Luận văn : BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA part 3 docx

26

- Đặt màng vào trong tủ sấy ở 65-80
0
C trong khoảng 1 giờ cho đến khi các
góc màng co lại là được.
3.5.4.5. Cố định DNA lên màng nitrocellulose
Màng sau khi được làm khô, được đem xử lý dưới UV trong tủ GS GENE
LINKER
TM
UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của màng
hướng lên). Sau đó, màng được đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong
hộp kín cho đến khi tiến hành lai).
3.5.5. Thực hiện lai Southern sử dụng probe pMGY-SB
3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai
Trước khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 55
0
C, đồng
thời làm nóng dung dịch đệm lai ở 55
0
C. Song song đó, chúng tôi tính toán các thông
số sau:
Diện tích màng: 20 x 12 = 240 (cm
2
)
Thể tích đệm lai: 0.2 x 240 = 48 (ml)
Nồng độ probe cần: 10 x 48 = 480 (ng)
Thể tích probe: 480 / 10 =48 (µl)
 Qui trình thực hiện phản ứng lai
Bước 1: Tiền lai
Khi nhiệt độ của buồng lai đạt ổn định ở 55

0
C và dung dịch đệm lai cũng đã
được làm nóng đến 55
0
C, tiến hành rửa ống lai bằng nước cất vô trùng, sau đó bơm
vào ống lai 40 ml dung dịch đệm lai. Dùng kẹp đặt màng vào ống lai sao cho bề không
có DNA tiếp xúc với thành ống lai. Thời gian cho bước này là 15 phút.
Bước 2: Lai
Trộn 8 ml dung dịch đệm lai với 48 µl probe, bơm hỗn hợp vào giữa ống lai
(tránh nhỏ trực tiếp lên màng), phản ứng được thực hiện trong một thời gian dài, có thể
để phản ứng qua đêm là phù hợp nhất (12 giờ).
3.5.5.2. Rửa màng nitrocellulose sau khi lai
Trước khi rửa màng cần làm nóng dung dịch rửa 1 (primary wash buffer) đến
55
0
C. Thực hiện rửa màng theo các bước sau:
27

- Loại bỏ dung dịch đệm lai, thêm vào ống lai khoảng 20 ml dung dịch rửa 1.
Nhiệt độ và số vòng quay của buồng lai giống như khi lai, thời gian rửa là
10 phút.
- Lặp lại bước trên cũng trong 10 phút.
- Loại bỏ dung dịch rửa 1, dùng kẹp gấp màng ra và cho vào hộp nhựa sạch
với bề có DNA nằm trên. Cho vào đó dung dịch rửa 2 (secondary wash
buffer) khoảng 50 ml, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- Lặp lại bước trên trong 10 phút. Lúc này màng có thể được giữ trong dung
dịch rửa 2 trong 30 phút để chuẩn bị cho bước phát hiện.
3.5.5.3. Phát hiện kết quả bắt cặp giữa probe và đoạn DNA đích bằng
huỳnh quang và thể hiện trên X-ray phim
 Chuẩn bị màng với chất phát hiện CDP - Star

Màng sau khi được rửa lần 2, sẽ được phủ lên trên một lớp dịch của chất phát
hiện, chất này làm cho các phân tử probe phát sáng. Các bước thực hiện như sau:
- Dùng saran wrap trải trên một mặt phẳng nằm ngang, phẳng, có phủ một lớp
khăn giấy.
- Lấy màng từ trong dung dịch rửa 2 ra, phải ráo và đặt lên trên miếng saran
wrap với bề có DNA hướng lên trên.
- Hút 1000 µl chất phát hiện CDP- Star nhỏ lên trên màng.
- Dùng một tấm saran wrap khác phủ bề mặt màng, trải đều chất phát hiện
bằng que thủy tinh, tránh để lại bọt khí.
- Sau đó, màng lai được lấy ra, và đặt ở giữa hai miếng saran wrap mới với
kích thước phù hợp (chú ý trong quá trình thao tác với màng không để
màng bị khô).
 Ủ màng nitrocellulose với X-ray phim trong cassette
Màng được đặt giữa Cassette 30 x 40 Konica, sau đó đặt một tấm phim Konica
30 x 40 cm lên trên màng tránh sự dịch chuyển của màng. Đậy cassette lại và tính thời
gian ủ 30 phút hoặc 1 giờ (thường phản ứng sẽ có tín hiệu sáng tốt nhất sau 1 giờ từ
khi cho chất phát hiện vào). Tùy theo tính chất probe mà thời gian ủ phản ứng phát
hiện khác nhau. Các thao tác trên được thực hiện trong buồng tối.
28

Khi đã hoàn thành giai đoạn ủ phim với màng, phim sẽ được đem ra khỏi
cassette và ngâm trong dung dịch developer trong 5 phút. Sau đó, lấy phim ra và ngâm
trong dung dịch fixer khoảng 3 phút. Cuối cùng đem phim ra rửa dưới vòi nước sạch
và dùng kẹp treo lên giá làm khô ở nhiệt độ phòng.




PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea.
Giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn tuy dễ thực hiện nhưng không đơn
giản. Để có thể triết tách được một lượng DNA tốt và có thể sử dụng cho những
nghiên cứu sau này, thì ngoài phương pháp cần phải có một kinh nghiệm trong thao
tác. Giai đoạn này đóng vai trò quan trọng đầu tiên cho phép phản ứng lai thành công
hay không.Việc tách chiết phải đảm bảo có lượng DNA có trong mẫu và lượng DNA
phải đủ lớn để có thể phát hiện được qua lai với probe. Các thao tác phải nhẹ nhàng để
tránh DNA bị gãy. Kết quả tách chiết có ý nghĩa cao là phải đảm bảo độ tinh khiết cao
không còn hóa chất ly trích sót lại.
Sau khi tiến hành tách chiết DNA theo đúng qui trình, chúng tôi thu được lượng
DNA của các mẫu như sau:
29


Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea.
Nấm sau khi nuôi cấy trong máy lắc định ôn 37
0
C, qua 72 giờ được ly trích DNA,
DNA sau ly trích được điện di trên gel agarose 0,8%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X,
hiệu điện thế 100V, trong thời gian 30 phút.

Kết quả điện di trong hình 4.1 cho thấy, tất cả các mẫu đều thu được DNA tổng
số có nồng độ cao và ít bị đứt gãy. Tuy nhiên, các mẫu còn lẫn tạp chất nhiều. Các vệt
sáng kéo dài phía dưới có thể là RNA hoặc DNA bị đứt gãy. Lỗi này có thể la do lắc
mạnh trong quá trình sau khi cho phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), khiến DNA bị
đứt gãy nhiều. Mặt khác do quá trình ly trích tôi không sử dụng enzym RNAse nên
lượng RNA lẫn tạp trong mẫu còn nhiều. Riêng mẫu CT72 và CT64 có hai băng, điều
này có thể lý giải là trong quá trình nuôi cấy mẫu bị nhiễm khuẩn và do DNA genomic
vi khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ hơn nên di chuyển trước và tạo thành 2 băng. Từ
thực nghiệm, chúng tôi rút ra được những điểm cần lưu ý trong quá trình ly trích:

- Cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối trong quá trình cấy và tăng sinh khối sợi
nấm. Nếu môi trường tăng sinh không bị nhiễm khuẩn thì sau khi ta thu sinh
khối là phần sợi nấm thì phần dịch còn lại trong và có màu vàng óng.
- Bước thu sinh khối không nên để sợi nấm quá khô, tốt nhất nên nghiễn sinh
khối nấm trong nitow lỏng ngay sau khi thu thí chất lượng DNA sẽ tốt hơn.
CT64 CT375 LA415 CT104 LA18 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390 CT72 KG216 KG531
CT80 LA9 CT178 AG518 TG24 CT72 CT375 KG535 KG483 CT72 KG398 CT74 CT64 KG398 KG531 CT63 LA2

30

- Thao tác phải nhẹ nhàng trong khi ly trích, dặc biệt là sau khi thêm hỗn hợp
phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), chỉ nên nghiêng ống nghiệm (hoặc
eppendorf) một cách cẩn thận không nên lắc mạnh.
- Thu phần dịch nổi không nên hút phần cặn phía dưới, đặc biệt là không
được hút vào phenol phía dưới. Phenol có thể phá hủy DNA sau khi ly trích.
- Khi thêm isopropanol (ethanol 100%) thì ta nên ủ trong tủ -20
0
C trong 30-
60 phút, để DNA có thể tủa hoàn toàn.
- DNA phải được rửa nhiều lần với ethanol 70% để loại bỏ bớt tạp chất và
nên làm khô DNA hoàn toàn (có thể để trong tủ cấy qua đêm).
- Khi điện di DNA tổng số thì nồng độ gel từ 0,6-0,8% là phù hợp.
Tuy nhiên, để đảm bảo cho phản ứng cắt và phản ứng lai xảy ra tốt hoặc biết
được nguyên nhân nếu phản ứng không cho kết quả tốt, tôi cố gắng hoàn thiện tốt từng
giai đoạn. Sản phẩm ly trích còn nhiều tạp nhiễm, do đó tôi tiến hành loại bỏ tạp
nhiễm bằng RNAse.



Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi đƣợc xử lý với RNAse.

DNA sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose 0,8%, trong dung dịch đệm TAE
0,5X, hiệu điện thế 100V, trong thời gian 30 phút.

Nhìn chung, kết quả tinh sạch tương đối tốt nhưng DNA còn bị đứt gãy nhiều.
Một số mẫu không có DNA mà chỉ là những vệt sáng mờ như mẫu CT375, KG535,
LA415 LA18 KG531 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390
CT72
CT178 AG518 TG24 CT104 CT375 KG535 KG483 CT72 KG398 CT80 KG216

31

CT72, KG531. Nguyên nhân có thể do trong thao tác không cẩn thận làm DNA bị đứt
gãy hoặc do DNA không tủa hoàn toàn và do đó không thu được DNA. Để khắc phục
hiện tượng này tôi đề nghị nên sử dụng NaOAc kết hợp với ethanol để DNA có thể kết
tủa tốt hơn. Tuy nhiên với dộ tinh sạch đó ta có thể sử dụng để thực hiện làm mẫu cho
phản ứng lai.
4.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α
Sau khi biến nạp, tôi chọn phương pháp chọn lọc trực tiếp trong môi trường LB
lỏng có chứa kháng sinh ampicilin với nồng độ 70µg/ml, để chọn lọc những dòng vi
khuẩn E.coli DH5α có chứa plasmid. Kết quả ly trích vi khuẩn E.coli DH5α được nuôi
cấy lắc qua đêm ở nhiệt độ 37
0
C:

Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8%.
DNA plasmid ly trích từ vi khuẩn E.coli DH5α tăng sinh trong môi trường LB chứa
70µg/ml Ampicilin. Plasmid được điện di trên gel agarose 1%, trong dung dịch đệm
TAE 0,5X, hiệu điện thế 50V, thời gian 45 phút. Mẫu pMGY-SB (1,2), pEBA 18 (3,4),
pMGR-T1 (5,6).

Kết quả cho thấy quá trình biến nạp thành công và vi khuẩn chứa plasmid có
thể sống trong môi trường kháng sinh (70 g/ml). Các mẫu 2,4,6 là mẫu plasmid chuẩn
được cung cấp để thực hiện biến nạp, mẫu 1, 3 là mẫu plasmid được ly trích trong đó
có sử dụng RNAse, mẫu 5 không sử dụng enzyme RNAse trong quá trình ly trích nên
còn lẫn tạp chất nhiều. Kết quả ly trích không có lẫn DNA genomic của vi khuẩn.
1 2 3 4 5 6
32

Riêng mẫu 4 và 5 có hai băng, nguyên nhân là do plasmid tồn tại ở hai dạng: dạng
vòng và dạng xoắn.
4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea bằng enzym cắt giới hạn
Trong 30 dòng nấm Magnaporthe grisea ly trích được, tôi chọn ra 10 dòng để
thực hiện phản ứng cắt với hai enzym BamHI và EcoRV, nhằm chuẩn bị mẫu cho phản
ứng lai. Tôi thực hiện phản ứng cắt với thể tích là 40µl, nồng độ mẫu DNA được cắt là
2 µg, ủ ở 37
0
C qua đêm. Sau đó, hút 4 µl sản phẩm cắt và điện di kiểm tra trên gel
agarose 0,8%, kết quả điện di như sau:


a)


b)
Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn.
Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%, trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế
50V, thời gian 1 giờ. Hình a) các mẫu DNA được cắt bằng enzyme BamHI, hình b) các
mẫu DNA được cắt bằng EcoRV. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4),
VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9).

1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
33

Kết quả cho thấy sản phản ứng cắt không hoàn toàn đối với các mẫu số 1 và 2
trên cả hai enzym EcoRV và BamHI. Phản ứng cắt không tốt có thể là do mẫu DNA ly
trích không được tốt nên không thực hiện được phản ứng cắt. Những mẫu cắt không
hoàn toàn và những mẫu cắt quá vụn như vậy sẽ không có ý nghĩa trong quá trình tạo
mẫu lai. Phản ứng cắt không hoàn toàn nguyên nhân là do nồng độ DNA quá nhiều so
với nồng độ mà một đơn vị enzym có thể cắt được.



4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi đƣợc cắt bằng EcoRV và BamHI với
probe SB
Thí nghiệm 1: Lai ở 55
0
C, thời gian lai là 16 giờ, thời gian ủ phát hiện là 30 phút.
Sản phẩm cắt DNA genome của M. grisea với hai enzyme EcoRV và BamHI
được dùng làm mẫu lai, 15 µl mẫu được load trên miếng gel agarose 0,8% kích thước
20 x 15 x 0,7 cm. Plasmid pMGY-SB được bố trí là mẫu đối chứng dương cho phản
ứng lai. Probe đánh dấu sử dụng cho phản ứng lai là plasmid pMGY-SB có kích thước
3,54 kp. Điện di được thực hiện trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V, thời gian 4
giờ. DNA sau khi điện di được chuyển lên màng trong thời gian 16 giờ. Sau đó, tiến
hành phản ứng lai ở 55
0
C, thời gian là 16 tiếng. Tôi thực hiện bước phát hiện, tác nhân
phát hiện được cho trực tiếp lên màng lai, để 2 – 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó loại
bỏ tác nhân phát hiện thừa rồi ủ màng lai với phim trong thời gian 30 phút. Rửa phim
với dung dịch rửa phim.

Sản phẩm lai xuất hiện trên nền phim sau khi rửa. Đây là kết quả của sự bắt cặp
giữa probe đánh dấu với DNA plasmid và DNA genomic của nấm M.grisea sau khi ly
trích. Các mẫu DNA được cắt bằng 2 enzyme BamHI và EcoRV thì sự bắt cặp với
probe không xảy ra. Kết quả này chứng minh được DNA được biến tính hoàn toàn trên
gel và có thể bắt cặp được với probe đánh dấu, nhiệt độ lai là 55
0
C, thời gian lai là 16
giờ thì probe đã bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu, nhưng không đặc hiệu. Điều này
có thể chứng tỏ rằng nhiệt độ lai thấp. Tuy nhiên, các mẫu sử dụng làm thí nghiệm thì
không có hiện tượng bắt cặp. Điều này có thể được lý giải từ những nguyên nhân sau:
- Phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn chưa hoàn chỉnh.
34

- Quá trình chuyển DNA lên màng chưa hoàn toàn do nồng độ gel cao và
kích thước gel dày (0,7cm), cũng có thể do kích thước DNA lớn nên khó
chuyển lên màng.
- Trình tự DNA mục tiêu hiện diện trên màng ít, probe không thể phát
hiện được.
- Sự liên kết giữa trình tự DNA mục tiêu với probe đánh dấu lỏng lẻo, nên
trong quá trình rửa màng, probe đã bị cuốn trôi theo dung dịch rửa.


Thí nghiệm 2: Lai ở 60
0
C, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút
Tôi thực hiện phản ứng lai với các mẫu LA415 (1), LA18 (2), VL265 (3), VL
37 (4), VL 52 (5), VL45 (6), AG 518 (7), TG24 (8), KG535 (9) được cắt bằng hai
enzyme BamH I và Eco RV. Khắc phục những nguyên nhân nêu ở thí nghiệm 1 tôi
thực hiện các bước có cải tiến. 30 µl mẫu được load vào giếng trên miếng gel kích
thước 20 x 15 x 0,5 cm, điện di được thực hiện trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50

V, thời gian 6 giờ. Thời gian chuyển DNA lên màng là 20 giờ. Tôi thực hiện phản ứng
lai ở 60
0
C, thời gian 20 tiếng. Kết quả thực hiện như sau:











Hình 4.5. kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai.
ĐC(+) 1 2 3 4 5 6 7 8 9ĐC (+)1 2 3 4 5 6 7 8 9
BamHI EcoRI
35

Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,7% (20x15x0,5cm), hiệu điện thế 50V,
thời gian 5 giờ, trong đệm TAE 0,5X. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4),
VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9), pMGY-SB (ĐC(+)).

Kết quả tạo mẫu lai cho thấy sản phẩm cắt chưa tốt để thực hiện một phản ứng
lai. Các mẫu 2 và 7 bị cắt quá vụn nên các mẫu điện di có thể bị chạy ra ngoài sau một
thời gian điện di quá dài. Mẫu 1 và 9 được đánh giá là tốt nhất. So sánh về kích thước
của sản phẩm cắt với plasmid pMGY-SB có kích thước 3,52 kb, thì ta thấy các đoạn
DNA cắt ra từ genome đều có kích thước nhỏ hơn 3,5 kb, từ đó có thể nhận xét rằng
kích thước các đoạn phân cắt có thể quá nhỏ và điều này cũng ảnh hưởng tới khả năng

bắt cặp của DNA mục tiêu với probe. Các băng điện di không thẳng do điện cực ở máy
điện di không ổn định trong quá trình điện di hoặc do bồn điện di bị rung trong quá
trình điện di. Trong điều kiện này, kết quả điện di tạo mẫu lai không phản ánh thực
được sự di chuyển theo kích thước của các đoạn DNA từ đó kết quả phản ứng lai
không có ý nghĩa khi phân tích sự đa dạng. Những kết luận rút ra được là :
- Sản phẩm cắt phải có nồng độ đều nhau.
- Sản phẩm cắt phải tạo thành một vết sáng đêu trên gel sau khi điện di
(smear) thì mới có thể dùng làm mẫu cho phản ứng lai.
- Hiệu điện thế không nên quá cao có thể chạy ở 30V trong thời gian khoảng
32 h (Le Dinh Don, 2000).
- Nồng độ gel từ 0,7-0,8% là phù hợp để DNA có thể được chuyển lên màng
sau khi điện di.
- Dung dịch đệm điện di phải sạch thì mới đảm bảo quá trình chuyển lên
màng thành công.

36


Hình 4.6. Kết quả phát hiện trên X-ray film.
Kết quả lai với probe pMGY-SB, Lai ở 55
o
C, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút.
Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,7% (20x15x0,5cm), hiệu điện thế 50V,
thời gian 5 giờ, trong đệm TAE 0,5X. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4),
VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9), pMGY-SB (ĐC(+)).

Quy trình thực hiện tuy có cải tiến nhưng kết quả không thay đổi nhiều. Tất cả
những mẫu lai được cắt bằng hai enzym cắt BamHI và EcoRV sau khi chuyển lên
màng, lai với probe và đều cho kết quả âm tính khi phát hiện trên X-ray film. Mẫu đối
chứng dương là những sản phẩm có kích thước nhỏ và đều chứa trình tự bổ sung với

probe, nên khả năng bắt cặp với probe là rất cao.
Bảng 4.1. Những khó khăn và những giải pháp khắc phục trong thực hiện phản
ứng lai Southern
Phương pháp
Khó khăn
Cách giải quyết
1. thực hiện phản ứng cắt
với thể tích lớn để có thể
tạo được một lượng mẫu
có nồng độ cao.

2. Điện di tạo mẫu lai

1. Thể tích phản ứng lớn
khó có thể bơm vào giêng
điện di.


2. thực hiện quá trình
điện di khó đạt được.
1. cô đọng sản phẩm cắt
bằng phương pháp sau:
- thêm NaOAc (1/10V).
- thêm ethanol 100%
(2V).
2. Điện di ở hiệu điện thế
30V, thời gian >4 giờ,
ĐC(+) 1 2 3 4 5 6 7 9ĐC (+)1 2 3 4 5 6 7 8 9
BamHI EcoRI
37

3. Chuyển lên màng.






4. thực hiện phản ứng lai.



3. DNA chuyển lên màng
không hoàn toàn, và khó
gắn kết lên màng.




4. Lai không chuyên biệt,
bắt cặp không hoàn toàn.
điện di trong đệm TBE
1X để sự phân tách DNA
được tốt hơn.
3. Thực hiện điện di trong
gel nồng độ thấp và độ
dày nhỏ hơn 0,5 cm. Có

thể thực hiện chuyển
bằng điện. Quá trình phơi
khô màng nên phơi khô ở
80
0
C trong vaif giờ.
4. Nhiệt độ lai có thể tăng
lên 68
0
C, để sự bắt cặp
chuyên biệt hơn.



So sánh với kết quả của Nguyễn Văn Lẫm và Lê Minh Kha (2005), sản phẩm
PCR có kích thước 6,26 bp được sử dụng để đánh dấu probe đồng thời được sử dụng
làm đối chứng dương. Kết quả phản ứng lai vẫn chỉ có mẫu đối chứng dương (sản
phẩm PCR) cho tín hiệu bắt cặp sau khi lai. Nguyên nhân mà Nguyễn Văn Lẫm và Lê
Minh Kha (2005) đưa ra là do nồng độ DNA thấp không đủ tín hiệu để phát hiện sự
bắt cặp giữa trình tự đích và probe, nguyên nhân thứ hai là do DNA không được
chuyển hoàn toàn lên màng bắng phương pháp mao dẫn hướng lên. Khắc phục nguyên
nhân thứ nhất tôi đã tiến hành tạo mẫu DNA với nồng độ cao hơn (2µg), nhưng để tạo
ra được một phản ứng cắt có thể cắt được một lượng DNA có nồng độ cao thì phải
thực hiện ở thể tích lớ, điều đó lại gây khó khăn trong việc load mẫu điện di. DNA
được load đầy giếng làm đo lượng mẫu sau khi điện di không cô đọng lại dưới đáy
miếng gel từ đó tạo một khoảng cách lớn giữa DNA cần chuyển với màng
nitrocellulose dẫn đến hiệu quả chuyển không tốt. Qua thực nghiệm tôi đã rút ra được
những kinh nghiệm sau: (Bảng 4.1)

38

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận
Những nội dung thực hiện đưa ra tôi đã hoàn thành được những nội dung sau:
- Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea, DNA ly trích có
thể được sử dụng cho phản ứng lai.
- Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn tốt.
- Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5 .
- Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn.
- Thực hiện phản ứng đánh dấu plasmid pMGY-SB thành công cho phản ứng lai.
- Tạo mẫu cho quá trình lai tuy hoàn thành nhưng chưa thực hiện tốt và cần
phải có nhiều cải tiến.

5.2 Đề nghị
39

Với những thuận lợi sẵn có về trang thiết bị, điều kiện làm việc và tầm quan
trọng của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh
đạo ôn ở nước ta, chúng tôi có một vài đề nghị như sau:
- Tiếp tục hoàn thiện quy trình Southern blot.
- Tiếp tục hoàn thiện việc phân tích đa dạng di truyền của nấm M. grisea bằng
phương pháp RFLP.







TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Huỳnh Văn Thái, Phạm Duy, 2005. Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào
tế bào vi khuẩn E.coli DH5 . Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Công Nghệ Sinh Học.
Đại học Nông Lâm TP. HCM.
2. Lê Minh Kha, Nguyễn Văn Lẫm, 2005. Thiết lập quy trình Southern blot. Khóa
luận tốt nghiệp kỹ sư Công NGhệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3. Lê Minh Triết, 2003. Bài Giảng Môn Học Cây Lúa. Khoa Nông Học- Đại Học
Nông Lâm TP. HCM.
4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh Học Phân Tử-Giới Thiệu Phương
Pháp và Ứng Dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. HCM, trang 63-74.
40

5. Nguyễn Thị Thư Hương, 2004. Xác định gen gây độc của nấm Metarrhizium ký

sinh trên sâu hại cây trồng bằng kỹ thuật PCR. Luận án thạc sĩ. Trường Đại Học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
6. Võ Thị Thu Oanh, 2000. Bệnh Cây Chuyên Khoa. Khoa Nông Học- Đại Học
Nông Lâm TP. HCM.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
7. Derek Robinson, Paul R.Walsh, and Joseph A. Bonventre, 2001. Molecular
Biology Problem Solver: A Laboratory Guide. Wiley-Liss, Inc, p 224-244.
8. Hitoshi Nakayashiki, Kanako Kiyotomi, Yukio Tosa, and Shigeyuki Mayama,
1999. Transposition of the Retrotransposon MAGGY in Heterologous Species of
Filamentous Fungi. Laboratory of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Kobe
University, Kobe 657-8501, Japan.
9. Hamer JE, Farral L, Orbach MJ, Valent B, Chumley FG, 1989. Host specie-
specific conservation of a family of repeat DNA sequences in the genome of a
fungal plant pathogen. Proc Nat Acad Sci USA 86: 9981-9985)
10. Jose Romao and John E. Hamer, 1992. Genetic organization of repeated DNA
sequence family in the rice.department ò Biological Sciences, Purdue
University, West Lafayette.
11. Le Dinh Don, 2000.DNA-fingerprinting Analysis and PCR-based Diagnosis of
the Population of Magnaporther grisea. The Graduate School of Science and
Technology Kobe University, pp 31-37.
12. Le Dinh Don,Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki and Shigeyuki Mayama, 1999.
Annals of the Phytopathological Scociety of Japan.
13. Motoaki Kusaba, Yukio Eto, Le Dinh Don, Natsuka Nishimoto, Yukio Tosa,
Hitoshi Nakayashiki and Shigeyuki Mayama, 1999. Genetic diversity in
Pyricularia isolates from varios Hosts Revealed by Polymorphisms of Nuclear
Ribosomal DNA and the Distribution of the MAGGY Retrostranposon. Annals
of the Phytopathological Society of Japan.
41

14. Sambrook Joseph and Rusell W.David, 2001. Molecular Cloning A Laboratory

Manual. Volume 1. 3
rd
edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York.
15. Verel Shull John E. Hamer, 1996. Springer- Verlag.
16. Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki, Hideyuki Hyodo, Shigeyuki Mayama, Hạime
Kato and Sally A. Leong, 1995. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. Support.
17. Y. Eto, K. Ikeda, I. Chuma, T. Kataoka, S. Kuroda, N. Kikuchi, L. D. Don, M.
Kusaba, H. Nakayashiki, Y. Tosa, S. Mayama, 2000. Comparative analyses of
the distribution of various transposable element in Pyricularia and their activity
during and after the sexual cycle. Springer-Verlag.

CÁC TRANG WEB

http//:www.knowledgebank.irri.orgricedoctor_mxFact_Sheets/Diseases/Rice_Blast.htm
/>orthe.html