Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 2 ppsx

20


Các chất đồng vị phóng xạ thƣờng dùng để đánh dấu mẫu dò là
32
P,
35
S và
3
H.
Trong đó
32
P đƣợc sử dụng nhiều nhất và nó phát tia ß có năng lƣợng rất cao nên tín
hiệu nhận đƣợc rõ. Nhƣng bên cạnh đó thì
32
P có hai nhƣợc điểm lớn là:
- Chu kỳ bán rã ngắn (15 ngày) nên phải sử dụng nhanh. Mẫu dò đƣợc đánh dấu
bằng
32
P không sử dụng đƣợc nhiều lần trong một thời gian dài dẫn đến chi phí cao.
- Do năng lƣợng rất cao của tia xạ nên tín hiệu nhận đƣợc không tinh mà
khuếch tán trên một vùng rộng.
35
S phát tia có năng lƣợng thấp lại có chu kỳ bán rã dài (2 – 3 tháng) nên giúp
giải quyết đƣợc nhƣợc điểm trên của
32
P nhƣng năng lƣợng do
35

S phát ra thấp nên ít
đƣợc sử dụng để đánh dấu mẫu dò.
Đối với một số phƣơng pháp đặc biệt nhƣ lai tại chỗ cần độ phân giải cao thì
ngƣời ta sử dụng
3
H để đánh dấu mẫu dò, mặc dù năng lƣợng do tia phát ra rất yếu
nhƣng bù lại tín hiệu phát ra rất tinh.
Nhìn chung, ƣu điểm của các đồng vị phóng xạ là có độ nhạy cao, cho tín hiệu
mạnh với thời gian phát sáng ngắn. Nhƣng chúng có nhƣợc điểm là có hại cho sức
khỏe của con ngƣời. Đặc biệt là
32
P phát tia có độ xuyên sâu nên đòi hỏi nhiều biện
pháp an toàn tốn kém trong thao tác và xử lý chất thải. Ngoài ra, các mẫu dò cũng
không thể dùng đƣợc trong một thời gian dài do chu kỳ bán rã của các đồng vị phóng
xạ.
Các probe đƣợc đánh dấu theo phƣơng pháp này thì các phân tử lai đƣợc phát
hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography).
B. Probe đƣợc đánh dấu bằng các chất hóa học khác
Việc sử dụng các chất hóa học khác để đánh dấu mẫu dò giúp khắc phục đƣợc
các nhƣợc điểm của việc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ. Tuy nhiên, ở đây lại vấp
phải vấn đề về độ nhạy thấp hơn các phƣơng pháp trƣớc. Hiện nay, chúng ta có các hệ
thống đánh dấu hóa học thông dụng nhất là:
Hệ thống sử dụng avidin (hay streptavidin) – biotin: đây là một cặp ligand có
hằng số ái lực cao nhất tìm thấy trong sinh học. Đầu tiên, mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng
biotin theo hai cách: biotin đƣợc gắn vào DNA nhờ phản ứng hóa học hoặc DNA đƣợc
tổng hợp từ những nucleotide có gắn biotin. Sau quá trình lai, biotin hiện diện trong



21

Hình 2.5: Cơ chế phát hiện probe
đánh dấu huỳnh quang
Hình 2.4: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu bằng biotin.
Hình a: Streptavidin có gắn với chất phát huỳnh quang, hình b: phát hiện
biotin kết hợp với khuếch đại tín hiệu (Tyramide signal amplification).
phân tử lai đƣợc phát hiện khi cho ligand của nó là avidin (hay streptavidin) vào phản
ứng. Avidin (hay streptavidin) trƣớc đó có gắn với một nhóm phát huỳnh quang hay
một enzyme xúc tác cho phản ứng tạo màu. Kết quả là những tín hiệu phát sáng hay tín
hiệu màu nhận đƣợc trên màng lai.


Hệ thống huỳnh quang: các probe đƣợc đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang
sẽ phát sáng khi quan sát dƣới tia UV (ultra violet). Cách đánh dấu này rất hữu ích khi
kiểm tra các mẫu vi khuẩn hoặc mẫu tế bào trực tiếp dƣới kính hiển vi. Thuận lợi của
hệ thống đánh dấu này là cùng một lúc ta có thể lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với
các chất phát huỳnh quang khác
nhau và các phân tử lai đƣợc
phát hiện cùng một lúc.
Hệ thống dùng kháng
thể: ngƣời ta dùng một nhóm
kháng nguyên gắn vào probe và
phát hiện sự hiện diện của probe
này bằng các kháng thể đặc hiệu. Các kháng thể này phải đƣợc đánh dấu bằng các tác
nhân đánh dấu nhƣ trên để nhận biết. Hệ thống này đƣợc dùng rộng rãi hiện nay nhất
là hệ thống đánh dấu bằng Digoxigenin – AntiDigoxigenin/Alkaline phosphatase (DIG

22


Hình 2.6: Cơ chế phát hiện phân tử lai có probe đƣợc đánh dấu với DIG.
Hình a: dùng một kháng thể; hình b dùng hai kháng thể trong đó Anti –
DIG là kháng nguyên của kháng thể thứ cấp.
– AntiDIG/AP). Nếu probe đƣợc đánh dấu bằng DIG – AntiDIG/AP thì các phân tử lai
đƣợc phát hiện bằng phản ứng tạo màu sau phản ứng. Ngƣời ta dùng cơ chất
NTB/BCIP (Nitroblue Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate) tạo phản
ứng với enzyme alkalin phosphatase có gắn trên AntiDIG, sau phản ứng tạo kết tủa
màu xanh khi nhìn dƣới kính hiển vi quang học. Trong một số quy trình, AntiDIG
không đƣợc gắn với enzyme nên muốn phát hiện tín hiệu sau khi lai ta phải nhờ vào
cộng hợp enzyme với kháng thể thứ cấp kháng lại AntiDIG.













Hệ thống sử dụng Enzyme: Trƣớc hết mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng alkaline
phosphatase hay horseradish peroxidase (DNA và các enzyme này hình thành một
phức hợp bền vững). Sau quá trình lai, ngƣời ta cho màng lai tiếp xúc với một cơ chất
của hai enzyme và cơ chất đó có khả năng phát sáng khi bị biến đổi. Ánh sáng phát ra

sẽ in dấu ấn lên một phim và kết quả thu nhận là những chấm trên phim.
Hệ thống dùng chất phát quang bằng phản ứng hóa học: ngƣời ta dùng các chất
hóa học có khả năng phát sáng để đánh dấu vào probe và phát hiện chúng bằng cách
đo ánh sáng phát ra bằng một máy đo đặc hiệu.



23


Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc
thể của nấm Thinopyrum
ponticum
Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc



II.5.6 Các phƣơng pháp lai tại chỗ ISH
II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để
phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái
tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen.
Ngân hàng gen (tức tập hợp các
dòng vi khuẩn tái tổ hợp) đƣợc trải trên
mặt thạch của đĩa petri. Sau khi các khuẩn
lạc đạt kích thƣớc xác định, ngƣời ta thu
lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một
màng lai lên mặt các khuẩn lạc. Trƣớc khi
thực hiện thao tác này, cả đĩa thạch và
màng lai đều phải đƣợc đánh dấu trƣớc để

làm căn cứ đọc kết quả sau này. Khi áp
màng lai lên mặt các khuẩn lạc, mỗi khuẩn
lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng
lai. Màng lai sau đó đƣợc xử lý bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính
DNA. Việc cố định DNA trên màng lai và thao tác lai diễn tiến theo các bƣớc tƣơng tự
nhƣ các phƣơng pháp lai trên pha rắn nhƣ Southern Blot và Northern Blot. Kết quả
phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm trên đĩa petri ban
đầu. Dòng vi khuẩn này sau đó đƣợc thu nhận và thực hiện các phân tích khác.
II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể
Phƣơng pháp lai này cung cấp những thông tin
chính xác về vị trí và sự phân bố của một trình tự
DNA cần tìm trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dò
(probe) chuyên biệt.



24


Các nhiễm sắc thể thƣờng có nguồn gốc từ các bạch cầu ở giai đoạn trung kỳ
đƣợc xử lý bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame. Sau công đoạn loại bỏ RNA bằng
RNase và loại bỏ protein bằng Proteinase K, nhiễm sắc thể cố định trên lame đƣợc
đem lai với probe có đánh dấu phóng xạ. Trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi để phát hiện
phân tử lai, ngƣời ta phủ lên lame một huyền dịch nhạy cảm với tia xạ. Sau một thời
gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch, lame đƣợc đem quan sát dƣới kính hiển vi.
Kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử
lai.
II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô
Trong tế bào và mô, các DNA và RNA đặc biệt là các mRNA có sự phân bố
không gian xác định. Sự phân bố không gian này liên quan đến chức năng, sự điều hòa

biểu hiện cũng nhƣ tƣơng tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô.
Nghiên cứu trên DNA và RNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các
thông tin vừa kể. Trong trƣờng hợp đó ngƣời ta thƣờng hay sử dụng phƣơng pháp lai
trên tế bào và mô.
Mô đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp mô học (cố định, khử nƣớc, tẩm paraffin,
cắt thành từng lát mỏng, đính trên lame) và dùng để thực hiện lai. Thao tác xử lý mẫu
lai và phát hiện phân tử lai tƣơng tự nhƣ lai trên nhiễm sắc thể. Kết quả đƣợc đọc trực
tiếp trên lame nhờ kính hiển vi quang học.
Phương pháp này được sử dụng trong các trường hợp sau:
Đối tƣợng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác
nhau nhƣ não bộ. Ở đây ngƣời ta có thể định chính xác vị trí và sự phân bố của một
DNA hay mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức. Các thông tin này sẽ
góp phần vào việc xác định vai trò của mRNA trong tổ chức đó.
Các phƣơng pháp miễn dịch tế bào cho phép phát hiện một protein chuyên biệt
thông qua kháng thể đặc trƣng của nó. Khi phối hợp phƣơng pháp miễn dịch tế bào và
lai tại chỗ, ngƣời ta sẽ phát hiện đồng thời mRNA và protein của nó. Từ đó xác định
đƣợc mối tƣơng quan giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen.



25


Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần nhƣ đồng nhất) với nhiều
mẫu dò khác nhau, ngƣời ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tƣơng tác giữa các
mRNA cùng tham gia vào một quá trình sống.
Hiện nay kỹ thuật đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất đã có nhiều tiến bộ rất lớn.
Điều này đã tạo những bƣớc nhảy vọt lớn cho các phƣơng pháp lai tại chỗ, đặc biệt là
cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác nhau do các mẫu dò đƣợc
đánh dấu bằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau.

II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH
Phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phƣơng pháp tạo dòng.
Định vị một gen xác định trên nhiễm sắc thể.
Nghiên cứu sản phẩm phiên mã và dịch mã của một gen xác định trong mô hay
tế bào, từ đó giúp ngƣời ta chẩn đoán đƣợc các bệnh nguy hiểm trên ngƣời nhƣ bệnh
ung thƣ, bệnh viêm gan…Đây là một hƣớng ứng dụng rộng rãi nhất của phƣơng pháp
ISH.
II.5.8 Một số nghiên cứu trƣớc đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng
dụng phƣơng pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản
II.5.8.1 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng và Taura
Mở đầu là công trình nghiên cứu về loại mô đích của virus gây bệnh đốm trắng
do Lo và ctv thực hiện. Họ đã gây nhiễm nhân tạo virus gây bệnh đốm trắng WSBV
(White spot baculovirus) trên tôm sú và đạt tỷ lệ nhiễm 100%. Sau 40 giờ nhiễm, họ
phát hiện virus gây bệnh bằng phƣơng pháp In Situ hybridization và xác định đƣợc
mang và gan tụy là cơ quan đích của virus này. Các kết luận sau đó cho rằng mô đích
của virus đốm trắng chính là các mô có nguốn gốc trung bì (Lo và ctv, 1996).
Một nghiên cứu khác của nhóm là sử dụng kỹ thuật PCR, Dot Blot và Southern
Blot để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng cũng thu đƣợc nhiều kết quả tốt (Lo và ctv,
1996).
Arun K. Dhar, Michelle M. Roux và Kurt R. Klimpel (2001) đã sử dụng kỹ
thuật Real – Time Quantitative PCR và SYBR Green Chemistry để phát hiện và định
lƣợng WSSV nhiễm trên Penaeus sp. Qua kết quả nghiên cứu này, các nhà khoa học



26


đã xác định đƣợc phƣơng pháp SYBR Green PCR phát hiện virus đốm trắng nhanh,
nhạy và định lƣợng đƣợc lƣợng virus nhiễm vào tôm chính xác nhất.

Các nghiên cứu về bệnh Taura và virus TSV thì tƣơng đối ít hơn, Nunan L.M.,
Poulos B.T., Lightner D.V, 1998 đã dùng kỹ thuật RT – PCR để phát hiện virus TSV.
Trong thí nghiệm này, họ đã sử dụng primer tạo ra từ một đoạn cDNA trên genome
của TSV và khuếch đại đƣợc một gen có kích thƣớc 231 bp. Bằng kỹ thuật này, nhóm
nghiên cứu đã phát hiện đƣợc TSV khi gây nhiễm thực nghiệm trên P. vannamei và P.
stylirostris. Một nhóm nghiên cứu khác gồm Erickson H.S., Zarain-Herzberg M.,
Lightner D.V. đã thực hiện nghiên cứu các phƣơng pháp khác nhau để chẩn đoán và
phát hiện TSV trên tôm thẻ nói chung. Qua thí nghiệm này nhóm đã đƣa ra các
phƣơng pháp hiện nay có thể áp dụng để chẩn đoán TSV nhƣ RT – PCR, Western blot,
Immuno – dot blot, Immunohistochemistry và In Situ hybridization (11 – 2002).
II.5.8.2 Ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật
nuôi thủy sản
Trong thủy sản mà đặc biệt là chẩn đoán các mầm bệnh nguy hiểm trên tôm,
ngoài các biện pháp truyền thống đã đƣợc áp dụng trƣớc đây thì ISH đã phát huy đƣợc
thế mạnh của một phƣơng pháp chẩn đoán mới, hiệu quả cao. Một loạt các thí nghiệm
đã đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp ISH nhƣ phân biệt các dòng Baculovirus BP
– type khác nhau (Durand S., Lightner D.V., Bonami J.R., 1998); phát hiện
Piscirickettsia salmonis trên họ cá hồi (Venegas C.A., Contreras J.R., Larenas J.J. và
Smith P.A., 2004); phân tích quần thể vi khuẩn cộng sinh với loài chình nuôi và đã
xác định đƣợc 27 dòng Vibrio spp (Moreno Y., Arias C.R., Meier H., Garay E., Aznar
R., 1999); phát hiện Macrobrachium rosenbergii nodavirus trên tôm càng xanh (Sri
Widada J., Durand S., Cambournac I., Richard V., Bonami J.R. và ctv, 2003); phát
hiện virus đốm trắng gây nhiễm thực nghiệm trên tôm he, cua và tôm hùm (Poh-Shing
Chang, Hsiao-Chao Chen, Yu-Chi Wang, 1998)…
II.5.9 Xu hƣớng phát triển của phƣơng pháp này
Hiện nay, phƣơng pháp ISH đã đƣợc ứng dụng rộng rãi và đã đƣợc phát triển
thêm một bƣớc mới, ngƣời ta có thể đồng thời phát hiện nhiều trình tự đích khác nhau
trên cùng một mẫu mô hoặc tế bào bằng cách lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với
nhiều tác nhân khác nhau. Các tín hiệu sau khi lai sẽ đƣợc phát hiện dựa vào các phản

27


ứng tạo màu khác nhau. Nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp dùng nhiều probe này là
các trình tự đích này nằm trùng với nhau trên mẫu mô nên rất khó khăn khi phân biệt,
làm sao để phân biệt các tín hiệu tạo ra do nhiều probe cùng liên kết với cùng một vị
trí trên mô. Để khắc phục đƣợc nhƣợc điểm này, ngƣời ta gắn các chất nhuộm huỳnh
quang vào các probe, các chất nhuộm huỳnh quang này phát ra tín hiệu ở các bƣớc
sóng khác nhau, dựa vào đó ngƣời ta phát hiện các probe sau khi lai (Paddock, 2001).
CHƢƠNG III
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ
NGHIỆM
III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm
 Thời gian thực hiện thí nghiệm từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005.
 Địa điểm thực hiện thí nghiệm tại phòng Mô học Trung Tâm Quốc Gia Quan
Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ
(TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB) trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy
Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh.
III.2 Vật liệu sinh học
1. Đối tƣợng thí nghiệm là P. monodon và P. vannamei ở các dạng sau:
Tôm thƣơng phẩm
Tôm giống Postlarvae
2. Các mẫu tôm sú P. monodon đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác định
dƣơng tính với WSSV.
3. Các mẫu tôm TCT P. vannamei đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác định
dƣơng tính với TSV.
4. Các mẫu tôm sú và TCT ở dạng postlarve hay thƣơng phẩm có các dấu hiệu
bệnh lý đƣợc lấy từ các trại giống và các ao nuôi thƣơng phẩm ở các tỉnh ĐBSCL và

Phú Yên. Các mẫu này đƣợc thực hiện chẩn đoán đồng thời ba phƣơng pháp mô học,
PCR và ISH.
III.3 Hóa chất thí nghiệm
III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ



28


Đệm PBS đậm đặc 10 lần (10X PBS Buffer)
Proteinase K (dạng bột)
Đệm PBS 1 lần (1X PBS Buffer)
Đệm PBS/Glycine đậm đặc 10 lần (10X PBS/Glycine Buffer)
Dung dịch lai (Hybridization Solution)
Đệm SSC đậm đặc 30 lần (30X SSC Buffer)
Dung dịch đệm ngăn ngừa phản ứng dƣơng tính giả đậm đặc 10 lần (10X
Blocking Buffer)
Dung dịch kháng Digoxigenin (Anti – Digoxigenin/AP Conjugate Solution)
Đệm TBS đậm đặc 10 lần (10X TBS Buffer)
Dung dịch phát triển màu (Development Solution)
Đệm dừng phản ứng (Stop Buffer)
Mẫu đối chứng dƣơng
Mẫu đối chứng âm
Trong đó, thành phần của dung dịch lai gồm:
Probe đánh dấu DIG (Digoxigenin)
SSC 4X (Sodium Chloride/Sodium Citrate) buffer
Formamide 50%
Denhardt’s (Bovine Serum Albumin, Ficoll 400, PVP)
Dextran Sulfate 5%

DNA cá hồi 0,5 mg/l
Thành phần bộ kit chẩn đoán WSSV và TSV hầu nhƣ giống nhau chỉ khác nhau
ở thành phần của dung dịch lai. Đối với bộ kit chẩn đoán WSSV, dung dịch lai chứa
probe đặc hiệu cho virus gây bệnh đốm trắng và bộ kit chẩn đoán TSV thì dung dịch
lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh Taura.
III.3.2 Hóa chất cần thiết nhƣng không có trong bộ kit chẩn đoán



29


Cồn tuyệt đối, xylene hoặc chất thay thế xylene, nƣớc cất hai lần, chloroform,
paraffin, formalin, formaldehyde 37%, acid acetic nguyên chất, paraformaldehyde
dạng bột, Bismark Brown Y dạng bột, keo dán (Boume du Canada).
Các loại hóa chất này mua từ công ty Prolabo và Merck, có độ tinh khiết cao.
III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
III.4.1 Thiết bị thí nghiệm
Máy xử lý mẫu tự động, bình rót paraffin, Electrothermal, bàn lạnh, máy cắt
mẫu Microtome, bể nƣớc ấm có chỉnh nhiệt độ, bàn ấm cố định mẫu trên lame kính, tủ
ấm có chỉnh nhiệt độ, buồng ẩm chuyên dụng cho lai tại chỗ Slide Moat, tủ lạnh âm
20
0
C và tủ mát 4
0
C – 7
0
C, kính hiển vi quang học.
III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm
Cassette chứa mẫu có nắp đậy, khung inox dùng để đúc mẫu, lame và lamelle,

ống eppendorf, bếp điện và nồi cách thủy, nhiệt kế, cân phân tích, hủ nhuộm mẫu,
micropipette loại có thể tích 10 – 100 µl và 100 – 1000 µl, tip có đầu lọc 100µl và
1000 µl, các loại pipette có thể tích 1ml, 5 ml, 10 ml, giấy lọc Whatman #1, lame
dƣơng và các dụng cụ cần thiết khác.
III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit
III.5.1 Chuẩn bị hóa chất
Pha loãng các hóa chất có trong bộ kit về nồng độ làm việc nhƣ PBS 1X,
PBS/Glycine 1X, SSC 2X, SSC 1X, SSC 0,5X, Blocking buffer 1X, TBS 1X, Stop
buffer 1X, cồn 95%, cồn 80%, cồn 50%. Tất cả các dung dịch trên đƣợc pha loãng
trong nƣớc cất hai lần.
Chuẩn bị Proteinase K bằng cách dùng pipette hút 1 ml đệm PBS 1X có sẵn
trong bộ kit cho vào lọ Proteinase K nguyên chất rồi hút 1 ml của lọ Proteinase K cho
vào lọ đựng đệm PBS 1X, trộn hai hóa chất này hòa đều vào nhau. Sau cùng ta phân
dung dịch vừa thu đƣợc vào các eppendorf và trữ ở -20
0
C, 1 ml cho mỗi eppendorf.
Pha dung dịch paraformaldehyde 0,4% bằng cách thêm 0,2 gram bột
paraformaldehyde vào 50 ml đệm PBS 1X, khuấy đều dung dịch ở 37
0
C cho đến khi
nào paraformaldehyde hòa tan hoàn toàn. Sau đó trữ dung dịch ở 2 – 7
0
C và dùng
trong 2 tuần.



30

Pha dung dịch Bismark Brown Y 0,5% bằng cách thêm 0,5 gram bột Bismark
Brown Y vào 100 ml nƣớc cất, hòa tan bột rồi lọc qua giấy Whatman#1. Trữ dung
dịch này trong bình xám ở nhiệt độ phòng.
Các dung dịch PBS 1X, PBS/Glycine 1X, TBS 1X, Stop buffer 1X, Blocking
buffer 1X, paraformaldehyde 0,4% trữ ở 2 – 7
0
C dùng trong 2 tuần. Cồn đã pha loãng
và các dung dịch SSC có thể giữ đƣợc một tháng ở nhiệt độ phòng.


III.5.2 Chuẩn bị mẫu
III.5.2.1 Cố định mẫu
Mẫu tôm tiến hành thí nghiệm là tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm. Mẫu tôm
dùng để phân tích phải còn sống hoặc đang còn trong tình trạng hấp hối.
 Để phát hiện WSSV thì mẫu tôm phải đƣợc cố định trong dung dịch Davidson,
thành phần gồm:
Cồn 95% 330 ml
Formalin 220 ml
Acid acetic glacial 115 ml
Nƣớc cất 335 ml
 Để phát hiện TSV thì mẫu tôm phải đƣợc cố định trong dung dịch không acid
R-F (RNA – friendly):
Formaldehyde 37% 349ml
Cồn 95% 407 ml
Nƣớc cất 244 ml
Chỉnh pH = 7
Ngâm mẫu cố định từ 12 – 24 giờ, sau đó lấy mẫu ra khỏi dung dịch cố định,
rửa với nƣớc 1 – 2 giờ và đem xử lý mẫu.
III.5.2.2 Cách xử lý mẫu: Mẫu sau khi rửa, ta tiến hành xử lý theo quy trình sau:

31



Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý mẫu trƣớc khi thực hiện chẩn đoán
Tổng thời gian xử lý mẫu: 12,5 giờ
Paraffin đƣợc dùng trong quy trình xử lý mẫu này là hỗn hợp với sáp ong theo
tỷ lệ 5 paraffin : 1 sáp ong.
III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin
Đặt mẫu đã xử lý vào khuôn inox, dùng bình rót paraffin (5 paraffin : 1 sáp
ong) vào khuôn chứa mẫu, cố định các mẫu sao cho nó nằm yên dƣới đáy và tách rời
nhau. Sau đó đặt khuôn inox chứa mẫu và paraffin lên bề mặt của dụng cụ làm lạnh,
đợi khuôn lạnh khối paraffin chứa mẫu đã cứng và tách khối paraffin ra khỏi khuôn.
III.5.2.4 Cắt mẫu
Dùng máy cắt Microtome cắt mẫu thành từng lát dày 5 – 6 m. Mẫu cắt đƣợc
trải lên lame, nhỏ vài giọt cồn 70% lên mẫu rồi cho mẫu qua bể chứa nƣớc 40
0
C để
làm căng bề mặt mẫu. Sau đó đính mẫu lên lame dƣơng và giữ ấm ở 40
0
C trong 4 – 6
giờ mới thực hiện chẩn đoán.
III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit
III.5.3.1 Ngày thứ nhất
Cố định lát cắt mô trên lame kính bằng cách ủ lame ở 60
0
C trong 30 phút.
Xử lý mẫu trƣớc khi lai

 Dùng xylene để khử paraffin trong mẫu, loại bỏ xylene trong mẫu bằng
cồn tuyệt đối. Sau đó, ta giảm dần độ cồn và rửa lại nƣớc cất nhiều lần để đảm bảo
mẫu tinh sạch.
Cồn 70%
30 phút
Cồn 95% (1)
30 phút
Cồn tuyệt đối (3)
30 phút
Cồn 95% (2)
30 phút
Cồn 95% (3)
30 phút
Cồn tuyệt đối (1)
30 phút
Cồn tuyệt đối (2)
30 phút
Chloroform (1)
1,5 giờ
Chloroform (2)
1,5 giờ
Paraffin (1)
3 giờ
Paraffin (2)
3 giờ



32

 Sau đó tiến hành xử lý mẫu với PBS 1X, tạo điều kiện cho Proteinase K
hoạt động tốt.
 Dùng enzyme Proteinase K để xử lý mô, phân hủy màng tế bào và màng
nhân vì enzyme này chỉ có khả năng phân cắt protein có trong mẫu mô đã cố định trên
lame và không ảnh hƣởng gì đến acid nucleic trong mẫu.
 Rửa mẫu với dung dịch PBS/Glycine 1X để loại bỏ các enzyme còn
thừa.
 Sau đó cho mẫu vào trong hủ nhuộm sạch có chứa paraformaldehyde
0,4%, ủ 10 phút ở 4
0
C giúp sợi DNA duỗi thẳng ra thuận lợi cho quá trình bắt cặp bổ
sung.
Tiến hành lai: Mẫu dò hay probe trong dung dịch lai trƣớc đó đã đƣợc biến tính
bằng cách đun 10 phút ở 95
0
C, làm lạnh nhanh và giữ lạnh ở 4
0
C. Sau đó, ta cho dung
dịch lai lên lame và biến tính mẫu mô ở 95
0
C trong 6 phút.
Phản ứng lai giữa hai thành phần trên xảy ra ở 42
0
C trong 12 – 18 giờ (ủ qua
đêm).

33


Xylene 5 phút,
lặp lại 3 lần
Thấm dung dịch trên lame nhƣng không đƣợc để khô mô
(Đối với tất cả các bước trong kỹ thuật này)
Hút lƣợng dung dịch
lai cần thiết vào tube
chịu đƣợc nhiệt độ
cao, đun dung dịch lai
trong 10 phút ở 95
0
C.
Sau đó cho ngay tube
vào khay nƣớc đá 4
0
C.
500 l Pro.K/lame
15 phút, ở 60
0
C
Dung dịch PBS
1X 5 phút, RT
Dung dịch PFA
0,4%/PBS 1X, 10
phút, 4
0
C

Dung dịch PBS
1X/glycine 5 phút, RT
1. Hút 75 l dung dịch lai/lame, đậy lamelle lại
2. Đặt lame lên bàn lai ở 95
0
C trong 6 phút
3. Tiếp tục cho lame vào phòng ẩm, ủ qua đêm ở 42
0
C
Mẫu trên lame ủ
60
0
C trong 30 phút
Cồn tuyệt đối 2 lần, 1 phút/lần
Cồn 95% 2 lần, 1 phút/lần
Cồn 80% 2 lần, 1 phút/lần
Cồn 50% 1phút 1 lần
Nƣớc cất 5 lần
Sơ đồ 3.2: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ nhất

III.5.3.2 Ngày thứ hai
 Sau bƣớc ủ lai ngày thứ nhất, mẫu trên lame kính đƣợc rửa dung dịch lai để loại
bỏ lƣợng mẫu dò thừa bằng một loạt dung dịch đệm Sodium Chloride/Sodium Citrate
có nồng độ giảm dần.
 Ủ mẫu với dung dịch Blocking buffer 1X, chất blocking trong dung dịch sẽ
khóa các phân tử lai không đặc hiệu lại.
 Ủ mẫu với dung dịch Anti – Digoxigenin (Anti – DIG) có gắn Alkaline
phosphatase (AP), Anti – Digoxigenin sẽ kết hợp với Digoxigenin theo nguyên tắc
phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Sau bƣớc này, những phân tử lai đặc hiệu giữa
DNA/RNA của mẫu đính trên lame và mẫu dò đƣợc gắn thêm Anti – DIG kết hợp với
enzyme Alkaline phosphatase.



34


Dung dịch SSC 2X 5 phút/lần, 2x
Dung dịch SSC 1X 5 phút/lần, 2x
Dung dịch SSC 0,5X 5 phút/lần, 2x

Dung dịch Blocking buffer 1X
1ml, 10 phút
Dung dịch Anti-DIG/AP
conjugated, 10 phút

Dung dịch TBS
1X 5 phút/lần, 2x
Dung dịch phát triển
màu 2 giờ, ủ trong tối
Dung dịch stop
buffer1X, 5 phút
Thuốc nhuộm Bismark Brown Y 0,5%, 60 giây
Rửa màu thừa bằng nƣớc cất.
Cồn 95% 1 phút, 3x
Cồn 99,5% 1 phút, 3x
Xylene 1 phút, 3x
Sơ đồ 3.3: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ hai
 Rửa mẫu với dung dịch TBS 1X để loại bỏ những phân tử Anti – DIG gắn AP
thừa.
 Ủ mẫu với dung dịch phát triển màu 2 giờ, trong tối ở nhiệt độ phòng.
 Kết thúc phản ứng hiện màu bằng dung dịch Stop buffer 1X.
 Nhuộm màu bổ sung bằng thuốc nhuộm Bismark Brown Y 0,5%, mẫu mô –
những vùng không có phân tử lai dƣới kính hiển vi quang học có màu vàng nâu. Rửa
sạch màu thừa bằng nƣớc cất hai lần. Chúng ta có thể quan sát kết quả lai dƣới kính
hiển vi quang học ngay sau bƣớc này. Nếu muốn giữ mẫu lâu thì tiếp tục cho lame mẫu
qua cồn 95%, cồn tuyệt đối, xylene và dán keo cytoseal 60.

III.6 Phƣơng pháp nghiên cứu
III.6.1 Phƣơng pháp thu mẫu
Mẫu đƣợc thu theo từng đợt ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và mẫu nhận
hàng ngày tại TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi
Trồng Thủy Sản II. Cách thu mẫu đƣợc tiến hành nhƣ sau:



35


Đối với tôm Postlarvae: Đối với tôm Postlarvae thu khoảng 100 con/bể, thu ở
nhiều nơi trong bể giống, sau đó trộn lại với nhau và thu khoảng 100 con cho trực tiếp
vào dung dịch cố định. Ngoài ra, chúng ta có thể dùng nƣớc ngọt hoặc formol gây sốc
tôm trong khoảng 10 – 15 phút, nồng độ formol 200 – 300 ppm, sau đó thu những con
yếu và chìm dƣới đáy. Mẫu sau khi thu đƣợc chia thành hai phần cho vào hai lọ chứa
dung dịch cố định khác nhau, một lọ có chứa cồn 95
0
C để làm PCR và lọ còn lại có
chứa dung dịch Davidson (đối với tôm sú) hoặc R-F (đối với TCT) để làm mô học và
In situ hybridization. Khi thu mẫu thì tôm còn sống hoặc đang trong tình trạng hấp hối
là tốt nhất.
Đối với tôm thƣơng phẩm: Đối với tôm lớn thu mẫu bằng cách lấy tôm sống
hoặc đang hấp hối, cắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó
có chứa mang và gan tụy), dùng dung dịch cố định (hai loại dung dịch: dung dịch cố

định cho PCR và dung dịch cố định chung cho cả mô học và ISH) tiêm vào gan tụy và
vùng xung quanh gan tụy. Lƣợng dung dịch cố định dùng từ 0,1 – 10 ml, thay đổi tùy
theo kích thƣớc tôm. Sau đó cho mẫu vào lọ có chứa dung dịch cố định tƣơng ứng. Số
tôm thu từ 5 – 10 con/ao.
Tỷ lệ hóa chất dùng cố định mẫu là hóa chất : mẫu = 10 : 1.
III.6.2 Bố trí thí nghiệm
Chẩn đoán theo quy trình bộ kit để ổn định phƣơng pháp.
Thay đổi một số bƣớc trong quy trình để đƣa ra một quy trình tối ƣu áp dụng
trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện.
Thí nghiệm để so sánh độ ổn định, độ chính xác và hiệu quả giữa phƣơng pháp
ISH vừa tìm đƣợc với mô học và PCR.
Các bố trí cụ thể nhƣ sau:
III.6.2.1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng
Penaeus vannamei
A. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm phƣơng pháp
Để thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT của phƣơng pháp
ISH, chúng tôi thực hiện thí nghiệm theo quy trình bộ kit đã nêu ở mục III.5 trên ba
mẫu tôm dƣơng tính với TSV, một đối chứng dƣơng và một đối chứng âm. Vì chúng



36


tôi không thu đƣợc những mẫu dƣơng tính điển hình nên thực hiện thí nghiệm này trên
các mẫu cũ, đƣợc lƣu lại trong phòng thí nghiệm mô học từ năm 2004. Các mẫu tôm
này dƣơng tính với TSV khi xét nghiệm bằng mô học và PCR, thực hiện thí nghiệm
lặp lại 2 lần.
B. Bố trí thí nghiệm để tìm quy trình ISH tối ƣu cho TSV trên Penaeus vannamei
Sau khi thực hiện thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT,

chúng tôi thực hiện một số thí nghiệm tiếp theo để tìm ra quy trình ISH tối ƣu cho
TSV trên TCT trong phòng thí nghiệm, các thí nghiệm đó là:
(a) Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu thích hợp
Chúng tôi thực hiện thí nghiệm này trên 10 mẫu tôm TCT đã đƣợc phƣơng
pháp mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV (5 mẫu tôm thƣơng phẩm và 5
mẫu postlarvae) và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Thí nghiệm
đƣợc bố trí lặp lại hai lần và thực hiện trên năm nghiệm thức sau:
Nghiệm thức I: probe và mẫu đƣợc biến tính chung trên lame ở 95
0
C trong 6
phút, thực hiện trong buồng ẩm.
Nghiệm thức II: probe đƣợc biến tính riêng ở 95
0
C trong 10 phút, làm lạnh đột
ngột và giữ lạnh ở 4
0
C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính
lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 80
0
C trong 6 phút.
Nghiệm thức III: probe đƣợc biến tính riêng ở 95
0
C trong 10 phút, làm lạnh đột
ngột và giữ lạnh ở 4
0
C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính
lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 70
0
C trong 6 phút.
Nghiệm thức IV: probe đƣợc biến tính riêng ở 95

0
C trong 10 phút, làm lạnh đột
ngột và giữ lạnh ở 4
0
C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính
lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 60
0
C trong 6 phút.
Nghiệm thức V: probe đƣợc biến tính riêng ở 95
0
C trong 10 phút, làm lạnh đột
ngột và giữ lạnh ở 4
0
C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính
lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 50
0
C trong 6 phút.
(b) Thí nghiệm tìm thời gian cắt thích hợp với Proteinase K
Ở đây, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai đối tƣợng là tôm postlarvae và
tôm thƣơng phẩm để tìm ra thời gian tối ƣu áp dụng trên từng đối tƣợng đó, mỗi đối
tƣợng thực hiện 5 mẫu và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Các mẫu



37


dùng trong thí nghiệm này đều đƣợc mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV.
Thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại hai lần và thực hiện trên 5 nghiệm thức sau: 11 phút, 13
phút, 15 phút, 17 phút và 19 phút.

(c) Thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai sử dụng tốt nhất
Nếu theo quy trình của bộ kit thì dùng thể tích dung dịch lai là 75 l/mẫu có
nồng độ probe là 1 – 2 ng/ml dung dịch lai. Vì trong khi thực hiện lai có biến tính
probe ở 95
0
C trong 10 phút, sau khi cho dung dịch lai đã biến tính lên mẫu rồi thực
hiện biến tính mẫu tiếp một lần nữa. Qua nhiều lần biến tính nhƣ vậy dung dịch lai có
thể bị hao hụt do hiện tƣợng bốc hơi. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm để tìm ra
thể tích dung dịch lai thích hợp nhất khi lai. Chúng tôi tiến hành trên 10 mẫu tôm TCT
đã đƣợc mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV (5 tôm postlarvae và 5 tôm
thƣơng phẩm) và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Thí nghiệm đƣợc
bố trí lặp lại 2 lần trên các nghiệm thức sau: 100 l, 75 l, 50 l.
III.6.2.2 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV trên tôm sú
Penaeus monodon
A. Bố trí thí nghiệm theo quy trình bộ kit ổn định phƣơng pháp
Chúng tôi thực hiện chẩn đoán theo quy trình bộ kit khuyến cáo đã nêu ở mục
III.5 trên 3 mẫu tôm (1, 2, 3) đã dƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác nhận là dƣơng
tính với WSSV và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm), thí nghiệm đƣợc
lặp lại 2 lần.
B. Bố trí thí nghiệm để tìm ra quy trình ISH tối ƣu áp dụng trong điều kiện
phòng thí nghiệm tại Viện
Trong phần bố trí này, chúng tôi thực hiện thí nghiệm có thay đổi một số chỉ
tiêu và hóa chất thông dụng để tìm ra quy trình ISH tối ƣu áp dụng trong điều kiện
phòng thí nghiệm tại Viện. Các thí nghiệm đƣợc thực hiện theo cách bố trí sau:
Bố trí 1: Chúng tôi lặp lại thí nghiệm theo quy trình bộ kit nhƣ mục III.5 để ổn
định phƣơng pháp, cũng thực hiện thí nghiệm trên ba mẫu 1, 2, 3 trên nhƣng có thay
đổi một số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit nhƣ cồn tuyệt đối, xylene và
paraformaldehyde mua của công ty Prolabo và Merck bằng cồn tuyệt đối, xylene và

38


paraformaldehyde do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất, nhằm giảm chi phí thực hiện
chẩn đoán và phù hợp điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm Mô học của Viện.
Bố trí 2: Chúng tôi tiến hành thay đổi một số chỉ tiêu trong quy trình chuẩn của
bộ kit ở mục III.5, mỗi chỉ tiêu cải tiến là một thí nghiệm. Các thí nghiệm đƣợc thực
hiện trên các mẫu tôm sú đã đƣợc mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với WSSV
và hai đối chứng kèm theo (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Các thí nghiệm đƣợc
bố trí nhƣ sau:














Bảng 3.1: Các thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV trong phòng thí
nghiệm
Số thí
nghiệm
Các chỉ tiêu cần cải tiến

Penaeus monodon
Số lần
lặp lại
Post
larvae
Thƣơng
phẩm



39


Cồn 70%
5 phút
Cồn 80%
5 phút
Cồn 95%
5 phút
Cồn tuyệt đối
(1) 5 phút
Cồn tuyệt đối
(2) 5 phút
Xylene (1)
5 phút
Xylene (2)
5 phút
Xylene (3)
5 phút
Sơ đồ 3.4: Quy trình xử lý mẫu nhanh

1.
Áp dụng quy trình xử lý mẫu
nhanh giảm thời gian
5 mẫu

5 mẫu


2

2.
Biến tính mẫu và probe đồng
thời trên lame trƣớc khi lai
5 mẫu
5 mẫu
2
3.
Kết hợp quy trình xử lý mẫu
nhanh với biến tính mẫu và
probe đồng thời trên lame trƣớc
khi lai
5 mẫu
5 mẫu
2
Trong đó:
(a) Quy trình xử lý mẫu:
Quy trình xử lý mẫu chuẩn theo bộ kit nhƣ đã nêu ở mục III.5.2.2 và sơ đồ 3.1.
Quy trình xử lý mẫu nhanh trong thí nghiệm: là quy trình đã đƣợc Bộ môn Mô
học TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng
Thủy Sản II áp dụng trong chẩn đoán mô học. Quy trình đƣợc thực hiện trong

microwave, ở nhiệt độ thấp khoảng 40 – 50
0
C và gồm các bƣớc sau:






Cả quy trình xử lý chỉ mất
khoảng 55 phút, sau khi xử lý xong ta ngâm mẫu trong paraffin khoảng 2 – 3 giờ, lấy
mẫu ra đúc và cắt bình thƣờng.
(b) Biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trƣớc khi lai
Biến tính mẫu và probe theo quy trình bộ kit: theo quy trình của kit thì probe
trong dung dịch lai đƣợc biến tính trƣớc ở nhiệt độ 95
0
C trong 10 phút, làm lạnh nhanh
và giữ ở 4
0
C cho đến khi cho lên mẫu lai. Khi lai, ta cho dung dịch lai có probe đã



40


đƣợc biến tính lên mẫu và thực hiện biến tính mẫu ở 95
0
C trong 6 phút, sau đó ủ qua
đêm ở 42

0
C để probe bắt cặp với trình tự đích trên mẫu.
Biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trong thí nghiệm: trong thí nghiệm
này, chúng tôi bỏ qua bƣớc biến tính probe trong dung dịch lai trƣớc khi lai. Khi thực
hiện lai, chúng tôi cho dung dịch lai có probe chƣa biến tính lên mẫu và thực hiện biến
tính đồng thời mẫu và probe ở 95
0
C trong 6 phút, sau đó ổn định nhiệt độ ở 42
0
C và ủ
qua đêm.
(c) Kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên
lame trƣớc khi lai
Trong thí nghiệm này chúng tôi thực hiện kết hợp hai quy trình trên trong chẩn
đoán WSSV bằng ISH.
III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh giữa phương pháp ISH với mô học và PCR
Trong phần bố trí này, mẫu có dấu hiệu bệnh sau khi thu về phòng thí nghiệm
đƣợc chia thành hai phần, một phần cố định trong cồn 95
0
để thực hiện chẩn đoán bằng
PCR; phần còn lại cố định trong dung dịch Davidson đối với tôm sú và cố định trong
dung dịch R-F đối với TCT và dùng để kiểm tra mô học và ISH. Thí nghiệm đƣợc bố
trí nhƣ sau:

Đối với bệnh Taura trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei
Bảng 3.2: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P. vannamei
Phƣơng
pháp
Cách cố
định mẫu
Số
mẫu
Penaeus
vannamei
Số lần
lặp lại
Kết quả
So sánh
kết quả



41


chẩn
đoán
Post
Larvae
Thƣơng
phẩm
Lần 1
Lần 2
Mô học

R-F
30
15
15
2



ISH
R-F
30
15
15
2


PCR
Cồn 95%
30
15
15
2



Đối với bệnh đốm trắng trên tôm sú Penaeus monodon
Bảng 3.3: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P. monodon
Phƣơng
pháp
chẩn

đoán
Cách cố
định mẫu
Số
mẫu
Penaeus
monodon
Số lần
lặp lại
Kết quả
So sánh
kết quả
Post
Larvae
Thƣơng
phẩm
Lần 1
Lần 2
Mô học
Davidson
30
15
15
2



ISH
Davidson
30

15
15
2


PCR
Cồn 95%
30
15
15
2








CHƢƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
IV.1 Kết quả trên tôm thẻ chân trắng P. vannamei
IV.1.1 Thí nghiệm thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng phƣơng pháp ISH



42


Hình 4.2: Đối chứng âm trên mang tôm

lớn, X10.
Hình 4.1: Đối chứng dƣơng trên
phụ bộ tôm lớn, X10.
Hiện nay, ISH là một phƣơng pháp khá mới đƣợc ứng dụng trong chẩn đoán
mầm bệnh trên tôm nuôi và phƣơng pháp này chƣa ứng dụng chẩn đoán mầm bệnh
TSV trên tôm TCT một cách phổ biến, nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm bƣớc đầu
ứng dụng phƣơng pháp ISH để chẩn đoán mầm bệnh do TSV và ổn định phƣơng pháp
này để ứng dụng trong chẩn đoán mầm bệnh trên tôm TCT. Thí nghiệm đƣợc tiến
hành theo bố trí trên và kết quả thu đƣợc ở hai lần thí nghiệm nhƣ sau:
Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng ISH
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
1
+
++
Kết quả lai không rõ ràng, hầu nhƣ không
có tín hiệu lai.
2
+
++
Kết quả lai không rõ ràng, hầu nhƣ không
có tín hiệu lai.
3
+
++
Có tín hiệu lai xuất hiện nhƣng rất mờ và ít
nên không kết luận đƣợc.
Đối chứng

dƣơng
+++
+++
Tín hiệu lai tƣơng đối rõ nhƣng rất ít và
không tập trung.
Đối chứng âm
-
-
Không có tín hiệu lai phát ra, mẫu rõ và
nhuộm màu thuốc nhuộm bổ sung.
Kết quả đƣợc đọc dƣới KHV quang học và cách đọc nhƣ sau:
Mẫu dƣơng tính: có các thể vùi kết tủa màu xanh đến đen trong tế bào chất,
những tế bào không bị nhiễm virus thì cấu trúc mô bình thƣờng và bắt màu thuốc
nhuộm bổ sung (màu cam).
Mẫu âm tính: không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y
(màu thuốc nhuộm bổ sung) và có màu cam sau quá trình lai.








43

Chú thích:
“+”: mức độ nhiễm bệnh tƣơng đối thấp (số tế bào bị nhiễm bệnh dƣới 30% số
tế bào quan sát trong mẫu).
“++”: mức độ nhiễm bệnh trung bình (số tế bào bị nhiễm bệnh lớn hơn 30%
nhƣng nhỏ hơn 60% số tế bào quan sát trong mẫu).
“+++”: mức độ nhiễm bệnh cao (số tế bào bị nhiễm bệnh lớn hơn 60% số tế bào
quan sát trong mẫu).
“-“: không phát hiện tác nhân gây bệnh.
KHV: kính hiển vi
Qua hai lần thực hiện thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng kết quả lai thu đƣợc
chƣa đƣợc tốt và không ổn định. Các tín hiệu lai thu đƣợc trên lame rất mờ nhạt và
không tập trung nên rất khó trong việc kết luận. Hiện tƣợng này có thể do các nguyên
nhân nhất định. Thứ nhất, vì chúng tôi không thu đƣợc những mẫu tôm bệnh điển hình
nên phải sử dụng những mẫu tôm lƣu lại của phòng thí nghiệm mô học. Mẫu đƣợc lƣu
trong thời gian một năm nên một số tính chất ban đầu của mẫu không còn giữ đƣợc
nữa, cấu trúc mô bị biến dạng,… nên khi thực hiện lai nhƣ trên, những mẫu này sẽ thu
đƣợc những kết quả không tốt. Thứ hai, cũng có thể lƣợng RNA đã bị mất trong quá
trình bảo quản mẫu và trong khi thực hiện lai. Điều này có thể xảy ra vì trƣớc đây ba
mẫu này đƣợc cố định trong dung dịch Davidson để làm thí nghiệm mô học và chúng
tôi đã dùng ba mẫu này để thực hiện ISH. Theo Hasson và ctv (1997), trong dung dịch
Davidson có mặt acid acetic, chính acid này sẽ phân hủy dần lƣợng RNA trong mẫu
sau một thời gian nhất định nên ta có thể không nhận đƣợc tín hiệu lai từ mẫu, mặc dù
mẫu dƣơng tính với TSV. Do đó trong các thí nghiệm sau này chúng tôi sử dụng dung
dịch cố định mẫu không có mặt acid (dung dịch RNA – friendly) để khắc phục nhƣợc
điểm trên. Ngoài ra, lƣợng RNA trong mẫu cũng có thể bị mất đi trong khi thực hiện

44


lai, ở giai đoạn biến tính mẫu ở 95
0
C trong 6 phút. Vì TSV là virus mang vật chất di
truyền là RNA mạch đơn nên khi ta biến tính mẫu ở 95
0
C có thể làm phân hủy hoàn
toàn cấu trúc RNA nên probe không tìm thấy trình tự đích để bắt cặp và tạo tín hiệu
sau khi lai. Bên cạnh đó, lƣợng RNA có thể mất đi do các dung dịch lai và dung dịch
rửa có mặt RNase, enzyme này có tác dụng phân cắt RNA trong mẫu mô, nhƣng lý do
này rất ít xảy ra vì các hóa chất mà chúng tôi sử dụng đều có trong bộ kit ISH chẩn
đoán mầm bệnh TSV do công ty DiagXotics của Mỹ cung cấp.
Ngoài ra, khi chúng tôi thực hiện lai trên đối chứng dƣơng của bộ kit thì các tín
hiệu lai không nhiều và rải rác. Ngƣời ta thực hiện đối chứng dƣơng bằng cách gây
nhiễm tôm thẻ chân trắng với virus Taura liều cao, rồi thu lấy các cơ quan nhƣ phụ bộ,
gan tụy, dạ dày, mang…cố định, đúc, cắt và đính lên lame dƣơng. Theo lý thuyết, các
tín hiệu lai nhận đƣợc trên đối chứng dƣơng phải nhiều, rõ ràng và tập trung chứ
không phải rất ít nhƣ trong kết quả mà chúng tôi thu đƣợc, kể cả lần thí nghiệm thứ
hai. Điều này khẳng định một lần nữa có thể lƣợng RNA của mẫu đã bị phân hủy trong
quá trình lai, ở giai đoạn biến tính mẫu.
Trên đối chứng âm, mẫu rất rõ và không bị nhiễm bẩn chứng tỏ quá trình lai
đƣợc thực hiện rất tốt và không bị ngoại nhiễm.
Qua kết quả mà chúng tôi nhận đƣợc nhƣ trên và những lý do đã đƣợc đƣa ra
nhƣ vậy, chúng tôi tiến hành một loạt các thí nghiệm khác để ổn định phƣơng pháp lai
áp dụng trong chẩn đoán mầm bệnh TSV.
IV.1.2 Kết quả thí nghiệm ổn định phƣơng pháp ISH trên P. vannamei
IV.1.2.1 Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu khi lai
Do mẫu và probe mà chúng tôi sử dụng khác nhau hoàn toàn về bản chất, mẫu

chứa RNA mạch đơn và probe là cDNA mạch đôi nên chúng tôi cần thử nghiệm để
tìm ra nhiệt độ biến tính mẫu tối ƣu cần thiết khi lai. Chúng tôi thực hiện thí nghiệm
nhƣ trên và thu đƣợc kết quả qua hai lần thực hiện nhƣ sau:

Kết quả trên tôm postlarvae
Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu trên tôm postlarvae
Nghiệm
thức
I
II
III
IV
V