Bước đầu ứng dụng kỹ thuật southern Blot phân tích đa dạng di truyền nấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC









ĐẶNG TRẦN ANH THƢ



BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT
SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI
TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea
GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA



LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC











BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT
SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI
TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea
GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA


LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐẶNG TRẦN ANH THƢ

KHÓA: 2002 - 2006




Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY











POPULATION STRUCTURE OF
Magnaporthe grisea EXAMINED INITIALLY
BY SOUTHERN BLOT


GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor Student
LE DINH DON DANG TRAN ANH THU
TERM: 2002 - 2006







HCMC, 09/2006

i
LỜI CẢM TẠ


TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố
Hồ Chí Minh
Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN
Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi
hoàn thành khóa luận này.
Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực
tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh.

Thầy Nguyễn Đức Sáng đã giúp đỡ tôi về hóa chất và vật liệu nghiên cứu
trong thời gian làm đề tài.
Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ
môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình
giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận.
Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi
trong thời gian thực tập.
CON THÀNH KÍNH BIẾT ƠN
Cha Mẹ, các em và người thân trong gia đình đã ủng hộ và hỗ trợ con về mặt vật
chất cũng như tinh thần để con có thể hoàn thành tốt khóa học này.

TP Hồ Chí Minh tháng 8/2006
Đặng Trần Anh Thư

ii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN

ĐẶNG TRẦN ANH THƯ, Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng
08/2006. “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng
di truyền của nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”.
Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐÔN
 Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử RFLP trên cở sở phương pháp
Southern blot và phân tích sự khác biệt về sự thay đổi cấu trúc gen dẫn đến
phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea.
 Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm
Magnaporthe grisea, làm cơ sở để đánh giá và có phương pháp phòng trị cho
phù hợp.
 Phƣơng pháp nghiên cứu:

- Thực hiện ly trích và phân cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn
- Tiến hành phân tách các đoạn DNA cắt giới hạn trên gel agarose, chuyển
và cố định DNA lên màng
- Thực hiện phản ứng lai với phân tử probe là DNA plasmid được đánh dấu
và phát hiện bằng huỳnh quang
- Sử dụng phần mềm để phân tích tính đa dạng di truyền.
 Kết quả:
- DNA ly trích tốt và thực hiện thành công phản ứng cắt giới hạn
- Biến nạp và ly trích thành công các loại plasmid được cung cấp để đánh
dấu sư dụng cho phản ứng lai phát hiện MAGGY trong genome của M. grisea
- Thực hiện phản ứng lai với probe pMGY-SB thành công đối mẫu đối
chứng là plasmid pMGY-SB.
 Kết luận :
Do quy trình Southern blot chưa hoàn thiện trong điều kiện phòng thí nghiệm ở
TT PTTNHS của trường Đại học Nông Lâm và hạn chế về mặt thời gian nên
kết quả của phản ứng lai đã không đi đến thành công. Do đó, không có cơ sở để
phân tích sự đa dạng di truyền trên nấm M. grisea.


iii
MỤC LỤC
PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ .................................................................................................................... i
Tóm tắt ........................................................................................................................ ii
Mục lục ...................................................................................................................... iii
Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... vi
Danh sách các hình ................................................................................................... vii
Danh sách các bảng ................................................................................................. viii
1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu ........................................................................................ 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3
2.1. Sơ lược về cây lúa ......................................................................................... 3
2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) ................................................................. 3
2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa ......................................... 3
2.2.2. Triệu chứng bệnh của cây lúa bị bệnh cháy lá lúa .............................. 4
2.2.3. Đặc điểm phát sinh bệnh ..................................................................... 5
2.2.4. Nguyên nhân gây bệnh ........................................................................ 5
2.3. Phương pháp Southern blot ............................................................................ 6
2.4. Enzyme cắt giới hạn ....................................................................................... 7
2.5. Các phương pháp chuyển DNA lên màng ...................................................... 8
2.5.1. Phương pháp mao dẫn hướng lên ........................................................ 8
2.5.2. Phương pháp mao dẫn hướng xuống ................................................... 9
2.5.3. Phương pháp mao dẫn hai chiều ......................................................... 9
2.5.4. Phương pháp chuyển bằng điện .......................................................... 9
2.5.5. Phương pháp chuyển bằng chân không ............................................... 9
2.6. Probe đánh dấu sử dụng trong Southern Blot .............................................. 10
2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea .................................... 10
2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích
đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea ............................................ 12

iv
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 14
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ................................................................... 14
3.2. Đối Tượng khảo sát ...................................................................................... 15
3.3. Nội dung thực hiện ....................................................................................... 15
3.4. Vật liệu và hóa chất ...................................................................................... 16
3.4.1. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................ 16
3.4.2. Hóa chất ............................................................................................. 16

3.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 17
3.5.1. Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm M. grisea (isolate) ............ 17
3.5.1.1. Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm ................... 17
3.5.1.2. Ly trích DNA theo phương pháp lysis ...................................... 18
3.5.1.3. Phương pháp tinh sạch DNA ...................................................... 18
3.5.2. Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ............................... 18
3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp.............................................................. 18
3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi
khuẩn E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của
Sambrook và cộng sự, 1989) .......................................................... 19
3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp ........................................................... 19
3.5.2.4. Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit ......................... 21
3.5.3. Thực hiện đánh dấu plasmid ............................................................. 22
3.5.4. Tạo mẫu lai ........................................................................................ 22
3.5.4.1. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng
enzyme cắt giới hạn ..................................................................... 23
3.5.4.2. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose ........................................ 23
3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng
phương pháp mao dẫn hướng lên................................................ 24
3.5.4.4. Làm khô màng ........................................................................... 25
3.5.4.5. Cố định DNA lên màng .............................................................. 25
3.5.5. Lai southern ...................................................................................... 26
3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai ............................................................... 26
3.5.5.2. Rửa màng sau khi lai .................................................................. 26

v
3.5.5.3. Phát hiện kết quả trên phim X-ray .............................................. 27
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 28
4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea. ................................................... 28
4.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào

vi khuẩn E.coli DH5α ............................................................................ 30
4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea
bằng enzym cắt giới hạn ...................................................................... 31
4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi được cắt bằng
EcoRV và BamHI với probe SB ......................................................... 33
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 38
5.1. Kết luận ....................................................................................................... 38
5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 38
TÀI NIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 49

vi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT


bp: base pair
B: Bam HI
Ctv cộng tác viên
DNA: Deoxyribonucleic acid
2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol
DIG: Digoxigenin
E: Eco RV
ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid
H: Hind III
HRP: Horseradish peroxydase
Kb: kilobase
PCR: Polymerase Chain Reaction
RE: Restriction Enzyme
RFLP: Restriction fragment length polymorphism
RNA: Ribonucleic acid
RT: Reverse transcrip
SDS: Sodium dodecyl sulfate
SSC: Saline sodium citrate

TAE: Tris Acetate EDTA
TBE: Tris-base Boric EDTA
UV: Ultraviolet (light)
w/v: Weight for volume











vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH



Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lá lúa (a) và trên cổ bông (b) ................... 4
Hình 2.2. Bào tử nấm M. grisea chụp dưới kính hiển vi ........................................ 5
Hình 2.3. Vòng đời của nấm M. grisea ................................................................... 6
Hình 2.4: Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY ................................................ 10
Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea .......................................................... 28
Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi được xử lý với RNAse .... 30
Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8 ............................ 31
Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số
bằng enzyme giới hạn ........................................................................... .32
Hình 4.5. Kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai ................................... 34

Hình 4.6. Kết quả phát hiện trên X-ray film ......................................................... 35

























viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các enzym cắt thông dụng……………………………………………. ... 7
Bảng 3.1. Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai…………. .. ..16
Bảng 3.2. Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl…………………. . ..23
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl……… …23
Bảng 4.1. Những khó khăn và những giải pháp khắc phục
trong thực hiện phản ứng lai Southern ……………………………… …36
















1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

5.3. Đặt vấn đề
Magnaporthe grisea (Hebert) Barr. (anamorph, Pyricularia. grisea (Cooke)
Sacc.) là nguyên nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật thuộc họ Gramineae,
Cannaceae, Cyperaceae và Zingiberaceae [12]. Đặc biệt, loại nấm này là nguyên nhân

gây bệnh cháy lá (đạo ôn) trên cây lúa (Oryza sativa), đây là một loại bệnh nghiêm
trọng và gây tổn thất lớn đối với các nước trồng lúa trên thế giới. Hàng năm, năng suất
lúa gạo do bệnh này gây ra giảm 30% trên toàn thế giới. Ở Việt Nam, đạo ôn cổ gié đã
gây hại 138.000 ha trong năm 1991 và 217.000 ha trong năm 1992 ở đồng bằng Sông
Hồng. Bệnh cũng đã gây hại nghiêm trọng ở đồng bằng Sông Cửu Long từ 1978-1981
[11]. Theo báo cáo của Cục Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn,
tổng diện tích bị nhiễm bệnh đạo ôn trong vụ Đông Xuân 2003-2004 là 37.029 ha
(tăng 3 lần so với Đông Xuân 2003), vụ Hè Thu 2006 là 38.346 ha lúa bị nhiễm đạo ôn
lá và 4046 ha bị nhiễm đạo ôn cổ bông.
Trong những năm gần đây, người trồng lúa đã áp dụng nhiều biện pháp phòng
trừ như: phun thuốc diệt nấm và tăng cường trồng giống kháng trên diện rộng. Thuốc
diệt nấm có thể giảm một phần thiệt hại của bệnh nhưng không tiêu diệt được bệnh.
Những giống kháng có thể kháng được bệnh đạo ôn nhưng chỉ có thể duy trì được tính
kháng trong một thời gian ngắn. Điều này có thể được giải thích rằng nấm
Magnaporthe grisea có sự đa dạng di truyền trong quần thể [11]. Một số giả thuyết
cho rằng những yếu tố chuyển vị (transposon) [12], thể dị hạch (heterokaryosis), và sự
tái tổ hợp trong sinh sản hữu tính có thể là nguyên nhân tạo nên sự đa dạng di truyền
trong quần thể nấm M. grisea [14].
Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, nhiều kĩ thuật mới ra
đời như kĩ thuật PCR, Southern blot, đọc trình tự v.v.. giúp cho quá trình nghiên cứu
cấu trúc di truyền của quần thể sinh vật thuận lợi hơn. Những kỹ thuật này đã được
ứng dụng để nghiên cứu sự đa hình trong quần thể dựa trên những DNA marker như:
RFLP, ALP, AFLP, RAPD, DAF, SSR, AP-PCR, SSCP, MRDHV-DNA, SNP [1].
Trên thế giới, các kĩ thuật này đã được áp dụng thành công trong việc nghiên cứu về
2

sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea. Ở nước ta, những nghiên cứu như
vậy còn rất ít.
Xuất phát từ tình hình trên, tôi đã thực hiện đề tài “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ
thuật Southern blot phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe

grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”, nhằm phân tích được cấu trúc di truyền
giữa các dòng nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở các tỉnh
đồng bằng Sông Cửu Long.
5.4. Mục đích – Yêu cầu
5.4.1. Mục đích
Bước đầu phân tích đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh
đạo ôn bằng phương pháp Southern blot.
5.4.2. Yêu cầu
- Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm Magnaporthe grisea.
- Ly trích DNA các dòng nấm Magnaporthe grisea.
- Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt DNA genome bằng các enzyme giới hạn.
- Tạo được phân tử probe đánh dấu từ DNA plasmid.
- Thiết lập được phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X – ray.














3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Sơ lƣợc về cây lúa
Lúa thuộc họ Gramieae, loại Oryza, loài Oryza sativa. Lúa đang được trồng
thuộc loài phụ Indica (lúa tiên) và Japonica (lúa cánh). Lúa là một loại cây lương thực
quan trọng trên thế giới, đặc biệt là ở các nước Đông Nam Á. Lúa có giá trị dinh
dưỡng cao và được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, cung cấp năng lượng
cho con người sống và hoạt động. Cây lúa có nguồn gốc lâu đời và đã được thuần hóa
từ cây lúa hoang dại, bán hoang dại, dị hợp tử và đầy những biến dị. Quá trình thuần
hóa cũng là quá trình lai tạo tự nhiên, đột biến gen do môi trường và sự chọn lọc của
con người qua hàng ngàn năm.
Việt Nam là một nước nhiệt đới nóng ẩm, thích hợp cho sự sinh trưởng và phát
dục của cây lúa, vì vậy hầu hết các địa phương đều có trồng lúa. Nơi quá cao không có
hệ thống thủy lợi, người ta cũng trồng lúa cạn. Do vị trí địa lý nước ta chạy dọc theo
bờ biển, địa hình, địa thế cao thấp khác nhau, có điều kiện khí tượng thủy văn khác
nhau, nên hình thành các vụ lúa và các vùng trồng lúa khác nhau. Nước ta có ba vùng
trồng lúa lớn là: vùng lúa Bắc bộ và bắc Trung bộ, vùng lúa Trung và nam Trung bộ,
vùng lúa ở Nam bộ [5].
Lúa thường gặp rất nhiều loại bệnh mà nguyên nhân chủ yếu là do nấm, vi
khuẩn và số ít là do virus. Bệnh do nấm gây ra điển hình như: bệnh đạo ôn, đốm nâu,
bệnh khô vằn và một số bệnh khác. Bệnh do vi khuẩn gây ra như: cháy bìa lá lúa, bệnh
vàng lá lúa. Bệnh do virus gây ra như lùn soắn lá lúa. Trong đó, bệnh do nấm gây ra là
thường gặp nhất và gây tổn thất nhiều nhất [6].
2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn)
2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa
Bệnh được ghi nhận và mô tả đầu tiên tại Trung Quốc vào năm 1637. Năm
1704, M. Tsuchiya (Nhật) bắt đầu nghiên cứu hiện tượng cháy lá trên cây lúa. Sau đó,
bệnh được báo cáo có ở nhiều quốc gia khác như là Ý (1788), Mỹ (1876) và Ấn Độ
(1913). Đây là bệnh phân bố rộng và có mặt trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới
[2]. Ở Nhật từ năm 1953-1960, thiệt hại về năng suất là 2,98%, tính riêng trong năm
4

1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24% trong tổng thất thu do sâu, bệnh, bão lũ.
Bệnh có thể làm mất trắng như ở Hà Đông (Việt Nam). Đối với bệnh thối cổ gié, ước
tính cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỉ lệ hạt kém phẩm chất gia
tăng 5%. Ở Miền Bắc, các vùng Hải Phòng, Thái Nguyên, Ninh Bình, Bắc Giang, Hà
Đông bị thiệt hại nặng. Ở đồng bằng sông Cửu Long, hàng năm thường có hai cao
điểm của bệnh là tháng 11-12 dương lịch và tháng 5-6 dương lịch. Các huyện Châu
Thành, Chợ Gạo, Cai Lậy, Chợ Mới (An Giang), Thạnh Trị (Cần Thơ) là những nơi
thường có bệnh [6].
2.2.2. Triệu chứng bệnh cháy lá trên cây lúa
Bệnh cháy lá lúa là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên cây lúa, còn được gọi là
bệnh đạo ôn. Khi dịch cháy lá xảy ra trên diện rộng thì năng suất và sản lượng sẽ giảm
rất rõ và thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế. Tác nhân gây bệnh có thể tấn công mọi
giai đoạn của cây lúa; bắt đầu từ giai đoạn mạ hoặc sau khi gieo xạ cho đến trước trổ
thì gọi là bệnh cháy lá. Bệnh có thể gây hại trên cổ lá nên gọi là thối cổ lá, hoặc gây
hại trên cổ bông nên được gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh có thể gây lem
vỏ hạt lúa.

a) b)
Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên
lá lúa (a) và trên cổ bông (b).
Nguồn: http//:aesrg.tamu.edu/Ricerice.htm

Trên mạ: vết bệnh có hình thoi nhỏ, màu hồng hoặc nâu vàng. Bệnh nặng, từng
đám vết bệnh liên kết kế tiếp nhau tạo thành những mảng cháy khô trên lá và thân làm
cho cây mạ khô héo dần rồi chết.
5

Trên lá: vết bệnh hình thoi màu nâu nhạt, rộng ở phần giữa và nhọn ở hai đầu,
giữa vết bệnh có màu xám tro, xung quanh nâu đậm, vòng ngoài cũng có màu nâu

nhạt. Kích thước vết bệnh biến thiên từ một chấm nhỏ như mũi kim đến chiều dài
1,5cm, khi bệnh nặng các vết bệnh nối với nhau tạo thành những vệt lớn làm cho lá bị
cháy.
Trên thân, cổ bông: ban đầu trên lá có một chấm nhỏ màu nâu xám, về sau lớn
dần bao quanh đốt thân làm thân thắt lại, trên cổ bông làm bông bị bạc (xuất hiện
sớm), bông bị gãy gục (xuất hiện chậm khi hạt đã chắc).
Trên hạt: vết bệnh không định hình có màu đen hoặc nâu đen [6].
2.2.3. Đặc điểm phát sinh bệnh
Bệnh phát sinh thất thường, tùy thuộc vào yếu tố ngoại cảnh. Bệnh phát triển
mạnh trong điều kiện nhiệt độ thấp (20
0
C), ẩm độ không khí cao và có gió mạnh. Khi
không có đủ ánh sáng do mây mù, lúa sẽ tập trung nhiều Glutamic và nhiều amino acid
khác nên sẽ tăng tính nhiễm của cây.[6]
2.2.4. Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh do nấm Magnaporthe grisea (Herbert) Barr. (anamorph, Pyricularia
grisea (Cooke) Sacc.), thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliales, lớp Hyphomycetes. Đặc
điểm của nấm này là sinh bào tử có kích thước 20-22 x 10-12 µm. Cành bào tử phân
sinh có hình trụ, đa bào màu nhạt có từ 3-6 đốt, trên mỗi cành có từ 3-10 bào tử. Bào
tử phân sinh có hình quả lê, có từ 2-3 ngăn ngang, không màu, có vỏ mỏng.
Nấm M. grisea sinh ra hai loại độc tố: acid alpha-picolinic (C
6
H
5
NO
2
) và
pyricularin (C
18
H

14
N
2
O
3
). Các độc tố này ức chế sự phát triển của cây mạ và sự nảy
mầm của bào tử nấm làm cây bệnh tạo và tập trung chất coumain khiến cây lúa bị lùn.

Hình 2.2. Bào tử nấm Magnaporthe grisea chụp dƣới kính hiển vi.
(Nguồn:

6


Hình 2.3. Vòng đời của nấm Magnaporthe grisea.
(Nguồn: http//:www.knowledgebank.irri.orgricedoctor_mxFact_
Sheets/Diseases/Rice_Blast.htm)

2.3. Phƣơng pháp Southern blot
Southern blot (Southern 1975) là phương pháp để kiểm tra sự hiện diện của một
đoạn gen nào đó trong genome, với sự chính xác và độ đặc hiệu cao. Đầu tiên cần tách
chiết DNA bộ gen của tế bào, sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành
các đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách các đoạn DNA theo kích thước. DNA
được biến tính trên gel bằng dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5 M; NaCl 1,5 M),
sau đó chuyển các đoạn DNA từ bản gel lên màng lai bằng lực mao dẫn (màng lai
thường sử dụng là màng nilon hoặc nitrocellulose). Vị trí của các đoạn DNA trên gel,
được giữ yên khi chuyển lên màng lai.
Sử dụng các phân tử probe có đánh dấu phóng xạ hoặc không đánh dấu phóng
xạ lai với các đoạn DNA trên màng lai, tạo nên các phân tử DNA lai. Tiến hành lai
phân tử bằng cách cho vào hộp lai chuyên dụng một lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai,

chứa mồi có đánh dấu phóng xạ. Đặt màng lai vào hộp lai ở nhiệt độ 65
0
C trong 3 – 8
giờ, sau đó thêm dịch lai với chế độ nhiệt 65
0
C, lắc nhẹ để tăng tốc độ phản ứng. Rửa
màng lai bằng dung dịch SSC (NaCl, natri citrat, và nước) ở nhiệt độ 65
0
C hai đến ba
lần, thấm khô bằng giấy lọc hoặc sấy khô ở 65
0
C. Thực hiện phóng xạ tự ghi bằng
phim X quang nhạy ở nhiệt độ - 20
0
C, xử lý dưới ánh sáng tử ngoại trong 4 giây để
kiểm tra kết quả lai [13].
7

2.4. Enzyme cắt giới hạn
Trong phân tích genome, restriction endonuclease là nhóm enzyme có nhiệm vụ
cực kỳ quan trọng. Đó là nhóm DNAse nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA từ 4 –
6 cặp nucleotide (nếu 4 loại nucleotide của phân tử DNA sắp xếp ngẫu nhiên có bốn
kiểu sắp xếp khác nhau). Trường hợp enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc
hiệu gồm bốn cặp nucleotide, cứ 4
4
= 256 cặp nucleotide có một vị trí cắt. Khi các
enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu có 6 cặp nucleotide, cứ 4
6
= 4096
cặp nucleotide có một chỗ bị cắt. Người ta xem nó như là chìa khóa để nghiên cứu kỹ

thuật DNA tái tổ hợp (recombinant).
Các enzyme này được nghiên cứu lần đầu tiên vào những năm 1950. Nó bao
gồm một phần của tính chất giới hạn (restriction) viết tắt R, và một phần của tính chất
cải tiến (modification) viết tắt là M. Hệ thống R-M trong vi khuẩn giúp nó bảo vệ
chống lại sự xâm nhập của thực khuẩn thể, và những nhân tố di truyền lạ. Hệ thống R-
M của vi khuẩn có xu hướng tạo ra một thế cân bằng ở sinh vật tiền nhân (prokaryote)
như là một hệ thống miễn dịch [7].
Bảng 2.1. Các enzym cắt thông dụng.
Enzyme Chuỗi mã di truyền bị tác động
BamHI
BglII
EcoRI
HindIII
HpaI
KpnI
PstI
SmaI
SacI
SalI
AluI
Taq
G/GATCC
A/GATCT
G/AATTC
A/AGCTT
GTT/AAC
GGTAC/C
CTGCA/G
CCC/GGG
GAGCT/C

G/TCGAC
AG/CT
T/CGA


8

Hệ thống R-M thường có hai hoạt động chính:
- Một là restriction endonuclease, viết tắt là R-Enase, rất chuyên tính tại
một vị trí nào đó, nó có nhiệm vụ phân hủy DNA ngoại sinh (exogenus DNA).
- Hai là modification methylase của DNA, còn được gọi là
methyltranferase, viết tắt là M-MTase, có sự chuyên tính về chuỗi mã rất đồng nhất.
M-MTase có nhiệm vụ cải tiến và bảo vệ DNA nội sinh (endogenus DNA) không bị
phân hủy bởi R-Enase [7].
2.5. Các phƣơng pháp chuyển DNA lên màng
2.5.1. Phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên
Sau quá trình điện di, những phân đoạn DNA được giữ trong gel. Gel này được
đặt trên một dòng lưu chất và dòng lưu chất này vận chuyển trên bề mặt của một vật
thể rắn, phẳng (Southern, 1975). Dòng dịch lỏng này sẽ lưu chuyển qua miếng gel
bằng lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm [14].
Tốc độ vận chuyển của DNA phụ thuộc vào kích thước của DNA và nồng độ
gel agarose được sử dụng. Đối với những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn 1 kb
thì hầu hết nó được vận chuyển nhanh, đối với những đoạn DNA có kích thước lớn
thì sự vận chuyển của chúng chậm chạp hơn thường mất khoảng 18 giờ và ít có
hiệu quả [6].
2.5.2. Phƣơng pháp mao dẫn hƣớng xuống
Những đoạn phân tử DNA được giữ trong gel để trực tiếp bên dưới một dòng
lưu chất alkaline buffer và sự tồn lưu của chúng trên bề mặt của màng. Khi đó, dòng
dung dịch đệm sẽ lưu chuyển qua gel nhờ lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm ở
dưới. Sự vận chuyển những đoạn DNA nhanh và cường độ tín hiệu khoảng 30% khi

được chuyển bằng hệ thống hướng lên. Sự cải tiến này có hiệu quả khi thực hiện sự di
chuyển những đoạn phân DNA thông qua gel [14].
2.5.3. Phƣơng pháp mao dẫn hai chiều
Khi những đoạn trình tự đích hiện diện ở nồng độ cao thì phương pháp mao dẫn
được sử dụng vận chuyển DNA đồng thời (hiện tượng mao dẫn hướng lên và hướng
xuống) và nhanh từ một gel đơn đến hai màng nitrocellulose hoặc nylon. Đệm chuyển
là dung dịch đệm có trong gel và hiệu quả vận chuyển kém. Không dùng phương pháp
9

này đối với những thử nghiệm đòi hỏi tính nhạy cao. Tuy nhiên, phương pháp này có
thể được sử dụng để phân tích plasmid, acteriophages, hoặc cosmid 235 [14].
2.5.4. Phƣơng pháp chuyển bằng điện
Theo phương pháp này, những phân đoạn DNA sẽ di chuyển từ gel đến màng
lai thông qua dòng điện. Dung dịch đệm đóng vai trò lưu dẫn dòng điện. Do sự điện
giải, tính dẫn điện của dung dịch giảm dần, vì thế cần sử dụng một lượng dung dịch
đệm thích hợp để dòng điện luôn ổn định trong khi chuyển. Tốc độ chuyển phụ thuộc
vào kích thước đoạn DNA, nồng độ gel và hiệu điện thế dòng điện [14].
2.5.5. Phƣơng pháp chuyển bằng chân không
Phương pháp này tương tự phương pháp mao dẫn. Buồng chân không sẽ kéo
dung dịch chuyển xuyên qua gel và màng, DNA từ gel sẽ di chuyển theo sự di chuyển
của dung dịch đệm đến màng. So với phương pháp mao dẫn, phương pháp này nhanh
và hiệu quả hơn [14].
2.6. Probe đánh dấu đƣợc sử dụng trong Southern blot
Probe là những đoạn acid nucleic (DNA, RNA hoặc oligonucletide) đã biết rõ trình
tự và kích thước, dùng để định vị các đoạn acid nucleic cần nghiên cứu có trình tự bổ
sung với trình tự của probe, qua một phản ứng chuyên biệt gọi là lai phân tử. Probe có
độ đặc hiệu cao, do đó nó có thể phát hiện ra đoạn gen cần tìm trong hàng ngàn đoạn
DNA hoặc RNA khác nhau. Có hai hệ thống đánh dấu probe. Hệ thống đánh dấu
(labeling) bằng chất đồng vị phóng xạ như
32

P,
35
S,
125
I,
3
H, được phát hiện bằng hiện
tượng phóng xạ tự ghi hoặc sử dụng các loại máy đếm Geiger- Muller. Hệ thống đánh
dấu không dùng chất đồng vị phóng xạ như Biotin, Enzyme, Chemiluminescence,
Fluorescence, Kháng thể (Antibodies). Hệ thống phát hiện và đánh dấu không dùng
phóng xạ bao gồm các hệ thống có thuật ngữ chuyên môn là “horseradish peroxidase”,
“digoxigenin - antidigoxigenin”, và “biotin – streptavidin”. Cả ba hệ thống này, thể
probe lai có thể sẽ được phát hiện với cơ chất chromogenic. Cơ chất này sẽ tạo ra ánh
sáng đối với enzyme có trong hệ thống [2]. Đánh dấu probe được thực hiện bằng một
số phương pháp sau: phương pháp nick – translation, phương pháp random priming
(thiết lập mồi ngẫu nhiên), phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi),
phương pháp photobiotin.

10

2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea
Transposon là yếu tố thường gặp trong cả prokaryote và eukaryote, đây là
những vùng có khả năng chuyển vị trong genome. Trong những năm gần đây, những
yếu tố này được phát hiện tăng số lượng trong các loài nấm sợi. Transposon của nấm
cũng giống như transposon của của các loài eukaryote khác, chúng được phân thành 2
nhóm chính. Các yếu tố nhóm I chuyển vị qua trung gian RNA, các yếu tố nhóm II
chuyển vị trực tiếp từ DNA sang DNA. Yếu tố nhóm I phân thành 3 loại:
retrotransposon LTR mã hóa enzyme RT (reverse transcription) và có chứa LTR (long
terminal repeat) ở cả hai đầu, retrotransposon LINE cũng mã hóa RT và có đuôi polyA
nhưng không có LTR và yếu tố SINE thể hiện đặc tính cần phải phiên mã bằng

polymerase RNA III và không có gen RT. Sự biểu hiện của các transposon trong vi
sinh vật luôn được quy định hoàn toàn bởi genome kí chủ. Nhưng hoạt tính của chúng
lại rất khác nhau tùy theo điều kiện xử lý: shock nhiệt, chiếu tia UV, nuôi cấy mô, lai
và chủng với vi khuẩn hoặc xử lý với những yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [17].
M. grisea là một loại nấm có phổ kí chủ rất rộng, chúng có thể kí sinh trên hơn 50
loại thực vật thân cỏ và một số loài cây 1 lá mầm khác [11]. Loại nấm này phân hóa và gồm
một số loại tác nhân gây bệnh chuyên biệt cho kí chủ. Tác nhân Oryza gây bệnh cho cây lúa
(Oriza sativa), Setaria gây bệnh trên loài kê đuôi cáo (Setaria italica), Panicum gây bệnh
trên loài kê thường (Panicum miliaceum), Triticum là tác nhân gây bệnh trên lúa mì
(Triticum aesticum), Eleusine là tác nhân gây bệnh trên kê hình ngón tay (Eleusine
coracana) và digitaria tác nhân gây bệnh trên loài cỏ crabgrass (Digitaria sanguinalis) [17].

Hình 2.4. Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY .
Các phân đoạn của nó pMGY18, pMGY23 (dòng kẻ đậm) và probe SB (bằng dòng kẻ trắng)
để đánh giá số lượng bản sao của MAGGY trong genome. Tên viết tắt của các enzym cắt:
BamHI (B), EcoRV (E), HindIII (H), PstI (P), SalI (S).(Yukio Tosa và ctv, 1995).
11

Genome M. grisea có 6 nhiễm sắc thể, có trọng lượng phân tử là 38 megabase
và kích thước mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau. Có nhiều transposon được tìm thấy
trong genome của M. grisea tạo nên những trình tự DNA lập lại được gọi là MGR (M.
grisea repeat), các MGR này giúp phân biệt các cá thể trong một quần thể nấm M.
grisea đa hình. Một số MGR được tìm thấy trong quần thể nấm M. grisea: MGR583,
MGR586, MGSR1, Grasshopper, MAGGY, Fosburi và Pot2 [9, 16]. Nhóm I gồm các
retrotransposon LTR Grasshopper, MAGGY và fosbury, retrotransposon MGR583-
LINE, yếu tố MGSR1-SINE và Mg-SINE, nhóm II gồm MGR586 hoặc Pot3 và Pot2.
MGR583 được cho là những yếu tố cũ, đã xuất hiện rất sớm trong quần thể M. grisea
trong quá trình tiến hóa của nó, LTR-retrotransposon MAGGY và Grasshopper thì bị
giới hạn, và được cho là những yếu tố mới cái mà gần đây mới xuất hiện trong quần
thể nấm Pyricularia bằng sự di chuyển ngang. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng

MAGGY là yếu tố hoạt động mạnh nhất trong các yếu tố được kiểm tra về sự chuyển
vị trong quần thể M. grisea [17].
MAGGY là một retrotransposon kích thước 5,6 kb, được phân tách từ nấm
Magnaporthe grisea và có 2 ORF và các LTR có kích thước 253-bp ( Farman và ctv
1996). ORF1 mã hóa chuỗi polypeptide gồm 457 amino acid, ORF2 có đặc tính của
gen pol mã hóa một polypeptide có chức năng protease. Hầu hết các retrotransposon
được tìm thấy trong các loại nấm sợi ngày nay được phân vào nhóm Ty3-gypsy với
một vài ngoại lệ. MAGGY có nhiều coppy trong bộ gen M. grisea phân lập được từ
cây lúa, cây kê đuôi cáo, và một số loại cỏ khác, nhưng chúng không tìm thấy trong
nấm M. grisea phân lập từ lúa mì [8].
2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền
của quần thể nấm Magnaporthe grisea
Hamer và ctv (1989) là những người đầu tiên tìm ra một họ những trình tự DNA
lập lại trong genome của M. grisea được gọi là MGR586. Ứng dụng phương pháp
DNA-fingerprinting sử dụng probe MGR586 đã mở ra một hướng mới trong nghiên
cứu cấu trúc của quần thể nấm M. grisea. Sau đó, những nghiên cứu này được phát
triển xa hơn trong nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể nấm gây bệnh cháy lá
trong các vùng trồng lúa trên thế giới. Một vài trình tự DNA lập lại trong quần thể nấm
này cũng được tìm thấy sau đó như: Pot2, Fosbury, MGSR1, MAGGY và được sử
12

dụng thay thế cho probe MGR586. Trong đó, MAGGY được xem là probe tốt nhất vì
trong một số trường hợp nó có thể cho thấy sự khác biệt giữa các nòi nấm M. grisea
trong cùng một kí chủ.
Hamer và ctv (1992) đã sử dụng probe MGR586, lai chéo với các dòng là tác
nhân gây bệnh cho lúa và những dòng không gây bệnh trong phòng thí nghiệm. Kết
quả ông đã tìm được 57 đoạn DNA cắt giới hạn được lai với probe MGR586 của dòng
gây bệnh trên lúa và phát hiện ra 8 nhóm liên kết. Những kết quả đó cho phép Hamer
xây dựng bản đồ 3 gen sắc tố (Alb1, Rsy1 và Buf1), vị trí lai (Mat1), tổ chức tạo nhân
con (Rdn1), gen Smo1 và hai đa hình RFLP liên kết với Smo1. Kết quả của Hamer đã

chỉ ra rằng vị trí của các MGR586 được phân bố một cách ngẫu nhiên trong genome
của nấm M. grisea.
Yukio Tosa và ctv (1995) đã sử dụng hai probe pMGY23 và pMGY18 được
tách dòng từ MAGGY, để phân tích sự phân bố của retrootransposon MAGGY trong
các dòng Pyricularia được phân lập từ các loài thực vật một lá mầm ở nhiều nước
khác nhau. Kết quả ông đã tìm thấy được nhiều bản sao của MAGGY trong các nòi
phân lập từ lúa và kê đuôi cáo (Setaria italica). Điều này chứng tỏ các nòi là tác nhân
gây bệnh trên lúa có quan hệ di truyền gần với nòi từ loài Setaria.
Pradeep Kachroo và ctv (1995) sử dụng phương pháp Southern blot với probe
Mg-SINE, phân tích genome của các nòi M. grisea. Qua nghiên cứu Kachroo đã phát
hiện ra khoảng 100 bản sao của Mg-SINE trên một thể đơn bội trong cả các nòi gây
bệnh cho lúa và các nòi không gây bệnh cho lúa.
Verel Shull và John E. Hamer (1996) sử dụng probe pCB586 để phát hiện đoạn
MGR586 trong quần thể nấm M. grisea. Phân tích sự giảm phân của MGR586 Shull
và Hamer đã tìm ra được một đa hình mới là MGR586-P2. P2 được tạo ra do một đoạn
chèn gần, đó là một retrotransposon chứa đoạn LTR. Kết quả các ông đưa ra rằng
những vị trí DNA đánh dấu có thể siêu biến tái sắp xếp chính xác.
Le Dinh Don và ctv (1998) phân tích cấu trúc quần thể nấm M. grisea ở Nhật
Bản bằng phương pháp DNA fingerprinting. Don đã sử dụng Probe SB lai với
MAGGY và MGR586. Kết quả đã cho thấy rằng có hai dòng liên kết trong quần thể
nấm, hai dòng này chỉ ra khả năng gây độc tương tự nhau. MAGGY thể hiện trong các
nhóm cũng tương tự như MGR586, mặc dù hai yếu tố nay khác nhau về tính chất và
13

cấu trúc. Điều này cho thấy rằng MAGGY có thể thay thế cho MGR586 trong những
nghiên cứu khác trong quần thể các nòi M. grisea gây bệnh cho lúa.
Le Dinh Don và ctv (1999) đã tiến hành phân tích cấu trúc di truyền của quần
thể nấm M. grisea gây bệnh đạo ôn trên vùng Đồng bằng Sông Hồng (1998) và Đồng
bằng Sông Cửu Long (1996). Ứng dụng phương pháp Southern blot sử dụng probe
chứa một đoạn phân lập từ MAGGY và đã phát hiện được 5 dòng chứa đoạn gen

MAGGY. Kết quả cho thấy có sự khác biệt giữa các nòi ở hai vùng trồng lúa này. Đầu
tiên, khả năng gây độc rất khác nhau đặc biệt là trên những dòng có gen kháng Pi-k
s
và
Pi-ta. Thứ hai, các nòi ở khu vực phía Bắc thì đa dạng về cấu trúc dòng hơn các nòi ở
khu vực phía Nam.
Motoaki Kusaba và ctv (1999) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể
nấm M. grisea được phân lập từ nhiều loại kí chủ khác nhau bằng sự đa hình các đoạn
MAGGY trong DNA genome. Kusaba nhận ra sự hiện diện với số lượng bản sao nhiều
của MAGGY trong genome, thực hiện đọc trình tự vùng ITS2 để xây dựng sơ đồ mối
quan hệ giữa các dòng. Những kết quả cho thấy rằng MAGGY di chuyển ngang trong
di truyền quần thể nấm M. grisea.
Những kết quả nghiên cứu đó đã xây dựng một cơ sở dữ liệu về bản đồ di truyền
của quần thể nấm M. grisea kí sinh trên nhiều loại cây trồng đặc biệt là trên cây lúa.
Cơ sở dữ liệu đó có thể được sử dụng cho những nghiên cứu sau này.












14

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành
3.1.1. Thời gian
Đề tài được tiến hành từ 06-02-2006 đến ngày 15-08-2006.
3.1.2. Địa điểm
Phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông Học, Đại Học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Phòng công nghệ sinh học, trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại
Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Đối Tƣợng khảo sát
Các dòng nấm Magnaporthe grisea được cung cấp từ Viện Lúa Đồng Bằng
Sông Cửu Long.
3.3. Nội dung thực hiện
- Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea.
- Thiết lập phản ứng cắt DNA genome bằng enzyme cắt giới hạn.
- Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5 .
- Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn.
- Thực hiện phản ứng đánh dấu plasmid.
- Tạo mẫu lai trên DNA genome của nấm M. grisea.
- Thực hiện lai Southern với probe palsmid pMGY-SB được đánh dấu bằng
biotin
3.4. Vật liệu và hóa chất
3.4.1. Dụng cụ và thiết bị
3.4.1.1. Dụng cụ
- Micropipette (0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl), đầu tip các loại
- Eppendorf 1,5 ml, 200 µl, ống ly tâm 15 ml