Luận văn : ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) part 2 docx

13

Montero và Austin (1999 ) cho rằng lipopolysaccharide có thể hình thành nên độc tố
gây chết của V. harveyi dòng E2 đối với tôm.
Nhìn chung hemolysin của vi khuẩn đã được coi là yếu tố quan trọng của các
Vibrio gây bệnh bằng cách gây nhiễm trùng máu và tiêu chảy ở vật chủ (Zhang, 2001).
2.2.2. Dấu hiệu bệnh
Cần phân biệt rõ sự phát triển bệnh trên tôm. Nếu trong bể tôm có các đốm sáng
lớn trên những con tôm chết, đó là do các tập đoàn Coccobacilli tấn công vào các con
gây chết phát sáng, hiện tượng lâm sàng này không quan trọng. Khi nước biển xử lý
không tốt sẽ thường gặp hiện tượng này. Nếu phát sáng trên các con sống, đốm sáng
rất nhỏ bên trong cơ thể của tôm thì đó là bệnh do V. harveyi và V. splendidus gây nên
(Phạm Văn Tình, 2000).
 Dầu hiệu bên ngoài
Dấu hiệu để nhận biết tôm bị bệnh phát sáng là: tôm yếu lờ đờ, kém bắt mồi
hoặc bỏ ăn, có màu sậm hoặc trắng đục. Màu sắc cơ thể đôi khi chuyển sang màu
hồng. Tôm bơi nổi, tấp mé, phát sáng phần đầu ngực hay toàn thân (quan sát đuợc
trong bóng tối), có thể nhiễm 100% đàn tôm. Tôm bệnh có thể bị đóng rong ở mang và
vỏ, gan tôm bị teo lại, sẫm màu, tôm chậm lớn. Tôm có thể bị chết rải rác (10 – 20%)
và có thể tăng lên nếu trong giai đoạn 45 ngày nuôi đầu tiên (Đỗ Thị Hòa và ctv,
2001).
Khi tôm nhiễm khuẩn toàn thân, thì tỷ lệ chết có thể lên đến 100% (Lý Thị
Thanh Loan, 1999). Ấu trùng có thể chết từ rải rác tới hàng loạt đặc biệt ở giai đoạn
tiền ấu trùng (Zoae, Mysis) (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001).
 Dấu hiệu mô học
Tôm bị bệnh nặng, soi dưới kính hiển vi mẫu xoang bạch huyết và mẫu ruột
thấy dày đặc những vi khuẩn di động, cơ quan chủ yếu nhiễm khuẩn là gan tụy (Lý Thị
Thanh Loan, 1999).
14

Tôm giống dưới 45 ngày nuôi bị nhiễm bệnh phát sáng có biểu hiện tế bào ống

bên trong gan tụy bị phá hủy. Chỗ lõm giữa các tế bào hình ống bị bịt kín bởi các bạch
cầu và các tế bào sợi. Tế bào biểu mô bị hoại tử và vi khuẩn tập trung từng đám trong
Lumen. Quan sát ở những tôm nhỏ hơn thì thấy sự phá hủy ở các mô nhiều hơn (Lý
Thị Thanh Loan, 1999).
2.2.3. Điều kiện phát sinh bệnh
Bệnh phát sáng trên tôm thường xảy ra trong tất cả các giai đoạn (Đỗ Thị Hòa
và ctv, 2001).
Vibrio phát sáng xâm nhập vào bể ương qua trứng tôm, tôm mẹ, thức ăn và
dụng cụ sản xuất. Bệnh có thể lây nhiễm từ các trại giống, ao ương sang ao nuôi thịt.
Phát triển mạnh trong những ao có hàm lượng chất hữu cơ cao, chất thải đáy ao tích tụ
nhiều. Thường thấy ở những vùng có độ mặn cao, phát triển mạnh nhất ở độ mặn 30 –
35‰. Ở dưới 5‰ hầu như không thấy bệnh này xuất hiện. Bệnh có thể xuất hiện ở pH
từ 7,5 – 9, bệnh có thể xuất hiện khi mất tảo đột ngột hay do môi trường biến động
mạnh Các vi khuẩn gây bệnh có thể có trong nguồn nước cấp vào ao nuôi (Harris và
ctv, 1996).
2.2.4. Khu vực phân bố bệnh
Bệnh phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới. Đặc biệt tại các trại sản xuất tôm
giống. Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lan cho thấy
vi khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vi khuẩn ở vùng
cửa sông và vùng nước lợ. Điều này được chứng minh từ kết quả phân lập vi khuẩn
của các mẫu nước cấp vào và thải ra cũng như các mẫu bùn trong hệ thống ao nuôi
tôm có nguồn nước cấp từ vùng duyên hải (Fraser, 2005).
Theo một số tài liệu của Phillipine, Thái Lan và Indonesia, Vibrio gây bệnh
phát sáng cũng được tìm thấy trong nước biển vùng ven bờ, nhất là những nơi có hàm
lượng chất hữu cơ cao và có nhiều xác động thực vật chết sau chu kỳ “nở hoa”. Số
lượng vi khuẩn Vibrio thường tăng vọt trong và sau mùa mưa, nhất là các tháng 10 –
15

12. Vì vậy vùng gần bờ biển cũng được xem là nguồn nhiễm chính (Lavilla – Pitogo
và ctv, 1998).

2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh phát sáng trên tôm
2.3.1. Phương pháp vi khuẩn học
Nuôi cấy tăng sinh khối trong môi trường canh TSB, phân lập giống thuần trên
môi trường TCBS, quan sát chọn những khuẩn lạc phát sáng trên đĩa cấy, cấy tăng sinh
các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường BHIA, sau đó định danh vi khuẩn bằng các
phản ứng sinh hóa theo khóa phân loại Bergey (Jonh và ctv, 1994).
Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém. Tuy nhiên
nó có nhược điểm là mất nhiều thời gian để thực hiện.
2.3.2. Phương pháp mô học
Tìm thấy các vi khuẩn hình que trong các mẫu mô tôm bệnh khi quan sát dưới
kính hiển vi. Phương pháp này đòi hỏi người thực hiện phải có chuyên môn và kỹ
thuật cao (Lý Thị Thanh Loan, 1999).
2.3.3. Phương pháp miễn dịch học
Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) có thể được sử dụng
để phát hiện bệnh phát sáng do V. harveyi trên tôm. Phương pháp này được thực hiện
dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể. Phương pháp
này có thể xác định nhanh V. harveyi từ mẫu tôm, mẫu nước và có thể xác định tất cả
các dòng V. harveyi (Robertson và ctv, 1998).
2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Hiện nay có thể dùng kỹ thuật khuếch đại DNA để chẩn đoán nhanh bệnh do
Vibrio trong vài giờ mà không phải mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn. Nguyên
tắc của phương pháp này là phát hiện một đoạn DNA đặc hiệu cho V. harveyi (Ruiz và
16

Smith, 2005) Tuy phương pháp này cho phép xác định nhanh tác nhân gây bệnh nhưng
chi phí để thực hiện lại quá tốn kém và đòi hỏi phải đầu tư trang thiết bị cao.
2.4. Một số loài thảo dược có tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng
trên tôm
Ngày nay, việc sử dụng các loại hóa chất và kháng sinh trong nuôi tôm đã kéo
theo các tác động xấu ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe của con người. Theo xu

thế phát triển nghề nuôi tôm trong tương lai, vấn đề chất lượng sạch của tôm nuôi ngày
càng được quan tâm đến, kéo theo là việc người ta phải tìm ra các phương pháp mới để
thay thế cho các loại hóa chất và kháng sinh trong việc điều trị bệnh cho tôm. Từ rất
lâu, ông cha ta đã biết sử dụng nhiều loại thực vật thuộc các loài thảo dược trong thiên
nhiên trong việc trị bệnh cho người và các loài vật nuôi. Đây được xem là một nguồn
cung cấp dược liệu quý và phong phú cho nền y học của nhân loại. Nhận thấy được
tiềm năng của các cây thảo dược, nhiều nhà khoa học đã tập trung vào nghiên cứu các
hợp chất chiết suất từ thảo dược với hy vọng tìm ra các bài thuốc mới dùng trong việc
điều trị bệnh cho tôm.
Thấy được tiềm năng thay thế cho các loại hóa chất và kháng sinh của thảo dược,
nhiều công trình nghiên cứu bước đầu đã được tiến hành nhằm tìm ra các hợp chất thảo
dược có khả năng ngăn chặn được bệnh phát sáng trên tôm do Vibrio.
Năm 2003, Wijayati bước đầu đã sàng lọc và kiểm tra hoạt tính diệt khuẩn của
các dịch chiết bằng methanol từ một số loài cây thảo dược đối với 2 loài V.
paraheamotilicus và V. harveyi bằng phương pháp kháng sinh đồ. Kết quả cho thấy
các dịch chiết bằng methanol của 3 loại thảo dược là cây sả (Cymbopogon citrates),
cây Neem (Azadirachta Indica) và cây ổi (Psidium guajava) đều có hoạt tính kháng
khuẩn chống lại các mầm bệnh kể trên. Nồng độ tối thiểu chống lại V. harveyi của các
dịch chiết từ lá của cây sả, cây Neem và cây ổi là 128 ppm, 512 ppm và 2,048 ppm. Từ
các kết quả nghiên cứu cho thấy cây sả, Neem và ổi có thể được sử dụng để điều trị
bệnh phát sáng trên tôm.
Cũng trong năm này (2003), Sivaram và ctv đã tiến hành sàng lọc và đánh giá
hiệu quả của một số dịch chiết bằng methanolic từ các loại thảo dược (như xuyên tâm
17

liên (Andrographus panicullata), nhục đậu khấu (Myristica fragrans), hương nhu tía
(Ocimum sanctum), cà dại quả đỏ (Solanum surattense), bàng hôi (Terminalia
bellirica), sầu đâu (Azadirachta indica) và một số cây thảo dược khác) trong việc
chống lại V. harveyi. Và kết quả đã cho thấy các dịch chiết từ hương nhu tía và nhục
đậu khấu cho các vòng kháng khuẩn có thể so sánh với các chất kháng sinh thông

dụng.
Từ các kết quả nghiên cứu ban đầu, thảo dược trong tương lai có thể được xem
là một trong những giải pháp hiệu quả và bền vững cho việc điều trị bệnh phát sáng
trên tôm. Tuy nhiên, đây chỉ là những kết quả ban đầu, để có thể đưa chúng vào sử
dụng trong thực tế cần phải có những nghiên cứu khác kỹ hơn để đánh giá hiệu quả tác
động của chúng trong thực tiễn sản xuất, cũng như nắm được cơ chế tác dụng và kiểm
tra tính an toàn của chúng đối với tôm.
Sau đây là đặc điểm của vài loài thảo dược mà bước đầu đã được nghiên cứu và
xác định là có khả năng điều trị bệnh phát sáng trên tôm:
2.4.1. Nhục đậu khấu
Nhục đậu khấu còn gọi là nhục quả, muscade (Pháp), nutmeg (Anh). Tên khoa
học là Myristica fragrans thuộc họ Myristicaceae.
Nhục đậu khấu thuộc loại cây to, cao 8-10m. Toàn thân nhẵn. Lá mọc so le,
xanh tươi quanh năm. Màu hoa vàng trắng. Quả hạch, hình cầu hay quả lê, màu vàng,
đường kính 5-8cm, khi chín nở theo chiều dọc thành 2 mảnh, trong chứa một hạt có vỏ
dày cứng, bao bọc bởi một áo hạt bị rách màu hồng.
Nhục đậu khấu là loại cây ưa khí hậu nóng ẩm, được trồng nhiều ở vùng nhiệt
đới.
Trong cây có chứa một loại tinh dầu thơm, dễ bay hơi, trong đó Myristicin
(C
11
H
12
O
3
) chiếm 4% thành phần hóa học của tinh dầu này. Về mặt cấu trúc hóa học,
Myristicin giống tương tự 3 loại ether thơm khác là eugenol, isoeugenol và safrol. Hợp
chất này được xem là một chất dược liệu quý trong y học
18

Trong y học nhân gian, cây nhục đậu khấu được dùng làm thuốc chống nôn
mửa, điều hòa hoạt động của ruột, dùng để trị các bệnh nhiễm khuẩn, lao và sốt (Gotke
và Maeshwari, 1990)
2.4.2. Cây Neem
Cây Neem có tên khoa học là Azadirachta Indica, thuộc họ Meliaceae, có
nguồn gốc từ Ấn Độ. Do khả năng chịu hạn cực kỳ tốt nên nó thường được trồng ở
một số quốc gia nằm cận xích đạo, như Senegal chẳng hạn.

Hình 2.2. Lá và hạt cây Neem (Ranajit và ctv, 2002)
Trong thành phần hóa học của tinh dầu thu từ hạt Neem có chứa các chất có hoạt
tính kháng khuẩn kháng nấm như: Nimbin, Nimbolide, Azad irachtin và Mahmoodin.
Theo một số tài liệu khoa học, toàn thân cây Neem là nguồn dược liệu quý, cây
càng già thì dược tính càng cao (tuổi thọ của Neem có thể đến 200 năm) có thể bào chế
để chữa nhiều chứng bệnh như thủy đậu, tiểu đường, loét dạ dày, lao, phong (Ranajit
và ctv, 2002)…
2.4.3. Hương nhu tía
Hương nhu tía, É tía, tên khoa học là Ocimum sanctum, thuộc họ Hoa môi -
Lamiaceae.
Là loại cây thảo cao gần 1 mét. Thân cành màu đỏ tía, có lông. Lá mọc đối, mép
khía răng, thường có màu nâu đỏ, có lông ở cả hai mặt; cuống lá dài. Cụm hoa là chùm
19

đứng gồm nhiều hoa màu trắng hay tím, có cuống dài, xếp thành vòng 6 – 8 chiếc. Quả
bế nhỏ. Toàn cây có mùi thơm dịu.
Đây là một loài cây cổ sống ở nhiệt đới, thường được trồng lấy lá làm rau ăn,
nhưng chủ yếu để làm thuốc.
Thành phần hóa học có tinh dầu với tỷ lệ 0,2 – 0,3% ở cây tươi và 0,5% ở cây
khô; thành phần chính của tinh dầu là eugenol (trên 70%), methyleugenol (trên 12%)
và - caryophyllen.
Trong y học, eugenol được dùng làm thuốc tê tại chỗ, thuốc sát trùng chống bệnh

hoại thư và bệnh lao phổi. Eugenol rất thông dụng trong nha khoa (làm chất hàn răng
tạm eugenat, làm thuốc điều trị viêm ngà, viêm xương ổ răng, làm toả bạc khi tráng
bạc trên răng), trong việc điều trị răng mòn, tê buốt (Chatterjee và ctv, 1982).
2.4.4. Cây sả
Sả hay còn gọi là Mao hương có tên khoa học là Cymbopogon citratus, thuộc
họ Lúa - Poaceae.
Sả là cây thảo sống lâu năm, mọc thành bụi, phân nhánh nhiều, cao khoảng
1,5m. Thân rễ trắng hoặc hơi tím. Lá dài đến 1m, hẹp, mép hơi ráp; bẹ trắng, rộng.
Cụm hoa gồm nhiều bông nhỏ không cuống.
Là một loài liên nhiệt đới mọc hoang và được trồng lấy củ, lá làm gia vị và làm
thuốc.

Hình 2.3. Cây sả (Shahi và ctv, 2005)
20

Thành phần hoá học: Củ Sả chứa 1 – 2% tinh dầu màu vàng nhạt, thơm mùi
chanh, mà thành phần chủ yếu là citral (65 – 85%), geraniol (40%).
Ngoài công dụng dùng làm gia vị, Sả đã được dùng làm thuốc trong nhân dân.
Sả được dùng để chữa: cảm mạo, nóng sốt đau đầu, đau dạ dày, ỉa chảy, phong thấp tê
đau, đòn ngã tổn thương… Người ta còn dùng toàn cây Sả chưng cất tinh dầu; tinh dầu
Sả dùng khử mùi hôi tanh, xua ruồi muỗi. Dùng xoa ngoài chữa cúm và phòng bệnh
truyền nhiễm (Shahi và ctv, 2005).
2.4.5. Cây ổi
Ổi có tên khoa hoc là Psidium guajava, thuộc họ Sim - Myrtaceae.
Cây cao khoảng 5 – 10m. Vỏ nhẵn, mỏng, khi già bong từng mảng lớn. Cành
non vuông, có nhiều lông mềm, về sau hình trụ và nhẵn. Lá mọc đối, thuôn hay hình
trái xoan, gốc tù hay gần tròn, gân lá nổi rõ ở mặt dưới. Hoa trắng, mọc đơn độc hay
tập trung 2 – 3 cái thành cụm ở nách lá. Quả mọng hình cầu, chứa rất nhiều hạt hình
bầu dục. Ðài hoa tồn tại trên quả.

Hình 2.4. Cành và quả ổi (Arima, 2002)
Cây ổi có gốc ở châu Mỹ nhiệt đới được trồng rộng rãi ở nhiều nơi. Có khi gặp
ở trạng thái hoang dại. Thu hái các bộ phận của cây quanh năm và phơi khô.
Thành phần hoá học: Lá ổi chứa tinh dầu (0,31%) trong đó có dl-limonen. Còn
có sitosterol, acid maslinic (acid cratagolic), acid guijavalic. Trong lá ổi non và búp
21

non còn có 7 – 10% tanin pyrogalic, khoảng 3% nhựa. Nhựa cây ổi chứa acid d-
galacturonic (72,03%), d-galactose (12,05%) và l-arabinose (4,40%). Cây, quả ổi có
pectin, vitamin C; trong hạt có tinh dầu với hàm lượng cao hơn trong lá. Vỏ thân chứa
acid ellagic.
Ổi có vị ngọt và chát, tính bình; có tác dụng cầm ỉa chảy, tiêu viêm, cầm máu.
Vỏ ổi cũng có vị chát, lá cũng vậy. Do có nhiều chất tanin nên nó làm săn niêm mạc
ruột, làm giảm tiết dịch ruột, giảm nhu động ruột, còn có tác dụng kháng khuẩn
(Arima, 2002)
2.5. Các hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc ngăn chặn dịch
bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm trong tương lai
Ngày nay, với những thành tựu vượt bậc của mình, công nghệ sinh học đang
dần dần chiếm lĩnh một vị trí quan trọng trong thế giới loài người. Có thể nói vai trò
của công nghệ sinh ngày càng trở nên không thể thiếu, nó chính là một công cụ đắc lực
giúp cho con người tìm hiểu và khám phá ra được những điều bí mật trong thế giới
sinh học nhằm cải thiện chất lượng cuộc sống và hoạt động sản xuất của con người
ngày càng tốt hơn. Những lĩnh vực như nông nghiệp, y tế, thực phẩm… có sự tham gia
của công nghệ sinh học đang từng bước được hoàn thiện. Chính vì thế, trong tương lai,
đây sẽ là một lĩnh vực được con người chú ý đến nhiều nhất, thế kỷ XXI sẽ là một thế
kỷ của công nghệ sinh học.
Trong lĩnh vực nông nghiệp nói chung, cũng như hoạt động sản xuất thủy sản
nói riêng, công nghệ sinh học đã và đang thể hiện vai trò của mình trong việc nghiên
cứu và ứng dụng các thành tựu nghiên cứu vào các vấn đề như kỹ thuật sản xuất, chất
lượng giống, việc kiểm soát dịch bệnh… nhằm cải thiện việc sản xuất cũng như chất

lượng của sản phẩm, góp phần thúc đẩy nền kinh tế của xã hội loài người phát triển đi
lên một cách bền vững.
Từ khi dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm bùng nổ, đã có nhiều công trình
nghiên cứu được tiến hành nhằm kiểm soát và ngăn chặn dịch bệnh này, trong đó đã có
nhiều kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng vào trong hoạt động sản xuất thực tiễn.
Các nhà khoa học nhìn nhận trong thời gian sắp tới việc ứng dụng của công nghệ sinh
22

học vào việc giải quyết vấn đề bệnh phát sáng trên tôm sẽ tập trung vào hai hướng
chính đó là: các phương pháp chẩn đoán phát hiện bệnh và các sản phẩm để ngăn chặn,
kiểm soát dịch bệnh.
2.5.1. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc chẩn đoán phát hiện
bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm
Các kỹ thuật chẩn đoán phát hiện bệnh trên tôm ngày nay đã có nhiều tiến bộ
nhờ việc áp dụng các thành tựu nghiên cứu của công nghệ sinh học, đặc biệt là công
nghệ sinh học phân tử. Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện bệnh
trên tôm đã trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi ở nhiều nơi. Các kỹ thuật như
ELISA và PCR đã được sử dụng để phát hiện các bệnh phổ biến trên tôm, đặc biệt là
các bệnh do virus như bệnh đốm trắng do WSSV, bệnh đầu vàng… Ưu điểm của các
phương pháp này là tính chính xác và rút ngắn được thời gian phát hiện. Đã có mhiều
đề xuất về sử dụng các kỹ thuật như ELISA và PCR cho việc phát hiện nhanh bệnh
phát sáng do Vibrio trên tôm. Việc tìm các đoạn DNA và tạo ra các kháng thể bắt dính
kháng nguyên đặc trưng của Vibrio đã được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu.
Năm 1998, Robertson và ctv đã nghiên cứu tạo ra một kháng thể đa dòng từ thỏ có thể
dùng để phát hiện nhiều dòng V. harveyi. Theo các phương pháp này thời gian phát
hiện bệnh được rút ngắn rất nhiều. Tuy nhiên, hiện nay tại nhiều nơi trên thế giới,
người ta vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp phân lập vi khuẩn để phát hiện bệnh phát
sáng do chi phí để thực hiện phương pháp này thấp hơn các phương pháp ELISA và
PCR. Do hạn chế về tính kinh tế nên đây sẽ là một hướng không khả thi trong thời
gian sắp tới.

2.5.2. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc tạo ra các chế phẩm
dùng trong ngăn chặn và điều trị bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm
Kinh nghiệm nuôi tôm cho thấy việc phòng ngừa bệnh là một giải pháp hữu
hiệu nhất giúp phát triển bền vững nghề nuôi tôm. Vì thế đây sẽ là một hướng hứa hẹn
có nhiều triển vọng trong tương lai, chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu tìm ra các
vaccine và chế phẩm sinh học để ngăn chặn dịch bệnh.
23

Theo những hiểu biết từ trước đến nay, tôm sú là động vật bậc thấp có hệ miễn
dịch không đặc hiệu. Điều này có nghĩa là việc sử dụng vacxin ở tôm sẽ không hiệu
quả (Đào Văn Trí và ctv, 2001).
Một đối tượng khác trong hướng nghiên cứu này là chế phẩm sinh học. Hiện
nay trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại chế phẩm sinh học có khả năng ức chế các
loài Vibrio như Zymetin, Dikaku, Biodream… Sự ra đời của các chế phẩm sinh học sẽ
giúp hạn chế được việc sử dụng các loại hóa chất và kháng sinh trong nuôi tôm. Trong
chế phẩm sinh học, tính cạnh tranh ức chế của các loài sinh vật giữ một vai trò rất
quan trọng quyết định tới hiệu quả của loại chế phẩm đó. Điều này đã thúc đẩy các nhà
nghiên cứu tập trung tìm ra các loài sinh vật có khả năng ức chế Vibrio. Và hiện nay,
đối tượng nghiên cứu đang được tập chung vào các sinh vật sống ở biển có khả năng
ức chế Vibrio gây hại.
Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có một dòng vi khuẩn ở biển là
Pseudomonas I-2 có thể tạo ra các hợp chất ức chế chống lại các Vibrio gây bệnh trên
tôm bao gồm V. harveyi, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. damsela và V. vulnificus.
Đây là một hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, bền với nhiệt, có thể hòa tan trong
chloroform và chịu được các enzyme phân giải protein. Người ta tiến hành tách chiết
chất này từ vi khuẩn bằng chloroform và tiến hành thử nghiệm, kết quả cho thấy dịch
chiết đã làm giảm mật độ V. harveyi trong nước xuống khi dùng ở nồng độ 20 µg/µl và
không ảnh hưởng tới ấu trùng của tôm thậm chí ở nồng độ 50 µg/µl. Vì vậy dòng
Pseudomonas I-2 này sẽ có tiềm năng ứng dụng vào việc kiểm soát các Vibrio gây
bệnh trên tôm trong các hệ thống sản xuất thủy sản (Karunasagar, 2001).

Alteromonas sp. P7 là một vi khuẩn gram âm, di động, hình que, có cytochrome
oxidase, có khả năng tổng hợp chất sắc tố trong môi trường nước biển. Chúng có khả
năng phát triển ở nồng độ muối NaCl 6% và không phát triển trên môi trường agar có
chứa sucrose, muối mật, thiosulphate citrate, trên môi trường Mac Conkey, hoặc trên
môi trường không có NaCl. Vi khuẩn này không có khả năng phát sáng, không có
enzyme amylase, gelatinase, catalase, urease và không khả năng tạo vòng indole cũng
như biến đổi nitrate. Alteromonas sp. P7 có thể sử dụng citrate như nguồn carbon duy
nhất và không có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác như là arabinose, dextrose,
24

galactose, lactose, mannitol, sorbitol và sucrose. Với những đặc điểm này, người ta đã
xếp vi khuẩn này vào loài Alteromonas và được chỉ định là Alteromonas sp. P7
(Abraham, 2004).
Người ta đã phân lập Alteromonas sp. P7 từ các ấu trùng Fabricius của tôm sú và
nhận thấy chúng có khả năng chống lại V. harveyi. Tất cả các dòng V. harveyi phân lập
được bị ức chế theo các mức độ khác nhau bởi Alteromonas sp. P7 ở trong phòng thí
nghiệm. Hợp chất kháng khuẩn được tạo ra bởi Alteromonas sp. P7 có thể hòa tan trong
dung môi hữu cơ và bám dính chặt lên bề mặt của các tế bào vi khuẩn và hợp chất này
không bị phân hủy khi xử lý bằng trypsin (Okereke và Montville, 1991). Từ đó, người ta
cho rằng hợp chất này có thể không phải là các protein có trong tự nhiên mặc dù các dòng
Alteromonas xác định đã được báo cáo là sản xuất các hợp chất protein kháng khuẩn (Mc
Carthy, 1994). Các chất kháng khuẩn được thải ra ngoài là sản phẩm của quá trình biến
dưỡng thứ cấp. Người ta cho rằng các chất kháng khuẩn này có thể là một pyrole hoặc
quinolinol hoặc tyrosol và isatin hoặc là một đường đa có khả năng tan trong ethyl acetate
(T. J. Abraham, 2004).
Các thí nghiệm được tiến hành đã chỉ ra rằng Alteromonas sp. P7 giúp giảm rõ
rệt tỷ lệ chết ở ấu trùng tôm sú in vivo từ V. harveyi M3 bằng cách ngăn chặn sự phát
triển và sinh sản của các vi khuẩn gây bệnh (Abraham, 2004).
Gần đây, tại nhiều nơi trên thế giới đã nổi lên các đề tài nghiên cứu về khả năng
ứng dụng của phage trong lĩnh vực thủy sản. Fraser (2003) và một số nhà khoa học

khác đã nghiên cứu và phát hiện một loại phage có khả năng gây sinh tan chuyên biệt
cho V. harveyi. Việc sử dụng các bacteriaphage chuyên biệt chống lại V. harveyi ngay
từ đầu trong quy trình sản xuất sẽ giúp giảm tối thiểu mật độ hiện diện của V. harveyi
trong nước, chất cặn và trong ruột vật nuôi và như thế sẽ ngăn chặn được sự phát sinh
của dịch bệnh. Tuy nhiên việc sử dụng phage có các mặt hạn chế như tạo ra các dòng
vi khuẩn mới kháng lại phage, hoặc bản thân các phage đó khó có thể kiểm soát được,
cũng như tính độc của các phage đó cần phải xác định rõ ràng. Trước khi đưa vào ứng
dụng trong thực tiễn, chúng ta cần phải tiếp tục tiến hành nhiều nghiên cứu khác để
bảo đảm tính hiệu quả và an toàn của phage trong sản xuất.
25

Tóm lại, hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc sản xuất ra các loại
chế phẩm dùng để ngăn chặn dịch bệnh phát sáng sẽ có nhiều triển vọng trong thời
gian tới. Tuy nhiên vẫn còn tồn tại một mặt hạn chế của các loại chế phẩm này, đó là
giá thành của nó quá cao, điều này giải thích vì sao hiện nay nhiều hộ nông dân nuôi
tôm vẫn còn cử dụng hóa chất và kháng sinh để xử lý bệnh tôm. Điều này thúc đẩy các
nhà sản xuất nghiên cứu, tìm ra một kỹ thuật, một quy trình sản xuất mới để có thể sản
xuất đại trà với số lượng lớn nhằm hạ giá thành sản phẩm, đáp ứng được nhu cầu và
nguyện vọng của người nuôi tôm.

26

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. Thời gian và địa điểm
3.1.1. Thời gian
Từ 21/03/2005 đến 26/06/2005.
3.1.2. Địa điểm
- Phòng Bệnh học Thủy sản – Trung tâm Quan trắc – Viện Nghiên cứu Nuôi
trồng Thủy sản II.
- Trại Thực nghiệm nuôi Thủy sản Thủ Đức – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản II.
3.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu
Hợp chất chiết xuất từ các thảo dược ký hiệu là B
2
thuộc họ Fabaceae, L, L
2
và
M thuộc họ Asteraceae.
3.2.2. Đối tượng nghiên cứu
- Tôm sú không mang các mầm bệnh để bố trí thí nghiệm, trọng lượng bình
quân từ 15 – 20 g/con.
- Giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng, phân lập từ tôm bệnh.
3.2.3. Dụng cụ và hóa chất
3.2.3.1. Dụng cụ
- Dụng cụ bố trí thí nghiệm: bể nuôi, hệ thống sục khí, vợt thùng, thau

- Dụng cụ thu mẫu: kim tiêm (1 ml), đèn cồn, que cấy, bông thấm, găng tay,
bao thùng xốp, chai lọ.
27

- Dụng cụ phân tích vi khuẩn: ống nghiệm các loại, đĩa petri, que cấy, đèn
cồn, pipet, đầu típ, tủ lạnh, tủ ấm, tủ cấy, nồi hấp autoclave
- Dụng cụ quan sát, thử nghiệm kháng sinh đồ: thước đo vòng kháng khuẩn,
đĩa giấy tẩm hợp chất chiết xuất làm kháng sinh đồ.
- Dụng cụ kiểm tra chất lượng nước: nhiệt kế thủy ngân 0 – 100
0
C, pH kế, bộ
test NH
3
, DO, COD
3.2.3.2. Môi trường và hóa chất
 Đĩa giấy tẩm các hợp chất cần thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau.
- Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar): môi trường
đặc trưng dùng để chọn lọc V. harveyi.
- TSB (Tryptone Soya Broth): môi trường tăng sinh, phục hồi cho vi khuẩn.
- Môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar): môi trường dùng để tăng
sinh, làm thuần vi khuẩn.
- Môi trường MHA (Mueller Hinton Agar): môi trường đặc trưng dùng làm
kháng sinh đồ khảo sát tác dụng kháng khuẩn của hợp chất thử nghiệm.
- Các môi trường và hóa chất thử nghiệm đặc tính sinh hóa của vi khuẩn.
Ngoài ra còn có nước biển (15‰) và một số hóa chất khác dùng trong thí
nghiệm.
3.3. Phương pháp tiến hành
Nội dung tiến hành đề tài có thể chia thành 2 giai đoạn thử nghiệm:
3.3.1. Thử nghiệm trong phạm vi phòng thí nghiệm
Tiến hành thử nghiệm tác dụng của các hợp chất B

2
, L, L
2
và M theo phương
pháp kháng sinh đồ. Mục tiêu là sàng lọc các chất có hiệu quả và xác định các mức
nồng độ có ý nghĩa của chất đó đối với vi khuẩn V. harveyi trong phòng thí nghiệm.
Gồm các bước sau:

28










Sơ đồ 1. Bố trí thử nghiệm tác dụng của các hợp chất
3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi
- Lấy mẫu: chọn ngẫu nhiên 2-3 con tôm nuôi ao có dấu hiệu nhiễm khuẩn.
- Lấy máu tôm: mỗi con 0,1 ml, sau đó nhỏ lên các đĩa cấy chứa môi trường
TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi con cấy lên 1 đĩa. Ủ trong tủ
ấm ở 30
0
C trong 24 giờ.
- Chọn khuẩn lạc phát sáng trên môi trường TCBS cấy chuyền sang môi
trường BHIA (có bổ sung 2% NaCl). Ủ trong tủ ấm ở 30
0

C, 24 giờ để thuần
hóa và tăng sinh V. harveyi.
- Tiến hành thử nghiệm các đặc tính sinh hoá của V. harveyi: khả năng sử
dụng các đường glucose, sorbitol, malnose, sucrose, lactose, galactose; khả
năng sử dụng citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons
Citrate Agar; khả năng sinh gas từ glucose, kiểm tra khả năng lên men và
oxy hoá; khả năng phân giải Gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản ứng
Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin (Jonh, 1994).
Phân lập dòng thuần V. harveyi
từ tôm có dấu hiệu nhiễm khuẩn
Thử nghiệm sinh hóa để xác định
V. harveyi
Thử nghiệm tác dụng của các
chất bằng phương pháp kháng
sinh đồ
Xác định nồng độ có hiệu quả
kháng vi khuẩn
29


3.3.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ theo phương pháp Mc Farland (Bauer
và Kirby, 1997)
 Nguyên tắc
Khả năng ức chế của các hợp chất thảo dược được xác định dựa vào đường kính
vòng vô khuẩn hình thành do sự khuếch tán các hợp chất xung quanh đĩa giấy tẩm hợp
chất. Hiệu quả kháng khuẩn được xác định dựa vào đường kính của các vòng ức chế vi
khuẩn.
 Cách tiến hành
 Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn theo phương pháp Mc Farland.
Bảng 3.1. Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí nghiệm Mc Farland

Ống số 1 2
3
4 5 6 7 8 9 10
BaCl
2
1%(ml) 0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

H
2
SO
4
1%(ml) 9,9

9,8

9,7

9,6

9,5

9,4

9,3

9,2

9,1

9,0

Tb/ml(x 10
8
) 3 6
9
12 15 18 21 24 27 30
Chuẩn bị vi khuẩn để thử nghiệm kháng sinh đồ: giống vi khuẩn V. harveyi
thuần chủng. Vi khuẩn được cấy tăng sinh trên môi trường BHIA + 2% NaCl, thu tế
bào vi khuẩn và huyền phù với nước muối sinh lý 2% vô trùng.
Pha hỗn hợp dịch tế bào của vi khuẩn sao cho dung dịch huyền phù có cùng độ
đục với ống số 3 theo Mc Farland.
- Chuẩn bị các đĩa giấy (đường kính = 6mm) trong điều kiện vô trùng. Hòa

tan các hợp chất thảo dược trong dung môi DMSO với các nồng độ dự kiến
thử nghiệm tùy vào mức độ tan của các hợp chất trong dung môi. Cụ thể,
các nồng độ cho từng hợp chất là:
+ Hợp chất B
2
: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 µg/µl.
30

+ Hợp chất L: 600, 700, 800, 900, và 1000 µg/µl.
+ Hợp chất L
2
: 600, 700, 800, 900 và 1000 µg/µl.
+ Hợp chất M: 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/µl.
- Dùng pippet hút 5 µl các hợp chất cần thử nghiệm tẩm vào các đĩa giấy.
- Chuẩn bị các đĩa môi trường MHA để thử kháng sinh đồ.
- Dùng pipet hút 0,5 ml dung dịch vi khuẩn cho vào môi trường MHA trong
đĩa petri, dàn đều dịch vi khuẩn lên đĩa thạch. Sau đó dùng pipet hút hết
phần dung dịch vi khuẩn thừa trên mặt thạch.
- Dùng kẹp vô khuẩn lấy các đĩa giấy đã tẩm các hợp chất hợp chất thử
nghiệm đặt lên bề mặt thạch, cách mép đĩa petri khoảng 2,5 cm, đảm bảo
mặt đĩa giấy tẩm hợp chất tiếp xúc phẳng với bề mặt thạch.
- Ủ các đĩa petri trong tủ ấm ở 30
0
C sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và
12 giờ kiểm tra và đo vòng vô khuẩn.
3.3.2. Thử nghiệm trong phòng ướt Wet-lab
Sau giai đoạn thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, bước đầu đánh giá hợp chất M
là có hiệu quả nhất đối với V. harveyi. Giai đoạn tiếp theo là tiến hành thí nghiệm đánh
giá hiệu quả điều trị của hợp chất M đối với tôm đã cho nhiễm V. harveyi trong bể nuôi
trong phòng Wet-lab. Hai nồng độ của hợp chất M được chọn để thử nghiệm là 500 và

750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Sơ đồ tiến hành thử nghiệm được trình bày như sau:







31















Sơ đồ 2. Bố trí thử nghiệm trong phòng Wet-lab
Chuẩn bị 15 bể thí nghiệm, nước biển sau khi kiểm tra các tính chất hóa lý được
cho vào mỗi bể 50 lít. Thí nghiệm bố trí thành 4 lô:
- Lô đối chứng âm: bố trí 3 bể, không gây cảm nhiễm, chỉ tiêm 0,05 ml dung
dịch nước muối sinh lý và cho ăn thức ăn tổng hợp không tẩm hợp chất thử
nghiệm.

Tôm không mang các
m
ầm bệnh

Lô đối
chứng âm,
15 con
Lô đối
chứng dương,
15 con
Lô thử nghiệm nồng
độ 500 mg/kg, 15
con
Lô thử nghiệm nồng
độ 750 mg/kg, 15
con
Tiêm 0,05
ml nước
muối sinh
lý
Tiêm 0,05
ml dịch vi
khuẩn
Tiêm 0,05
ml dịch vi
khuẩn
Tiêm 0,05
ml dịch vi
khuẩn
Theo dõi biểu hiện của tôm

Chăm sóc, theo dõi, đánh giá hiệu quả của
thu
ốc đối với vi khuẩn

Cho tôm ăn
thức ăn có tẩm
thuốc nồng độ
750 mg/kg
Cho tôm ăn
thức ăn có tẩm
thuốc nồng độ
500 mg/kg
Cho tôm
ăn thức ăn
thường
Cho tôm
ăn thức ăn
thường
32

- Lô đối chứng dương: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml
dung dịch vi khuẩn (10
6
CFU/ml) và sử dụng thức ăn tổng hợp không tẩm
hợp chất thử nghiệm.
- Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 500 mg/kg: bố trí 3 bể, các con
tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (10
6
CFU/ml) và cho
ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 500 mg/kg trọng lượng

cơ thể/ngày.
- Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 750 mg/kg: bố trí 3 bể, các
con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (10
6
CFU/ml) và
cho ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 750 mg/kg trọng
lượng cơ thể/ngày.
Các con tôm sau khi tiêm được thả lại bể theo đúng bố trí. Chăm sóc và quan
sát các dấu hiệu biểu hiện bệnh bằng cách so sánh với đối chứng âm và đối chứng
dương. Quan sát theo dõi các biểu hiện của tôm, bắt đầu cho tôm ăn thức ăn có tẩm
thuốc ngay khi có biểu hiện bệnh.
3.3.2.1. Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá lý của nước nuôi
Trong kỹ thuật nuôi tôm, vấn đề chất lượng nước nuôi rất quan trọng. Nước
nuôi tôm phải có các tính chất hoá lý phù hợp với tôm, nếu không có thể làm tôm bị
sốc và chết. Vì vậy trước khi thả tôm, cần phải tiến hành kiểm tra các tính chất hoá lý
của nước nuôi.
Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá lý của nước:
- Đo độ mặn của nước biển bằng máy đo độ mặn.
- Đo pH: dùng pH meter cầm tay để đo pH.
- NH
3
/: sử dụng bộ test NH
3
của Sera.
- Đo COD: dùng KMnO
4
để oxy hóa các chất hữu cơ, sau đó dùng KI trung hòa
KMnO
4
dư và chuẩn độ bằng Na

2
S
2
O
3
0,01N với chỉ thị hồ tinh bột.
- Đo DO: dùng MnCl
2
và KI/NaOH để cố định mẫu nước và chuẩn độ bằng
Na
2
S
2
O
3
0,01N với chỉ thị hồ tinh bột.
33

Trong quá trình nuôi phải thường xuyên theo dõi và kiểm tra để đảm bảo chất
lượng của nước nuôi tôm.
3.3.2.2. Tiến hành thu mẫu và kiểm tra vi khuẩn
Tiến hành lấy mẫu nước và mẫu tôm tại các thời điểm:
- Trước khi gây cảm nhiễm.
- Khi gây cảm nhiễm.
- Sau 7 ngày dùng thuốc.
- Sau 10 ngày dùng thuốc.
- Sau 14 ngày dùng thuốc.
Kiểm tra vi khuẩn trong mẫu nước
Lấy mỗi bể khoảng 25 ml nước, các mẫu nước của các bể cùng lô thị nghiệm
được trộn lại đựng trong bình nhựa để mang về phân tích. Mẫu nước đem về phòng thí

nghiệm sẽ được kiểm tra bằng cách trải cho thật khô trên các đĩa thạch chứa môi
trường TCBS, mỗi lô sẽ cấy 3 đĩa: 2 đĩa cấy với 50 µl mẫu nước và một đĩa cấy với
100 µl mẫu nước.
Kiểm tra vi khuẩn trong tôm
- Mỗi lần lấy mẫu bắt khoảng 3 con ở mỗi bể.
- Tiến hành lấy mẫu máu tôm của từng con (0,1 ml).
- Sau đó mẫu máu của từng con sẽ được cấy trải lên 1 đĩa thạch chứa môi
trường TCBS. Ủ trong tủ ấm ở 30
0
C trong 24 giờ.
- Xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là các khuẩn lạc màu lục, khi quan sát
trong tối thấy phát sáng.
- Cấy vi khuẩn sang môi trường BHIA + 2% NaCl, ủ trong tủ ấm ở 30
0
C
trong 24 giờ để tăng sinh khối vi khuẩn.
- Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: khả năng sử dụng các đường
glucose, sorbitol, manitol, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng
citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar;
khả năng sinh gas từ glucose; khả năng phân giải Gelatin; khả năng khử
34

Nitrate; phản ứng Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin như arginine,
lysine, ornitine; phản ứng với esculine; khả năng sử dụng tinh bột; phản ứng
VP và phản ứng O/F (Jonh, 1994).
3.3.3. Phương pháp phân tích số liệu thống kê
Các số liệu thí nghiệm được xử lý sử dụng phần mềm thống kê SPSS và
EXCEL. SPSS là một chương trình phân tích số liệu tự động do máy tính thực hiện
dựa trên các công thức toán học đã được lập trình.
Các công thức toán học thường dùng trong phân tích thống kê (Nguyễn Văn

Đức, 2001):
 Trung bình (Mean):

 Phương sai (Variance): S
2


 Độ lệch chuẩn (Standard deviation): S
Trong thí nghiệm này:
- X
i
là giá trị của các vòng kháng khuẩn ở các nồng độ thí nghiệm (mm).
- n là số lần lập lại thí nghiệm.

 Phương pháp so sánh 2 giá trị nghiệm thức (Nguyễn Văn Đức, 2001):
Ở đây mỗi nghiệm thức là các giá trị vòng kháng khuẩn ở mỗi nồng độ ở mỗi
điểm thời gian.
Cách tiến hành:
∑
n
i=1
X
i

X
=
n
1
(X
i

– X)
2

∑
n
i=1
n-1
1

S
2

=
X
35

Đặt giả thiết H
0
: m
1
= m
2

X
i
= X
1i
– X
2i

Từ giá trị của phân phối Student t suy ra p là mức độ sai khác ý nghĩa dựa vào
bảng phân bố t.
- Nếu p > 0,05, chấp nhận giả thuyết H
0
tức là hai giá trị không khác nhau về
mặt thống kê.
- Nếu p ≤ 0,05, không chấp nhận giả thuyết H
0
tức là hai giá trị khác nhau về
mặt thống kê.








∑
n
i=1
X
i

X
=

n
1
(X
i
– X)
2

∑
n
i=1
n-1
1

S
2

=
√S
2
/n
|X|
t(n-1) =