Luận văn : PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR part 2 pdf

10


2.3.7. Phòng trừ
Sử dụng giống kháng, chọn nguồn giống khỏe, sạch bệnh làm vật liệu trồng.
Tiêu diệt cây bệnh và cỏ dại, hạn chế bệnh lây lan, ẩn náu trên đồng ruộng.
Luân canh với cây trồng khác họ.
Xử lí hom giống bằng nhiệt độ hoặc thuốc hóa học.
Nuôi cấy mô phân sinh ngọn hoặc nuôi cấy mô kết hợp với xử lí nhiệt.
Tránh trồng và đốn mía vào thời kỳ có mật độ cao của quần thể môi giới.
2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía
2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh
Phƣơng pháp này đơn giản và nhanh nhất nhƣng hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm
tính giả cũng cao nhất. Đơn giản vì vết bệnh dễ biến đổi, nhiều khi cây bị bệnh mà vết
bệnh không phát ra ngoài. Một số trƣờng hợp khác nhƣ vết bệnh không rõ ràng, bệnh
trong giai đoạn tiềm ẩn cũng gây khó khăn trong chẩn đoán.
2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi
Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dịch chiết từ lá cây bệnh hoặc thông qua làm tinh
khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Đây
là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản.
2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay)
Phƣơng pháp ELISA là phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzym. Năm 1972 - 1973,
ELISA đƣợc sử dụng đầu tiên trong y học để chẩn đoán virus. Đến năm 1977 Clark và
Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định virus hại thực vật tại Scottlen. Đây là
kỹ thuật khá nhạy và tƣơng đối đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) và
kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml), rẻ tiền, an toàn và độ chính xác
cao (Phạm Văn Ty, 2001).
Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là:
- Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó,

kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc
phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme).
- Indirect ELISA: Phƣơng pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng
nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng
thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme).


11


- Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực
tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Đƣợc gọi là “sandwich” là do kết quả thí
nghiệm đƣợc đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể
bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kỹ thuật
này cũng đƣợc phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA -
Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA - Triple
antibody sandwich).
Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật DAS ELISA (Double
Antibody Sandwich) để thực hiện chẩn đoán SCMV. Đây là một dạng của Direct
sandwich ELISA với kháng thể sử dụng là kháng thể đa dòng. Quy trình các bƣớc thực
hiện DAS ELISA đƣợc sơ đồ hóa nhƣ Sơ đồ 2.1.

Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp
Phân tích kết quả ELISA dựa trên sự đổi màu của các giếng (Hình 2.5) và bằng
máy đọc ELISA. Máy đọc ELISA hoạt động dựa trên nguyên lí quang phổ kế, đo giá
trị OD của các giếng ở bƣớc sóng 405 nm.
Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA


Ủ, rửa


Thêm kháng nguyên vào

Ủ, rửa


Bổ sung kháng thể có gắn enzyme


Ủ, rửa

Thêm cơ chất tạo màu


Ủ, đọc kết quả

12





Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA.
2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phƣơng pháp này do K. Mullis và ctv phát minh năm 1985 và đƣợc sử dụng rộng
rãi nhất, trở thành một công cụ cần thiết trong các thí nghiệm phân tử. Năm 1993,
Henson và French đã đƣa kỹ thuật PCR vào việc chẩn đoán bệnh hại thực vật và phát
triển đến nay.
PCR là một phản ứng sinh hóa phụ thuộc vào nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá
trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzym chịu nhiệt (thƣờng dùng
enzym “Taq” đƣợc chiết xuất từ vi khuẩn từ suối nƣớc nóng Thermus apquaticus), có
2 đoạn ngắn DNA một sợi làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để
tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Đối với một số loại virus có cấu trúc acid
nucleic là RNA nói chung và virus SCMV nói riêng thì bƣớc phiên mã ngƣợc (reverse
transcriptase - RT) là cần thiết để tồng hợp nên complementary DNA (cDNA) trƣớc
khi tiến hành phản ứng PCR.
Phản RT - PCR gồm 2 quá trình: (Sơ đồ 2.2)
 Quá trình reverse transcriptase (RT)


13


Để chuyển RNA thành DNA, phản ứng này dựa trên khả năng của enzyme phiên

mã ngƣợc, một polymerase RNA phụ thuộc DNA để tạo ra một sợi DNA bổ sung
(first-strand cDNA) sử dụng mRNA nhƣ một khuôn mẫu.
 Quá trình PCR
Để khuyếch đại cDNA vừa tạo thành ở quá trình Reverse Transcriptase
Complementary DNA đƣợc xem nhƣ DNA khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR.
Phản ứng PCR gồm ba chu kỳ: biến tính, bắt cặp và kéo dài. Khởi đầu quá tình
tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ từ 6 - 30 nucletides).
Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và đƣợc enzym DNA-
polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi DNA đặc thù.
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR (Trích dẫn Vương Hồ Vũ, 2005).
Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đƣợc chọn nằm ở 2 đầu đoạn DNA cần nhân
lên, sao cho các sợi DNA đƣợc tổng hợp mới đƣợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài
về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này.
Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn cặp nucleotid.


14


Nhƣ vậy sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi
DNA mới đƣợc tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại đƣợc nâng nhiệt độ thích hợp sao cho
các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới đƣợc tổng hợp, các sợi này sau đó đƣợc dùng làm
khuôn cho chu kỳ tiếp theo.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ (thƣờng từ 25-35 chu kỳ),
tính theo lý thuyết ta có: 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi.
Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA định trƣớc đƣợc nhân lên với một số lƣợng rất lớn.
2.4. Bệnh cằn mía gốc
2.4.1. Nguồn gốc và phân bố
Bệnh cằn mía gốc hiện nay đƣợc xếp vào loại bệnh có tầm quan trọng kinh tế lớn
trên thế giới (Davis và Bailey, 2000). Nguyên nhân là do sự phân bố rộng khắp của nó

trên thế giới, sự thiếu các triệu chứng có thể nhận diện đƣợc ở cây kí chủ, thiếu các
đặc tính của tác nhân gây bệnh, sự nghiên cứu về bệnh, và những chiến lƣợc cần thiết
để kiểm soát bệnh có hiệu quả. Do vậy bệnh cằn mía gốc hiện đang là một trong
những bệnh đang gây hậu quả nghiêm trọng cho các vùng trồng mía trên thế giới.
Bệnh cằn mía gốc đƣợc phát hiện đầu tiên ở Queensland trong thời gian từ năm
1944 - 1945, lúc này trên giống mía Q28 đang trồng ngƣời ta phát hiện ra có hiện
tƣợng bị hủy hoại bất thƣờng. Sau đó ngƣời ta phát hiện ra rằng RSD đã phân bố khắp
vùng Queensland, và có mặt ở hầu hết các vùng trồng mía trên thế giới.
2.4.2. Triệu chứng
2.4.2.1. Triệu chứng bên ngoài
Hầu nhƣ không có triệu chứng bên ngoài có thể nhận ra đƣợc từ cây mía bị bệnh
ngoại trừ sự cằn cọc và phát triển kém của cây. Tuy nhiên những đặc điểm trên đều có
thể thấy đƣợc ở những vùng đất trồng kém dinh dƣỡng, độ ẩm không thích hợp hay
cây bị thiếu dinh dƣỡng.
Về sự phát triển của chồi thì cây bị bệnh phát triển chậm hơn cây sạch bệnh đặc
biệt là trong mùa khô khi mà các gốc mía dƣờng nhƣ không phát triển trong vài tuần
hay cả khi cả tháng. Những gốc mía này thƣờng rất khỏe và không có sự bất thƣờng
nào ở hệ thống rễ cũng nhƣ ở thân hay chồi ở dƣới đất. Sự cằn cỗi biểu hiện không
đồng nhất giữa các chồi nhiễm bệnh, và ruộng nhiễm bệnh biểu hiện cả sự đi lên và đi
xuống của sự phát triển, ngay cả khi tất cả các cây đều bị nhiễm bệnh.


15


2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây
Khi chẻ đôi thân cây bị nhiễm bệnh bằng một con dao sắc thì sẽ thấy ở phần dƣới
các mắt mía có những chấm đổi màu hình dấu chấm hay dấu phẩy. Sự đổi màu thƣờng
diễn ra từ đốt dƣới rồi mới lên đến các nốt bên trên, thƣờng định vị ở những vùng dƣới
bẹ lá ngay tại vị trí của nơi xuất dịch cây. Trong vùng này là nơi phát sinh ra lá và các

nhánh của các bó mạch. Sự đổi màu do RSD không diễn ra ở phẩn giữa đốt. Màu của
mô nhiễm bệnh khác nhau về mức độ đậm nhạt và cƣờng độ phụ thuộc vào mức độ
nhiễm bệnh và các giống mía khác nhau, và nó cũng có thể khác nhau bên trong các
giống. Một vài giống thì không biểu hiện các triệu chứng này. Các vùng bị biến đổi
màu này rất đa dạng có thể là màu vàng, cam, hồng, đỏ, và hơi đỏ nâu và những màu
này thƣờng nổi bật lên trên trên nền màu trắng sáng của mô tế bào. Có trƣờng hợp
bệnh tạo ra những vết đổi màu kem, khó có thể phân biệt trong toàn bộ đốt khi so sánh
với mô của cây khỏe mạnh. Nhƣng khi các vệt này xuất hiện tại một nốt mà nốt kế cận
lại không biểu hiện thì vẫn không chắc là nó có bị bệnh cằn mía gốc hay không. Để
chẩn đoán chính xác, thì các vệt đổi màu phải xuất hiện trên tất cả các nốt của cây.
Triệu chứng của RSD trên chồi mía 1 - 2 tháng tuổi là sự chuyển hồng tại các đốt
còn non, nhƣng nó diễn ra chỉ trong vài dòng mía và dƣới những điều kiện canh tác
khác nhau. Sự đổi màu diễn ra và khuyếch tán từ nốt lên 1 - 2 cm đến đỉnh sinh trƣởng
của nốt kết cận. Phần đầu của đỉnh sinh trƣởng không liên kết với RSD. Những triệu
chứng ban đầu đƣợc thấy rõ nhất khi cắt các chồi non theo chiều dọc.







A B C
Hình 2.6. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Irvine, 1999).
Chú thích: A: Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; B: Đốt thân ngắn; C: Vết đổi màu
trong thân cây mía bị bệnh.


16

Các triệu chứng khác xảy ra trên cây mía bị bệnh cằn mía gốc là cây còi cọc, kém
phát triển hơn so với các cây cùng độ tuổi, đốt thân ngắn đƣờng kính thân nhỏ hơn so
với cây mía bình thƣờng (Hình 2.6).
2.4.3. Tác nhân gây bệnh
Đẩu tiên ngƣời ta cho rằng tác nhân gây bệnh là virus.
Tuy nhiên Davis (1980) đã chứng minh đƣợc bệnh là do vi
khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli gây ra khi ông nuôi cấy
thành công vi khuẩn này. Vi khuẩn Clavibacter xyli subsp.
xyli có kích thƣớc 0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm (đôi khi dài đến
10μm) và sinh sản theo cách thức nhân đôi. Hình dạng thẳng
hay gậy mảnh, nhƣng một vài tế bào lại căn phình ra ở ngoại
biên hay ở giữa tế bào. Mesosome thƣờng hiện diện và thỉnh
thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn. Gần đây vi
khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli đƣợc phân loại trở lại sang
một giống mới, là Leifsonia xyli subsp. xyli (Evtushenko,
2000) (Hình 2.7).
Vi khuẩn Lxx vẫn giữ nguyên đƣợc khả năng xâm nhiễm và gây bệnh khi đã đƣợc
lọc, ly tâm, qua quá trình đông lạnh và rã đông, ly tâm, điện di. Lxx có thể chữa trị
đƣợc bằng cách đốt nóng và nó nhạy cảm với các dung môi hữu cơ và có ái lực ion
cao đƣợc ứng dụng trong việc lọc và tinh sạch mẫu virus. Chữa trị bằng tetracycline
không có hiệu quả đối với RSD, điều này có nghĩa là phytoplasma không có trong
thành phần cấu tạo. Protein của Lxx điện di với gel polyacryamide giống với băng điện
di của các chủng vi khuẩn nhƣ Corynebacterium michiganensis, và các tác nhân gây
bệnh có chứa 2,4 - diaminobutyric acid.
2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh
Bệnh lây truyền giữa các ruộng mía thông qua các dụng cụ thu hoạch nhƣ dao, máy
cắt mía,.v.v. do dịch chiết nƣớc mía từ cây bị bệnh vẫn còn dính trên dụng cụ khi
chuyển sang ruộng khác thu hoạch.
Bởi vì bệnh thƣờng khó nhận ra đƣợc bằng các triệu chứng bên ngoài nên các vi

khuẩn này đã lan truyền từ vùng này sang vùng khác và từ quốc gia này sang các quốc
gia khác thông qua các chƣơng trình trao đổi giống cây trồng.

Hình 2.7. Vi khuẩn Lxx
dƣới kính hiển vi điện tử
(x30.000 lần)
(K. E. Damann, 2002)


17


2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế
Hình hƣởng của RSD gây ra trên cây mia chủ yếu là làm giảm năng suất của cây,
tác động này phụ thuộc vào yếu tố giống và điều kiện thời tiết.
Năng suất giảm mạnh mẽ khi cây bị hạn hán và có thể giảm đáng kể trong điều
kiện đƣợc tƣới tiêu hợp lí.
Bệnh trầm trọng hơn khi mía bƣớc vào vụ mía gốc do đó bệnh làm giảm tốc độ
phát triển của mía gốc và số vụ mía gốc của giống mía. Hàm lƣợng đƣờng thƣờng
không bị ảnh hƣởng ngoại trừ khi cây bị chết.
2.4.6. Kiểm soát bệnh
Giữ vệ sinh dụng cụ thu hoạch: trƣớc và sau mỗi lần thu hoạch chúng ta đều phải
làm sạch các dụng cụ thu hoạch trƣớc khi cắt sang vƣờn cây sạch bệnh. Chúng ta có
thể dùng cách đốt, hay sử dụng hóa chất không lây nhiễm.
Làm sạch cây giống trƣớc khi trồng ta dùng phƣơng pháp ngâm chúng trong dòng
nƣớc nóng ở 52
O
C trong vòng 4 tiếng là có thể loại Lxx ra khỏi vật liệu trồng.
Dùng giống kháng với bệnh cằn mía gốc.
2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía

2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi
Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc bằng cách đẩy khí từ đầu này sang đầu kia của một
đoạn thân cây mía và xem trực tiếp dƣới kính hiển vi (không cần nhuộm). Kết quả
dƣơng tính trong chẩn đoán phụ thuộc vào kinh nghiệm của ngƣời quan sát rất nhiều,
nguyên nhân ở đây là rất khó để nhận ra vi khuẩn trong dịch chiết nƣớc mía, đặc biệt
là khi nồng độ của chúng trong dịch chiết thấp.
2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học
 Nhuộm kháng thể huỳnh quang (flourescent antibody staining)
Harris và Gillaspie (1978) là những ngƣời đầu tiên đƣa ra phƣơng pháp kháng thể
huỳnh quang gián tiếp (indirect flourescent antibody technique - FAT) sử dụng kháng
huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đoán RSD. Brlansky và ctv (1982) đã phát hiện
Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc hiệu để gắn kết Lxx với
tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC).


18


Davis (1985) tăng độ nhạy của FAT lên 100 lần bằng kỹ thuật đếm trực tiếp kháng
thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF). Màng lọc đƣợc kiểm tra có vi khuẩn
gắn huỳnh quang hay không bởi kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 1200 lần.
 Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mô mẫu (Tissue Blot
Enzym Immunoassay)
Kỹ thuật Tissue Blot Enzym Immunoassay (TBIA) là một dạng thay đổi của kỹ
thuật dot - blot assay, trong đó vi khuẩn đƣợc tách ra khỏi mô bị bệnh nhờ ly tâm và
dính lên màng nitrocellulose (NCM). Sau đó vi khuẩn sẽ đƣợc nhuộm kháng thể.
Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dƣơng tính đối với vi khuẩn
Lxx khi đem phân tích miễn dịch học.
 Dot Blot Assay
Thu dịch chiết từ đốt mía (50 μl) trộn với 10 mM PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 về thể

tích. 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS đƣợc lọc qua màng màng lọc NCM kích thƣớc
lỗ 0,45 μm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở 80
O
C trong 60
phút trƣớc khi đem nhuộm bằng phƣơng pháp EIA/TBIA. Các phản ứng dƣơng tính
đƣợc nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng.
 Evaporative - binding Enzym Linked immunosorbent assay (EB - ELISA)
Phƣơng pháp EB - ELISA do Croft và ctv đƣa ra năm 1994 để chẩn đoán RSD.
Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc ly tâm ở 3000 vòng trong 15 phút hay 13000 vòng trong
5 phút. Dịch nổi đƣợc loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550 μl dịch đệm.
Mẫu phân tích đƣợc cho bay hơi hoàn toàn trong buồng ủ thoáng khí ở 35
0
C. Sau khi ủ
mẫu đƣợc đem đổ đĩa với hỗn hợp sữa không kem và kháng thể.
Phƣơng pháp EB - EIA có thể phát hiện vi khuẩn nuôi cấy trong môi trƣờng với
mật độ thấp hơn 10
5
tế bào/ml và 5.10
5
tế bào/trong dịch nhiễm.
 Liquid Transfer Enzyme immunoassay (LT - EIA)
Leaman và ctv (1991) sử dụng phƣơng pháp LT- EIA để chẩn đoán RSD và so
sánh phƣơng pháp này với phƣơng pháp FADCF. LT - EIA phát hiện đƣợc Lxx ở mật
độ 5.10
1
tế bào/ml chiết và cho độ chính xác đến 98%. FADCF có khả năng phát hiện
5.10
1
tế bào/ml và với độ chính xác đến 100%. Tuy nhiên, FADCF khó có khả năng
thực hiện đƣợc trên nhiều mẫu cùng lúc. Phƣơng pháp LT - EIA thích hợp cho việc

kiểm tra một số lƣợng mẫu lớn.


19


2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ)
Cắt chéo vào mắt mía của một cây mía trƣởng thành bị nhiễm Lxx để xử lý với
dung dịch thuốc nhuộm có chứa Safranin. Quan sát sự chuyển màu bên trong thân mía:
vùng chuyển thành màu đỏ là không có vi khuẩn Lxx và vùng chuyển màu vàng là có
chứa vi khuẩn Lxx.
2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử
 Chẩn đoán dựa vào việc sử dụng các đầu dò DNA
Chung và ctv (1994) đã sử dụng kỹ thuật lai tại vết bệnh (dot blot hybridization)
với 7 đầu dò DNA đặc hiệu cho Lxx.
 Kỹ thuật PCR.
Kỹ thuật PCR đƣợc phát triển nhằm phát hiện Lxx (Pan và các cộng sự, 1998; Taylor
và các cộng sự, 2003). Mồi cho các phản ứng này đƣợc thiết kế từ vùng ITS (intergenic
transcribed spacer region) giữa gen rRNA 16S và 23S của operon rRNA vi khuẩn Lxx.
2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc
2.5.1. Trên thế giới
 Bệnh khảm lá mía
- Năm 1927, bệnh khảm virus ở Australia làm giảm năng suất khoảng 39 - 46%,
thiệt hại trên giống Q28 là năng suất vụ tơ giảm 27% và ở vụ gốc giảm 67%
(Koike và Gillaspie,1989).
- Theo Koike và Gillaspie (1989), dòng A của virus gây bệnh khảm lần đầu tiên
đƣợc phát hiện năm 1943 trên giống SP34-120 ngoài sản xuất, và cho đến nay
ngƣời ta đã tìm thấy 13 dòng virus gây bệnh khảm này tại Mỹ. Trong lịch sử
Hawaii là vùng bị bệnh virus tàn phá nặng nề nhất.
- Theo nghiên cứu của Salomon và ctv (2000), bệnh khảm virus làm giảm năng

suất mía 30 - 40% tại quốc gia này.
- Jang và Zhuo (2002) phát hiện đƣợc SCMV gây bệnh trên bắp ở Trung Quốc
bằng phƣơng pháp RT - PCR.
 Bệnh cằn mía gốc
- Năm 1945, Steind đã có những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia.
- Năm 1980, Davis tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Lxx


20


- Năm 1998, Y Pan và các cộng sự đã đƣa ra protocol để chẩn đoán Lxx dựa vào
cặp mồi Cxx trong dịch khuẩn lạc nuôi cấy và trong dịch chiết nƣớc mía.
- Năm 2003, Stevens Brumbley đã phát triển cặp mồi để phát hiện Lxx trong dịch
chiết nƣớc mía có tính đặc hiệu hơn và đƣợc chứng minh là có độ nhạy cao.
- Năm 2004, Luis E. A. Camargo và ctv đã giải đƣợc trình từ genome của vi
khuẩn Gram dƣơng Lxx tác nhân gây bệnh trên cây mía.
- Viện khoa học nông nghiệp Tây Nam Trung Quốc năm 2004 cũng đã phát hiện
đƣợc vi khuẩn Lxx ở Quảng Tây bằng kỹ thuật PCR.
2.5.2. Trong nƣớc
 Bệnh khảm lá mía
Nƣớc ta do điều kiện lịch sử hình thành nên việc nghiên cứu bệnh hại mía nói
chung và bệnh khảm lá mía nói riêng còn rất mới mẻ so với các nƣớc trong khu vực,
cụ thể là:
- Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987) đã kết luận rằng bệnh khảm
lá mía ở nƣớc ta chỉ xuất hiện rải rác, thiệt hại chƣa ở mức đáng quan tâm.
Bệnh sau đó đƣợc công bố gây hại vào năm 1996 (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu
Mân, 1999)
- Nguyễn Huy Ƣớc (1999) cũng đã đề cập đến 4 bệnh virus phổ biến trên mía,
trong đó có bệnh khảm mía và đƣa ra một số phƣơng pháp phòng trừ.

- Gần đây có một nghiên cứu sơ về thành phần bệnh hại trên cây mía ở vùng
Đông Nam Bộ (Hà Đình Tuấn, 2004) cũng có đề cập đến sự xuất hiện không
nhiều của bệnh khảm lá mía.
- Trƣơng Lê Bạch Liên (2005) cũng đã thực hiện việc điều tra trên quy mô nhỏ
các giống mía trồng tại TTNCMĐ và một số vùng lân cận. Kết quả chỉ ra rằng
tình hình nhiễm bệnh là rất ít.
 Bệnh cằn mía gốc
RSD là một loại bệnh đã đƣợc phát hiện từ lâu, trong lịch sử cũng đã có nhiều vùng
bị thiệt hại năng nề do RSD gây ra. Tuy nhiên tình hình nghiên cứu về bệnh cằn mía
gốc trên cây mía của nƣớc hiện nay vẫn chƣa đƣợc chú ý đi sâu nghiên cứu nhiều. Cụ
thể là:
- Năm 1967 – 1986, đã có cuộc điều tra về bệnh học của cây mía ở miên Bắc và
lúc này ngƣời ta phát hiện có 22 bệnh (Nguyễn Huy Ƣớc, 1999).


21


- Năm 1963 trạm thực nghiệm mía Quảng Ngãi xác đinh đƣợc 11 loại bệnh hại
mía, trong đó bệnh đốm vàng và cháy lá gây thiệt hại nặng nhất.
- Tổng kết của Hoàng Thị Mỹ năm 1966 thì ở khu vực phía Nam có 13 loại bệnh
trên mía (Đỗ Ngọc Diệp và ctv, 1987).
- Theo Phan Gia Tân (1999) thì có 12 loại bệnh xuất hiện phổ biến trên cây mía
do tác nhân virus, vi khuẩn, và nấm và 6 loại bệnh khác do yếu tố dinh dƣỡng.
- Tổng kết của Rott và ctv (2000) qua điều tra sơ bộ năm 1999, ở Việt Nam có 21
bệnh phổ biến gây hại trên cây mía.
- Mới đây, ngƣời ta thống kê lại lần nữa số bệnh trên các giống mía miền Đông
Nam Bộ là 3 bệnh do virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do
phytoplasma, 4 bệnh chƣa biết tác nhân và một số bệnh khác do yếu tố môi
trƣờng gây ra (Hà Đình Tuấn, 2004).

22


Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Nội dung nghiên cứu
Đề tài thực hiện gồm có 2 nội dung chính sau:
- Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên một số giống mía sản
xuất và nhập nội tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng.
- Bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR trên một
số giống mía sản xuất tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực.
+ Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp
nhuộm STM.
+ Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx và
nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy.
+ PCR phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía.
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10 tháng 05 đến ngày 10 tháng 08 năm 2006.
Địa điểm thực hiện: Phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Vật - Trung tâm Phân tích
Thí nghiệm (TTPT) Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm
nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng ThọVực tỉnh Đồng Nai.
3.3. Vật liệu nghiên cứu
3.3.1. Các giống mía nghiên cứu
6 giống mía sản xuất đƣợc trồng tại TTNCMĐ gồm: C90-127, VN84-4137,
DLM24, R570, VN85-1427, ROC26.
10 giống mía Thái Lan nhập nội năm 2005 là: KU00-1-58, K95-2-156, KU00-1-92,
K95-161, K95-156, KU60-1, U-THONG483, K95-50, KU98-009 , KU60-2.

5 giống mía tại nông trƣờng Thọ Vực: My55-14, VN84-4137, QĐ368, VĐ85-177,
VN85-1427.
3.3.2. Virus gây bệnh
Virus Sugarcane Mosaic (SCMV) gây bệnh khảm lá mía.
3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh
Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây bệnh cằn mía gốc.


23


3.3.4. Hóa chất thí nghiệm
- Các hóa chất nằm trong kít DAS-ELISA (Biorad) gồm: Dung dịch đệm li trích,
dung dịch đệm cho kháng thể, kháng thể, đối chứng âm, đối chứng dƣơng,
kháng thể gắn enzym, P-nitrophenyl phosphate (pNPP).
- Dung dịch đệm rửa PBS- Tween.
- Dầu khoáng dùng để xem kính ở độ phóng đại 1000 lần.
- Hóa chất pha môi trƣờng nuôi cấy Lxx gồm: Bacto agar, pepton đậu nành,
KH
2
PO4, K
2
HPO4, MgSO
4
.7H
2
O, glucose, bovine serum albumin (BSA),
cysteine, nalidixic acid, methionine.
- Hóa chất cho phản ứng PCR gồm: Taq DNA polymerase, dung dịch đệm
(buffer), MgCl

2
, dNTPs, polyvinyl pyrolidone (PVP), primer C2.
- Hóa chất sử dụng trong điện di: Agarose, TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM;
EDTA 0,1 mM; pH 8), blue/orange loading dye 6X (Promega), ethium bromide
(nồng độ 5.10
-3
% theo thể tích).
3.3.5. Thiết bị và dụng cụ
- Cối chày, eppendorf, bình cồn, bông gòn, đĩa petri, ống đong, dao, ống bơm.
- Micropipet 10-100-1000 μl, đầu típ các loại, eppendorf (các loại).
- Đĩa ELISA, máy rửa ELISA, tủ ủ, máy đọc ELISA, máy in.
- Nồi hấp vô trùng (autoclave), tủ sấy, tủ cấy vô trùng (microflow).
- Máy cất nƣớc, máy đo pH, máy khấy từ, máy đánh sóng, máy ly tâm.
- Que trang, que cấy các loại, bercher, màng lọc vô trùng (0,2 và 0,45 μm)
- Máy PCR, bồn điện di, lò viba, máy chụp gel, kính hiển vi quang học.
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.5. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu
Để đảm bảo tính ngẫu nhiên trong quá trình thí nghiệm thì công tác điều tra lấy
mẫu trên mỗi giống đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Liên hệ bộ môn Bảo vệ thực vật và bộ môn giống ở TTNCMĐ để xác định các
giống mía cần thu thập và lấy mẫu.
- Tại mỗi ruộng điều tra (trung bình là 1 hecta) chọn 5 điểm khảo sát.
- Lấy mẫu ngẫu nhiên 5 mẫu/ruộng. 1 mẫu lá (hay mẫu thân) dùng trong phân
tích bệnh khảm lá mía hay cằn mía gốc tại 1 điểm điều tra đƣợc lấy ngẫu nhiên


24


từ 3 cây của 3 hom mía nằm trên 3 hàng xen kẽ nhau (ví dụ nhƣ hàng 1, 3, 5

hay hàng 2, 4, 6) (xem Sơ đồ 3.1).








5 điểm lấy mẫu theo đƣờng chéo góc
H1 x x … o x
H3 o x … x x
H5 x x … o x
Chọn ngẫu nhiên
3 cây trên 3 hàng
để lấy mẫu điều
tra
Tại 1 điểm điều tra
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra
Chú thích: H1,3,5: Hàng mía điều tra; O: Bụi được kiểm tra; X: Bụi không điều tra.
- Mẫu thân mía sau đó đƣợc chiết lấy dịch bằng cách đẩy khí: 1 đoạn thân cây
mía (khoảng 10 – 20 cm) đƣợc chặt ra, dùng một ống bơm đẩy dịch chiết từ đầu
này sang đầu kia, thu dịch chiết cho vào eppendorf có ghi nhãn cẩn thận về mẫu
nhƣ giống, tuổi cây, triệu chứng.
- Mẫu lá và dịch chiết nƣớc mía đƣợc cho vào thùng xốp giữ lạnh và đem về trữ
ở TTPT Đại học Nông Lâm.
3.4.6. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA
3.4.3.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị chày cối (hấp nƣớc DEPC) để khô ở tủ âm trƣớc khi nghiền mẫu, pha
dung dịch đệm ly trích mẫu (từ 20X xuống 1X). Khi nghiền mẫu thì cắt nhỏ mẫu ra

bằng kéo (có sự vô trùng bằng cồn sau mỗi lần cắt mẫu) để dễ dàng nghiền mẫu. Cụ
thể quy trình làm đƣợc tóm tắt ở Sơ đồ 3.2.

1




2

5


4

3


25


Mẫu lá mía

Cân 0,5 g

Cắt nhỏ

Cho vào cối nghiền + Extractionbuffer (2,5ml)

Nghiền

Cho dịch nghiền vào eppendorf

Li tâm ở 4
O
C, 3 phút, 7000 vòng/phút

Hút dịch trong chuyển sang eppendorf mới

Trữ ở tủ mát 4
O
C
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA


1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A

B
Substrate
BF
1
4
7
10
13
16
19
22
25

C
Substrate
BF
1
4
7
10

13
16
19
22
25

D
Substrate
PC
2
5
8
11
14
17
20
23
26

E
Substrate
PC
2
5
8
11
14
17
20
23

26

F
Substrate
NC
3
6
9
12
15
18
21
24
27

G
Substrate
NC
3
6
9
12
15
18
21
24
27

H

Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA
Chú thích: Subs: Substrate; PC: Positive control; BF: Buffer extraction; 1, 2,
3,.v.v.: Mẫu chẩn đoán; NC: Negative control


26


Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu trên đĩa, mỗi đĩa đƣợc bố trí: 2 giếng đối chứng
dƣơng, 2 giếng đối chứng âm, 2 giếng dung dịch đệm (buffer), 6 giếng chứa chất nền
(substrate), còn lại là các giếng chứa mẫu cần phân tích. Tuy nhiên để đảm bảo tính
chính xác cao trong quá trình thực hiện phản ứng, chúng chúng tôi chỉ tiến hành vô
mẫu lá phân tích trong 54 giếng (từ B3 - G11). Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 2 lần trên 2 giếng
kề nhau theo chiều dọc của đĩa ELISA (Sơ đồ 3.3).
3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA
 Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Bƣớc 1: Pha loãng kháng thể đa dòng trong dung dịch đệm đến nồng độ 1/100.
Cho hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100
μl/giếng. Các giếng substrate đƣợc thay bằng nƣớc cất siêu lọc với thể tích

tƣơng đƣơng trong suốt quá trình phân tích. Ủ đĩa ở 37
O
C trong vòng 2 giờ. Sau
đó rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 2: Cho 100 μl dịch đệm ly trích vào mỗi giếng BF, pha đối chứng dƣơng
và đối chứng âm trong 1ml nƣớc cất siêu sạch, cho 100 μl đối chứng âm vào
giếng NC và 100 μl đối chứng dƣơng vào giếng PC. Với các giếng mẫu, cho
100 μl dịch trích mẫu ở giai đoạn ly trích vào mỗi giếng. Ủ đĩa ở 4
O
C qua đêm.
Rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 3: Pha dung dịch kháng thể gắn enzym đến nồng độ 1/100. Cho 100 μl
hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC, và các giếng mẫu. Ủ đĩa ở 37
O
C trong
vòng 2 giờ. Rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch PBS - tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 4: Hòa tan pNPP dạng viên trong dung dịch đệm, cho vào tất cả các giếng
substrate, BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Ủ đĩa ở 37
O
C
trong 30 phút, đọc kết quả bằng máy đọc ELISA hoặc quan sát sự đổi màu của
giếng bằng mắt thƣờng. Sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ đọc lại kết quả ELISA.
 Các mẫu lá mía đƣợc chẩn đoán có nhiễm bệnh hay không dựa vào:
- Sự đổi màu trong phản ứng DAS-ELISA: giếng nào nếu màu vàng giống mẫu
đối chứng dƣơng thì mẫu đó dƣơng tính (+), bị nhiễm SCMV. Các giếng không
màu trùng với giếng đối chứng âm là mẫu âm tính (-), sạch bệnh khảm lá mía.
- Kết quả đọc bằng máy đọc ELISA.

27


 Cách tính kết quả:
- Giá trị OD của mẫu = giá trị OD thô - giá trị OD trung bình của các giếng
Substrate.
- Mẫu dƣơng tính: Nếu giá trị OD của mẫu > giá trị ngƣỡng.
- Mẫu âm tính: Nếu giá trị OD của mẫu < giá trị ngƣỡng.
(Giá trị ngƣỡng = 2 x giá trị OD trung bình của các giếng đối chứng âm).
- Một số mẫu có giá trị OD gần ngƣỡng thì không chắc chắn là dƣơng tính vì vậy
cần đọc kết quả sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ để có đƣợc kết quả chính xác.
3.4.7. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng
Quan sát đồng ruộng, trên từng ruộng mía, với thời gian trồng và chặt sau khi thu
hoạch xong thì sự sinh trƣởng của các cây không đều, có cây cao, có cây thấp. Kiểm
tra các cây thấp chậm phát triển này có bị bệnh cằn mía gốc hay không bằng cách dùng
dao bén chặt dọc thân cây mía và quan sát sự đổi màu của các bó mạch.
 Chỉ tiêu quan sát
- Cây sinh trƣởng và phát triển chậm hơn bình thƣờng, nếu cây bị bệnh đứng gần
cây khỏe mạnh thì rất dễ dàng nhận diện.
- Có hay không sự đổi màu của các bó mạch bên trong thân cây mía.
- Đốt thân ngắn, đƣờng kính thân giảm so với bình thƣờng.
3.4.8. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng
phƣơng pháp nhuộm STM
Dịch nƣớc mía sau khi chiết đƣợc đem kiểm tra bằng kính hiển vi. Làm tiêu bản
mẫu dịch chiết nƣớc mía trên lam kính. Đậy lamen và quan sát vi khuẩn Lxx dƣới kính
hiển vi ở độ phóng đại là 1000 lần (xem dƣới giọt dầu). Vi khuẩn Lxx có hình gậy,
chiều rộng từ 0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm, nổi lên trên nền tối của kính hiển vi.
Cây mía đƣợc 10 tháng tuổi thì mới có thể kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp STM,
quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: Nhổ cây mía sau đó chặt sát gốc cắm vào dung dịch
thuốc nhuộm safranin (thành phần gồm Safranin 10%, cồn 96

O
và nƣớc cất). Để khoảng
30 phút lấy ra và gọt lấy phần ruột mía phía trong (cách gốc khoảng 5 cm). Gọt mỏng
ngang thân mía đem soi trên kính hiển vi ở độ phóng đại 40 - 100 lần, thu đƣợc kết quả
các mạch dẫn có màu đỏ hoặc màu vàng. Chỉ tiêu đánh giá nhƣ sau:
- < 70 % mạch đỏ: Giống nhiễm nặng.


28


- 70 – 84,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm trung bình.
- 85 – 99,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm nhẹ.
- 100 % mạch đỏ: Giống khỏe mạnh.
(Trích dẫn: Hà Đình Tuấn, 2004).
3.4.5. Phƣơng pháp nuôi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Lxx gồm các thành phần sau:
Thành phần hấp
- Nƣớc cất = 1000 ml
- Bacto agar = 17 g
- Pepton = 8 g
- K
2
HPO4 = 1 g
- KH
2
PO4 = 1 g
- MgSO
4
.7H

2
O = 0,2 g
Thành phần lọc
- Glucose = 0,5 g
- Methionine = 1 g
- Nalidixic acid = 0,01 g
- BSA = 2 g
- Cysteine = 0.1 g

Albumin huyết thanh bò, cysteine, methionine, nalidixic acid và glucose đƣợc lọc
vô trùng và thêm vào các thành phần môi trƣờng trên sau khi chúng đã đƣợc hấp vô
trùng (thêm vào khi nhiệt độ < 50
O
C), pH chỉnh về 6,6 với NaOH hay HCl.
Đổ môi trƣờng vào đĩa petri (khoảng 15 ml/đĩa). Cấy vi khuẩn bằng cách dùng pipet
hút 1ml mẫu dịch chiết nƣớc mía nhiễm bệnh đem cấy lên đĩa môi trƣờng. Dịch chiết
nƣớc mía nuôi cấy đƣợc chiết bằng cách đẩy khí và xác định sự hiện diện của vi khuẩn
Lxx bằng kính hiển vi và nhuộm STM. Dịch chiết sau đó đƣợc trải rộng khắp đĩa nhằm
mục đích thu đƣợc khuẩn lạc đơn lẻ cấy chuyền sang môi trƣờng khác. Mẫu dịch chiết
đƣa vào nuôi cấy đƣợc pha loãng ở mức độ 0 lần, 2 lần, 4 lần, 6 lần, 8 lần, và 10 lần. Đĩa
cấy sau đó đƣợc ủ ở 28
O
C trong thời gian 3 tuần. Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc vi
khuẩn hàng ngày.
 Chỉ tiêu theo dõi
- Thời gian hình thành khuẩn lạc Lxx trên môi trƣờng nuôi cấy (20-22 ngày).
- Khuẩn lạc Lxx sau 20 ngày nuôi cấy có màu trong suốt, kích thƣớc khuẩn lạc là
từ 0,1 – 0,3 mm (Davis, 1980).
- Kiểm tra hình dạng Lxx dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần.

29


3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx
 Phƣơng pháp chuẩn bị DNA mẫu cho PCR trực tiếp: Dịch chiết từ thân mía
(100 μl) đƣợc đem ly tâm 20.000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Dịch
lắng thu đƣợc rửa hai lần bằng nƣớc cất vô trùng (100 μl) trƣớc khi tái huyền
phù lại với nƣớc cất vô trùng (100 μl). Toàn bộ dung dịch đƣợc đun sôi trong
vòng 5 phút và làm lạnh nhanh trong vòng 10 phút. Một thể tích khoảng 2 μl
của dịch này đƣợc nhƣ mẫu để chạy phản ứng PCR
 PCR phát hiện Lxx dựa vào cặp mồi và quy trình của Stevens Brumbley
(2003) gồm các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt cho ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt
Sản phẩm PCR sau phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 1,5 % (w/v), với
ethidium bromide trong dung dịch đệm TAE 1X , hiệu điện thế là 90V trong 20 phút.
Chỉ tiêu đánh giá: Sự xuất hiện băng DNA khuyếch đại chuyên biệt (520 bp) của vi
khuẩn trên gel điện di.
 Thực hiện phản ứng PCR
- Thí nghiệm 1: PCR sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu, thành phần các chất
phản ứng, và chu kỳ nhiệt do S. Brumbley (2003) đƣa ra.
Hóa chất
Nồng độ
đầu
Nồng độ
cuối
Thể tích/
phản ứng( μl)
Chu kỳ nhiệt

Bufer
MgCl
2

dNTPs
Primer F
Primer R
PVP
Taq DNA
polymerase
DNA mẫu
H
2
O
10X
25 mM
25 mM
2,5 μM
2,5 μM


5U/1 μl
1X
3 mM
0,24 mM
0,25 μM
0,25 μM
1% w/v

1 U

2,5
3
0,24
2,5
2,5
2,5

0,2
2
9,56


96 – 5 phút – 1 chu kỳ
94 – 15 giây
57 – 30 giây 40 chu kỳ
72 – 30 giây
72 – 10 phút – 1 chu kỳ

Tổng thể tích 25 μl



30


- Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng pháp chuẩn bị mẫu: Biến
tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx.
Đo OD sản phẩm dịch chiết biến tính và thêm vào thành phần phản ứng
PCR
Lọc dịch chiết bằng màng lọc 0,4 μm trƣớc khi biến tính

Thực hiện li trích DNA Lxx trong dịch chiết theo quy trình ly trích vi khuẩn.
- Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả sử dụng của PVP trong PCR trực tiếp từ
dịch chiết nƣớc mía. Tăng nồng độ PVP trong phản ứng PCR lên 1,5 – 2 lần.
- Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần phản ứng và chu kỳ
nhiệt trong phản ứng PCR.
Tăng lƣợng mẫu DNA đƣa vào.
Tăng nồng độ primer.
Tăng nồng độ primer kết hợp với tăng nồng độ Taq polymerase.
Giảm nhiệt độ bắt cặp của primer xuống 2
O
C.
Giảm nồng độ MgCl
2
.
Giảm nồng độ MgCl
2
kết hợp với giảm nhiệt độ bắt cặp.
 Phƣơng pháp đổ gel agarose điện di
+ Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2%.
+ Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50 – 60
O
C, sau đó đổ vào
khuôn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc.
+ Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào 1×TAE.
+ Bƣớc 4: Hút 2 µl loading dye trộn với 4 µl mẫu.
+ Bƣớc 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4 µl mẫu + dung dịch đệm.
+ Bƣớc 6: Chạy điện di ở ở hiệu điện thế 90V/20 phút, cho đến khi thuốc
nhuộm cách đầu tận cùng của gel là 1 cm.
+ Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5 µg/ml)
trong 20 phút.

+ Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel dƣới vòi nƣớc chuyên dụng.
+ Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker.
+ Bƣớc 10: Chụp bản gel để lƣu lại kết quả.


31


Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA
Kiểm tra và phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên 6 giống mía sản
xuất và 10 giống nhập nội tại TTNCMĐ.
 Kiểm tra bằng phƣơng pháp nhìn trực tiếp bằng mắt thƣờng: quan sát sự đổi
màu của các giếng tuy nhiên trong 5 đĩa phân tích thì chỉ thấy giếng đối chứng
dƣơng xuất hiện màu vàng, còn tất cả các giếng còn lại đều không có màu. Kết
quả lập lại tƣơng tự sau khi kiểm tra lại sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ (hình 4.1).
- Kết luận: Tất cả các mẫu chẩn đoán đều âm tính (-) với SCMV.


A


B

Hình 4.1. Kết quả chẩn đoán SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA.
Chú thích: A: 2 giếng đối chứng dương có màu vàng
B: 2 giếng đối chứng âm không màu.
 Kiểm tra bằng máy đọc ELISA: Kết quả cho ra âm tính với tất cả các mẫu
phân tích, ngoại trừ đối chứng dƣơng (PC) là ra kết quả dƣơng tính (+). Kết

quả cho tƣơng tự khi đọc lại sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ.
- Kết luận: Tất cả các mẫu chẩn đoán đều âm tính (-) với SCMV.
Từ kết quả phân tích ELISA là âm tính cho tất cả các mẫu này, ta có thể kết luận
rằng, các giống mía đƣợc điều tra có kết quả âm tính với bệnh khảm lá mía. Điều này
chứng tỏ bệnh khảm lá mía không xuất hiện trên các giống khảo sát. Kết quả này cũng
phù hợp với những điều tra trƣớc đây về sự phân bố của bệnh là diễn ra ít hơn tại các
vùng nhiệt đới (Lê Lƣơng Tề, 1999), và thực tế là các cuộc khảo sát gần đây tại
TTNCMĐ đều cho kết quả là có rất ít giống bị bệnh khảm (Hà Đình Tuấn, 2004;


32


Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005). Kết quả góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm
lá mía trên các giống mía sản xuất khảo sát. Đặc biệt là, kết quả nghiên cứu có ý nghĩa
quan trọng trong công tác kiểm định các giống mía Thái Lan mới nhập nội năm 2005.
Theo kết quả kiểm tra ELISA thì tất cả các giống mía Thái Lan nhập nội đều không bị
nhiễm SCMV, từ đó cho phép tiến hành những nghiên cứu sâu hơn trong công tác lai
tạo và chọn giống để thu đƣợc các giống mới năng xuất cao và sạch bệnh. Tuy nhiên
kết quả trên vẫn chƣa khẳng định đƣợc trên tất cả các giống đã đƣợc kiểm tra ở trên
nói riêng và các giống mía khác tại TTNCMĐ nói chung là không bị nhiễm bệnh
đƣợc. Nguyên nhân có thể giải thích là do:
- Kỹ thuật ELISA chỉ có tác dụng định tính chứ không có tác dụng định lƣợng, do
đó nếu trong mẫu có hàm lƣợng virus tồn tại ở nồng độ thấp, không đủ độ nhạy
cho ELISA phát hiện thì kết quả khi phân tích ELISA sẽ là âm tính (-). Cho nên
kết quả ELISA này chỉ có ý nghĩa trong một mức độ giới hạn nào đó và để có kết
quả chính xác hơn cần tiến hành phân tích với số lƣợng mẫu nhiều hơn trong cùng
một giống cũng nhƣ kiểm tra bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT- PCR).
- Quá trình khảo sát chỉ giới hạn trong 16 giống mía gồm 6 giống sản xuất và 10
giống Thái Lan nhập nội tại TTNCMĐ, trong khi giống mía tại đây thì có rất

nhiều. Do vậy chƣa thể kết luận đƣợc toàn bộ các giống mía đƣợc trồng tại đây là
không bị nhiễm bệnh.
Do vậy để chứng minh chính xác tác nhân gây bệnh là SCMV cần phải có những
nghiên cứu sâu hơn bằng kỹ thuật sinh học phân tử, cụ thể là kỹ thuật RT - PCR. Để
tiến hành nghiên cứu này cần phải thực hiện ly trích RNA virus từ lá cây mía bị bệnh
khảm lá mía, sau đó tiến hành tổng hợp cDNA và thực hiện phản ứng PCR với cặp
mồi chuyên biệt đƣợc thiết kế nhằm phát hiện SCMV.
4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR
4.2.1. Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng
pháp nhuộm STM.
Công tác điều tra và phát hiện bệnh cằn mía gốc đƣợc thực hiện trên 6 giống mía
sản xuất tại TTNCMĐ và 5 giống mía tại nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp
quan sát dƣới kính hiển vi (Hình 4.2) và nhuộm màu STM (Hình 4.3).