quá trình PCR. Mg
2+
rất cần cho quá
trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA
mạch kép. Nồng độ Mg
2+
thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài. Ngƣợc lại, nồng độ Mg
2+

cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi
DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). Khoảng nồng độ
cho phép của Mg
2+
từ 1 – 5 mM (McPherson, M. J. và Møller, S. G. 2000). Từ đó, chúng
tôi tiến hành tăng nồng Mg

2+
từ 1,5 mM lên 2 mM, 2,5 mM, 3 mM nhƣng vẫn không cho
bất kỳ kết quả nào. Nhƣ vậy, việc tăng nồng độ các hóa chất là không hiệu quả.
- Nguyên nhân thứ ba có thể do số chu kỳ khuếch đại chúng tôi sử dụng ban đầu (35 chu
kỳ) là tƣơng đối dài. Vì vậy, chúng tôi đã giảm từ 35 xuống 30 chu kỳ, 25 chu kỳ nhƣng
vẫn không có sản phẩm khuếch đại nào đƣợc tạo ra cả.
Qua các thí nghiệm thay đổi các điều kiện của phản ứng PCR, kết quả vẫn không
có sản phẩm khuếch đại tạo ra Có nhiều lý do để giải thích cho vấn đề này. Thứ nhất,
các mẫu địa lan khi bị thối có thể có nhiều loại vi sinh vật khác tấn công do đó có thể
trong các mẫu vi khuẩn chúng tôi phân lập không có sự hiện diện của vi khuẩn Erwinia
carotovora subsp. carotovora. Thứ hai là có thể có sự tạp nhiễm khi phân lập và nuôi cấy
trong phòng thí nghiệm. Thứ ba là có thể các điều kiện của phản ứng chúng tôi thay đổi
chƣa phù hợp. Do hạn chế về mặt thời gian nên chúng tôi vẫn chƣa tìm ra đƣợc một quy
trình PCR thích hợp cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan.


49
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
1. Bệnh thối làm chết cây địa lan đang ảnh hƣởng nghiêm trọng đến các vƣờn lan tại TP.
Đà Lạt – Lâm Đồng. Qua kết quả điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn gây ra
cao hơn hẳn (20,17%) so với tỉ lệ nhiễm bệnh do virus (9,5%) và nấm (11,6%).
2. Kết quả phân lập vi khuẩn thu đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng:
- Khuẩn lạc vi khuẩn có màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
- Khuẩn lạc vi khuẩn có màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
3. Kết quả chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan:
- Trên củ khoai tây: 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh, các dòng còn lại khả
năng gây bệnh yếu hoặc không gây bệnh.
- Trên lá địa lan : hầu nhƣ các dòng vi khuẩn không gây bệnh sau khi chủng bệnh 10
ngày, duy nhất chỉ có dòng EC06-8 gây bệnh.

4. Quy trình tách chiết DNA khá đơn giản, đảm bảo lƣợng DNA thu đƣợc có độ tinh sạch
cao phục vụ tốt cho việc chạy PCR. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ ở mục 3.2.6.
5. Kết quả phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 đã khuếch đại đƣợc đoạn
DNA có kích thƣớc khoảng 1,5 kb.
5.2. Đề nghị
Từ những khó khăn, trở ngại gặp phải trong quá trình nghiên cứu nên chúng tôi có
thể đƣa ra một số đề nghị sau:
1. Cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về đặc điểm sinh trƣởng và phát triển, tiến
hành thử các phản ứng sinh hóa. Bởi vì, nguồn mẫu ban đầu là rất quan trọng, phải khẳng
định chắc chắn trƣớc khi tiến hành các thử nghiệm tiếp theo ở mức độ phân tử.
2. Cần có một mẫu đối chứng dƣơng là điều rất quan trọng và cần thiết.
3. Thiết lập lại quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora
trên cây địa lan (Cymbidium) và hoàn thiện quy trình.

50
TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT
1. Trần Văn Bảo, 1999. Kỹ thuật nuôi trồng phong lan. Nhà xuất bản trẻ. 175 trang.

2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp - Ứng
dụng). Nhà xuất bản Giáo dục.

3. Nguyễn Văn Minh, 2005. Điều tra bệnh chết cây và kỹ thuật trồng địa lan
(Cymbidium) tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. Luận văn tốt nghiệp Ngành Nông Học 2005.

4. Lê Hữu Quang, 2005. Nghiên cứu một số loại giá thể cho cây hoa địa lan (Cymbidium)
trồng tại TP. Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học 2005.

5. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà xuất

bản Giáo dục, Hà Nội. Trang 7 – 118.

6. Nguyễn Văn Tới, 2003. Một số vấn đề bảo vệ thực vật trong nuôi trồng hoa địa lan
Cymbidium.

7. Trƣơng Trỗ, 1988. Đà Lạt Cymbidium. Sở khoa học, công nghệ và môi trƣờng Lâm
Đồng. />jpg&imgrefurl=

TIẾNG NƢỚC NGOÀI

8. Aysan Y., Saygili H., Sahin F. and Mirik M. New symptoms of tomato soft rot diseases
in Turkey.


51
9. Aysan Y., Saygili H., Sahin F. and Cetinkaya-Yildiz R. Present status of bacterial stem
rot on tomato in Turkey.

10. Cerkaukas R. F. and Brown J. 2001. Bacterial stem and peduncle canker of
greenhouse pepper.
/>olume=23&articleFile=k01-019.pdf

11. Christopher P. K. and David H. P. 1999. Ribosomal DNA Sequencing as a tool for
identification of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology, 2: 299 – 305.

12. Darrasse A., Priou S., Kotojansky A. and Bertheau Y. 1994. PCR and restriction
fragment length polymorphism of a pel gen as a tool to identify Erwinia carotovora in
relation to potato diseases. Applied and Environmental. Microbiology, May, p.1437 –
1443.

13. Fiori M. and Schiaffino A., 2003. Bacterial Stem Rot in Greenhouse Pepper
(Capsicum annuum L. ): Occurrence of Erwinia carotovora sbsp. carotovora.
J.Phytopathology. 152, 28 – 33.

14. Heidi Hyytiainen, 2005. Regulatory networks controlling virulence in the plant
pathogen Erwinia carotovora ssp. carotovora. Department of Biological and
Environmental Sciences. Faculty of Biosciences. University of Helsinki.57 pages.



15. Kang H. W., Kwon S. W. and Go S. J. 2003. PCR – based specific and sensitive
detection of Pectobacterium ssp. carotovorum by primers generated from a URP – PCR
fingerprinting – derived polymorphic band. Plant pathology. 52, 127 – 133.

52

16. Khoodoo M. H. R., Sahin F., Donmez M. F. and Jaufeerally Fakim Y. 2004.
Molecular characterisation of Xanthomonas Strains isolated from aroids in Mauritius.
Systematic and Applied Microbiology. 28, 366 – 380.

17. Marcos Montesano, 2002. Molecular characterization of plant defense respones to
Erwinia carotovora. Division of Genetics, Department of Biosciences, Faculty of
Science. University of Helsinki. 60 pages.


18. McPherson M. J. and Møller S. G., 2000. PCR. BIOS. 276 pages.

19. Phokum C., Jitareerat P., Photchanachai S. and Cheevadhanarak S. Detection and
classification of soft rot Erwinia of vegetables in Thailand by DNA polymerase chain
reaction.

20. Seo S. T., Furuya N., Lim C. K., Takanami Y. and Tsuchiya K. 2003. Phenotypic and
genetic characterization of Erwinia carotovora from mulberry (Morus spp. ). Plant
Pathology. p. 142.

21. Seo S. T., Furuya N., Lim C. K., Takanami Y. and Tsuchiya K. 2001. Phenotypic and
Genetic Diversity of Erwinia carotovora ssp. carotovora Strains from Asia.
J.Phytopathology.150: 120 – 127.

22. Subandiyah S., Iwanami T., Tsuyumu S. and Ieki H. 2000. Comparison of 16S rDNA
and 16S/23S Intergenic Region Sequences Among Citrus Greening Organisms in Asia.
Plant Dis. 84:15 – 18.


53
23. So Young Yoo, Sun Young Park, Won Min Yoo, Kyung Hee Chang, Nae Choon Yoo,
June Myung Kim, Seung Min Yoo, Ki Chang Keum and Sang Yup Lee, 2002. Design of
ITS and 23S rDNA – Targeted Probes and Its Usefulness for the Identification of
Bacterial Pathogen. Genome Informatics. 13: 589 – 590.


24. Wright P. J. 1998. Plant disease record A soft rot of calla (Zantedeschia spp. ) caused
by Erwinia carotovora subspecies carotovora.



25. Yeshitila Degefu, Sanna Jokela, Erkki-Joki Tkola and Elina Virtanen, 2006. DNA
based detection of blackleg and soft rot disease causing Erwinia strains in seed potatoes.

TRANG WEB