Luận văn : BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA part 2 doc

8

Hệ thống R-M thường có hai hoạt động chính:
- Một là restriction endonuclease, viết tắt là R-Enase, rất chuyên tính tại
một vị trí nào đó, nó có nhiệm vụ phân hủy DNA ngoại sinh (exogenus DNA).
- Hai là modification methylase của DNA, còn được gọi là
methyltranferase, viết tắt là M-MTase, có sự chuyên tính về chuỗi mã rất đồng nhất.
M-MTase có nhiệm vụ cải tiến và bảo vệ DNA nội sinh (endogenus DNA) không bị
phân hủy bởi R-Enase [7].
2.5. Các phƣơng pháp chuyển DNA lên màng
2.5.1. Phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên
Sau quá trình điện di, những phân đoạn DNA được giữ trong gel. Gel này được
đặt trên một dòng lưu chất và dòng lưu chất này vận chuyển trên bề mặt của một vật
thể rắn, phẳng (Southern, 1975). Dòng dịch lỏng này sẽ lưu chuyển qua miếng gel
bằng lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm [14].
Tốc độ vận chuyển của DNA phụ thuộc vào kích thước của DNA và nồng độ
gel agarose được sử dụng. Đối với những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn 1 kb
thì hầu hết nó được vận chuyển nhanh, đối với những đoạn DNA có kích thước lớn
thì sự vận chuyển của chúng chậm chạp hơn thường mất khoảng 18 giờ và ít có
hiệu quả [6].
2.5.2. Phƣơng pháp mao dẫn hƣớng xuống
Những đoạn phân tử DNA được giữ trong gel để trực tiếp bên dưới một dòng
lưu chất alkaline buffer và sự tồn lưu của chúng trên bề mặt của màng. Khi đó, dòng
dung dịch đệm sẽ lưu chuyển qua gel nhờ lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm ở
dưới. Sự vận chuyển những đoạn DNA nhanh và cường độ tín hiệu khoảng 30% khi
được chuyển bằng hệ thống hướng lên. Sự cải tiến này có hiệu quả khi thực hiện sự di
chuyển những đoạn phân DNA thông qua gel [14].
2.5.3. Phƣơng pháp mao dẫn hai chiều
Khi những đoạn trình tự đích hiện diện ở nồng độ cao thì phương pháp mao dẫn
được sử dụng vận chuyển DNA đồng thời (hiện tượng mao dẫn hướng lên và hướng
xuống) và nhanh từ một gel đơn đến hai màng nitrocellulose hoặc nylon. Đệm chuyển

là dung dịch đệm có trong gel và hiệu quả vận chuyển kém. Không dùng phương pháp
9

này đối với những thử nghiệm đòi hỏi tính nhạy cao. Tuy nhiên, phương pháp này có
thể được sử dụng để phân tích plasmid, acteriophages, hoặc cosmid 235 [14].
2.5.4. Phƣơng pháp chuyển bằng điện
Theo phương pháp này, những phân đoạn DNA sẽ di chuyển từ gel đến màng
lai thông qua dòng điện. Dung dịch đệm đóng vai trò lưu dẫn dòng điện. Do sự điện
giải, tính dẫn điện của dung dịch giảm dần, vì thế cần sử dụng một lượng dung dịch
đệm thích hợp để dòng điện luôn ổn định trong khi chuyển. Tốc độ chuyển phụ thuộc
vào kích thước đoạn DNA, nồng độ gel và hiệu điện thế dòng điện [14].
2.5.5. Phƣơng pháp chuyển bằng chân không
Phương pháp này tương tự phương pháp mao dẫn. Buồng chân không sẽ kéo
dung dịch chuyển xuyên qua gel và màng, DNA từ gel sẽ di chuyển theo sự di chuyển
của dung dịch đệm đến màng. So với phương pháp mao dẫn, phương pháp này nhanh
và hiệu quả hơn [14].
2.6. Probe đánh dấu đƣợc sử dụng trong Southern blot
Probe là những đoạn acid nucleic (DNA, RNA hoặc oligonucletide) đã biết rõ trình
tự và kích thước, dùng để định vị các đoạn acid nucleic cần nghiên cứu có trình tự bổ
sung với trình tự của probe, qua một phản ứng chuyên biệt gọi là lai phân tử. Probe có
độ đặc hiệu cao, do đó nó có thể phát hiện ra đoạn gen cần tìm trong hàng ngàn đoạn
DNA hoặc RNA khác nhau. Có hai hệ thống đánh dấu probe. Hệ thống đánh dấu
(labeling) bằng chất đồng vị phóng xạ như
32
P,
35
S,
125
I,
3

H, được phát hiện bằng hiện
tượng phóng xạ tự ghi hoặc sử dụng các loại máy đếm Geiger- Muller. Hệ thống đánh
dấu không dùng chất đồng vị phóng xạ như Biotin, Enzyme, Chemiluminescence,
Fluorescence, Kháng thể (Antibodies). Hệ thống phát hiện và đánh dấu không dùng
phóng xạ bao gồm các hệ thống có thuật ngữ chuyên môn là “horseradish peroxidase”,
“digoxigenin - antidigoxigenin”, và “biotin – streptavidin”. Cả ba hệ thống này, thể
probe lai có thể sẽ được phát hiện với cơ chất chromogenic. Cơ chất này sẽ tạo ra ánh
sáng đối với enzyme có trong hệ thống [2]. Đánh dấu probe được thực hiện bằng một
số phương pháp sau: phương pháp nick – translation, phương pháp random priming
(thiết lập mồi ngẫu nhiên), phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi),
phương pháp photobiotin.

10

2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea
Transposon là yếu tố thường gặp trong cả prokaryote và eukaryote, đây là
những vùng có khả năng chuyển vị trong genome. Trong những năm gần đây, những
yếu tố này được phát hiện tăng số lượng trong các loài nấm sợi. Transposon của nấm
cũng giống như transposon của của các loài eukaryote khác, chúng được phân thành 2
nhóm chính. Các yếu tố nhóm I chuyển vị qua trung gian RNA, các yếu tố nhóm II
chuyển vị trực tiếp từ DNA sang DNA. Yếu tố nhóm I phân thành 3 loại:
retrotransposon LTR mã hóa enzyme RT (reverse transcription) và có chứa LTR (long
terminal repeat) ở cả hai đầu, retrotransposon LINE cũng mã hóa RT và có đuôi polyA
nhưng không có LTR và yếu tố SINE thể hiện đặc tính cần phải phiên mã bằng
polymerase RNA III và không có gen RT. Sự biểu hiện của các transposon trong vi
sinh vật luôn được quy định hoàn toàn bởi genome kí chủ. Nhưng hoạt tính của chúng
lại rất khác nhau tùy theo điều kiện xử lý: shock nhiệt, chiếu tia UV, nuôi cấy mô, lai
và chủng với vi khuẩn hoặc xử lý với những yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [17].
M. grisea là một loại nấm có phổ kí chủ rất rộng, chúng có thể kí sinh trên hơn 50
loại thực vật thân cỏ và một số loài cây 1 lá mầm khác [11]. Loại nấm này phân hóa và gồm

một số loại tác nhân gây bệnh chuyên biệt cho kí chủ. Tác nhân Oryza gây bệnh cho cây lúa
(Oriza sativa), Setaria gây bệnh trên loài kê đuôi cáo (Setaria italica), Panicum gây bệnh
trên loài kê thường (Panicum miliaceum), Triticum là tác nhân gây bệnh trên lúa mì
(Triticum aesticum), Eleusine là tác nhân gây bệnh trên kê hình ngón tay (Eleusine
coracana) và digitaria tác nhân gây bệnh trên loài cỏ crabgrass (Digitaria sanguinalis) [17].

Hình 2.4. Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY .
Các phân đoạn của nó pMGY18, pMGY23 (dòng kẻ đậm) và probe SB (bằng dòng kẻ trắng)
để đánh giá số lượng bản sao của MAGGY trong genome. Tên viết tắt của các enzym cắt:
BamHI (B), EcoRV (E), HindIII (H), PstI (P), SalI (S).(Yukio Tosa và ctv, 1995).
11

Genome M. grisea có 6 nhiễm sắc thể, có trọng lượng phân tử là 38 megabase
và kích thước mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau. Có nhiều transposon được tìm thấy
trong genome của M. grisea tạo nên những trình tự DNA lập lại được gọi là MGR (M.
grisea repeat), các MGR này giúp phân biệt các cá thể trong một quần thể nấm M.
grisea đa hình. Một số MGR được tìm thấy trong quần thể nấm M. grisea: MGR583,
MGR586, MGSR1, Grasshopper, MAGGY, Fosburi và Pot2 [9, 16]. Nhóm I gồm các
retrotransposon LTR Grasshopper, MAGGY và fosbury, retrotransposon MGR583-
LINE, yếu tố MGSR1-SINE và Mg-SINE, nhóm II gồm MGR586 hoặc Pot3 và Pot2.
MGR583 được cho là những yếu tố cũ, đã xuất hiện rất sớm trong quần thể M. grisea
trong quá trình tiến hóa của nó, LTR-retrotransposon MAGGY và Grasshopper thì bị
giới hạn, và được cho là những yếu tố mới cái mà gần đây mới xuất hiện trong quần
thể nấm Pyricularia bằng sự di chuyển ngang. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng
MAGGY là yếu tố hoạt động mạnh nhất trong các yếu tố được kiểm tra về sự chuyển
vị trong quần thể M. grisea [17].
MAGGY là một retrotransposon kích thước 5,6 kb, được phân tách từ nấm
Magnaporthe grisea và có 2 ORF và các LTR có kích thước 253-bp ( Farman và ctv
1996). ORF1 mã hóa chuỗi polypeptide gồm 457 amino acid, ORF2 có đặc tính của
gen pol mã hóa một polypeptide có chức năng protease. Hầu hết các retrotransposon

được tìm thấy trong các loại nấm sợi ngày nay được phân vào nhóm Ty3-gypsy với
một vài ngoại lệ. MAGGY có nhiều coppy trong bộ gen M. grisea phân lập được từ
cây lúa, cây kê đuôi cáo, và một số loại cỏ khác, nhưng chúng không tìm thấy trong
nấm M. grisea phân lập từ lúa mì [8].
2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền
của quần thể nấm Magnaporthe grisea
Hamer và ctv (1989) là những người đầu tiên tìm ra một họ những trình tự DNA
lập lại trong genome của M. grisea được gọi là MGR586. Ứng dụng phương pháp
DNA-fingerprinting sử dụng probe MGR586 đã mở ra một hướng mới trong nghiên
cứu cấu trúc của quần thể nấm M. grisea. Sau đó, những nghiên cứu này được phát
triển xa hơn trong nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể nấm gây bệnh cháy lá
trong các vùng trồng lúa trên thế giới. Một vài trình tự DNA lập lại trong quần thể nấm
này cũng được tìm thấy sau đó như: Pot2, Fosbury, MGSR1, MAGGY và được sử
12

dụng thay thế cho probe MGR586. Trong đó, MAGGY được xem là probe tốt nhất vì
trong một số trường hợp nó có thể cho thấy sự khác biệt giữa các nòi nấm M. grisea
trong cùng một kí chủ.
Hamer và ctv (1992) đã sử dụng probe MGR586, lai chéo với các dòng là tác
nhân gây bệnh cho lúa và những dòng không gây bệnh trong phòng thí nghiệm. Kết
quả ông đã tìm được 57 đoạn DNA cắt giới hạn được lai với probe MGR586 của dòng
gây bệnh trên lúa và phát hiện ra 8 nhóm liên kết. Những kết quả đó cho phép Hamer
xây dựng bản đồ 3 gen sắc tố (Alb1, Rsy1 và Buf1), vị trí lai (Mat1), tổ chức tạo nhân
con (Rdn1), gen Smo1 và hai đa hình RFLP liên kết với Smo1. Kết quả của Hamer đã
chỉ ra rằng vị trí của các MGR586 được phân bố một cách ngẫu nhiên trong genome
của nấm M. grisea.
Yukio Tosa và ctv (1995) đã sử dụng hai probe pMGY23 và pMGY18 được
tách dòng từ MAGGY, để phân tích sự phân bố của retrootransposon MAGGY trong
các dòng Pyricularia được phân lập từ các loài thực vật một lá mầm ở nhiều nước
khác nhau. Kết quả ông đã tìm thấy được nhiều bản sao của MAGGY trong các nòi

phân lập từ lúa và kê đuôi cáo (Setaria italica). Điều này chứng tỏ các nòi là tác nhân
gây bệnh trên lúa có quan hệ di truyền gần với nòi từ loài Setaria.
Pradeep Kachroo và ctv (1995) sử dụng phương pháp Southern blot với probe
Mg-SINE, phân tích genome của các nòi M. grisea. Qua nghiên cứu Kachroo đã phát
hiện ra khoảng 100 bản sao của Mg-SINE trên một thể đơn bội trong cả các nòi gây
bệnh cho lúa và các nòi không gây bệnh cho lúa.
Verel Shull và John E. Hamer (1996) sử dụng probe pCB586 để phát hiện đoạn
MGR586 trong quần thể nấm M. grisea. Phân tích sự giảm phân của MGR586 Shull
và Hamer đã tìm ra được một đa hình mới là MGR586-P2. P2 được tạo ra do một đoạn
chèn gần, đó là một retrotransposon chứa đoạn LTR. Kết quả các ông đưa ra rằng
những vị trí DNA đánh dấu có thể siêu biến tái sắp xếp chính xác.
Le Dinh Don và ctv (1998) phân tích cấu trúc quần thể nấm M. grisea ở Nhật
Bản bằng phương pháp DNA fingerprinting. Don đã sử dụng Probe SB lai với
MAGGY và MGR586. Kết quả đã cho thấy rằng có hai dòng liên kết trong quần thể
nấm, hai dòng này chỉ ra khả năng gây độc tương tự nhau. MAGGY thể hiện trong các
nhóm cũng tương tự như MGR586, mặc dù hai yếu tố nay khác nhau về tính chất và
13

cấu trúc. Điều này cho thấy rằng MAGGY có thể thay thế cho MGR586 trong những
nghiên cứu khác trong quần thể các nòi M. grisea gây bệnh cho lúa.
Le Dinh Don và ctv (1999) đã tiến hành phân tích cấu trúc di truyền của quần
thể nấm M. grisea gây bệnh đạo ôn trên vùng Đồng bằng Sông Hồng (1998) và Đồng
bằng Sông Cửu Long (1996). Ứng dụng phương pháp Southern blot sử dụng probe
chứa một đoạn phân lập từ MAGGY và đã phát hiện được 5 dòng chứa đoạn gen
MAGGY. Kết quả cho thấy có sự khác biệt giữa các nòi ở hai vùng trồng lúa này. Đầu
tiên, khả năng gây độc rất khác nhau đặc biệt là trên những dòng có gen kháng Pi-k
s
và
Pi-ta. Thứ hai, các nòi ở khu vực phía Bắc thì đa dạng về cấu trúc dòng hơn các nòi ở
khu vực phía Nam.

Motoaki Kusaba và ctv (1999) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể
nấm M. grisea được phân lập từ nhiều loại kí chủ khác nhau bằng sự đa hình các đoạn
MAGGY trong DNA genome. Kusaba nhận ra sự hiện diện với số lượng bản sao nhiều
của MAGGY trong genome, thực hiện đọc trình tự vùng ITS2 để xây dựng sơ đồ mối
quan hệ giữa các dòng. Những kết quả cho thấy rằng MAGGY di chuyển ngang trong
di truyền quần thể nấm M. grisea.
Những kết quả nghiên cứu đó đã xây dựng một cơ sở dữ liệu về bản đồ di truyền
của quần thể nấm M. grisea kí sinh trên nhiều loại cây trồng đặc biệt là trên cây lúa.
Cơ sở dữ liệu đó có thể được sử dụng cho những nghiên cứu sau này.












14


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành
3.1.1. Thời gian
Đề tài được tiến hành từ 06-02-2006 đến ngày 15-08-2006.

3.1.2. Địa điểm
Phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông Học, Đại Học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Phòng công nghệ sinh học, trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại
Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Đối Tƣợng khảo sát
Các dòng nấm Magnaporthe grisea được cung cấp từ Viện Lúa Đồng Bằng
Sông Cửu Long.
3.3. Nội dung thực hiện
- Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea.
- Thiết lập phản ứng cắt DNA genome bằng enzyme cắt giới hạn.
- Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5 .
- Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn.
- Thực hiện phản ứng đánh dấu plasmid.
- Tạo mẫu lai trên DNA genome của nấm M. grisea.
- Thực hiện lai Southern với probe palsmid pMGY-SB được đánh dấu bằng
biotin
3.4. Vật liệu và hóa chất
3.4.1. Dụng cụ và thiết bị
3.4.1.1. Dụng cụ
- Micropipette (0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl), đầu tip các loại
- Eppendorf 1,5 ml, 200 µl, ống ly tâm 15 ml
15

- Màng Hybond-N
- Bình đựng nitơ lỏng
- Kính hiển vi quang học
- Bình tam giác (250, 500, 1000ml), ống nghiệm, đĩa petri, becher
- Phim Konica 30 x 40 cm (100 tấm / hộp)

- Cassette 30 x 40 Konica
3.4.1.2. Máy móc và thiết bị
- Buồng lai: HB – 1000
Hybridizer
- Máy cross-linker: GS
GENE LINKER
TM
UV
CHAMBER (Bio-Rad)
- Máy điện di (Bio - Rad)
- Máy chụp gel (Bio - Rad)
- Máy lắc định ôn
- Máy vortex
- Bồn nước ổn nhiệt
- Tủ sấy dụng cụ
- Nồi hấp (Autoclave - Tomy)
- Máy đo pH
- Cân kỹ thuật
- Máy khuấy từ
- Máy lọc nước khử ion
- Tủ cấy vô trùng (micro
flow)
- Tủ lạnh -4
o
C, - 20
o
C, - 70
o
C
3.4.2. Hóa chất

Các hoá chất được sử dụng trong đề tài này được sản xuất bởi Công ty Sigma,
Meark, Amersham Biosence và Bio Rad.
3.4.2.1. Môi trƣờng
- Môi trường lỏng CZA : yeast extract, K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
, MgSO
4
, Glucose.
- Môi trường lỏng LB chứa Ampiciline: yeast extract, bactose trypton, NaCl.
3.4.2.2. Hóa chất dùng trong ly trích DNA
- Nitơ lỏng
- Phenol /Chloroform/Isoamyl (25:24:1)
- Isopropanol
- Dung dịch TE 1X vô trùng: 10mM tris HCl, 1mM EDTA pH 8.0
- Ethanol 70%, 100%
- RNAse
16

- Dung dịch ly trích (lyssis buffer): 50mM tris HCl, 50mM EDTA, 3% SDS,
1% - mercaptoethanol.
3.4.2.3. Hóa chất dùng trong Southern blot
Hóa chất chuyển DNA lên màng
- Đệm biến tính: NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M
- Đệm trung tính: Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0

- Đệm chuyển (transfer buffer): SSC 20X, SSC 6X, SSC 2X.
Hóa chất để tạo probe
- Reaction buffer
- Labelling reagent
- Cross – linker working
Hóa chất dùng trong phản ứng lai
- Dung dịch đệm lai: Alkphos Direct hybridization buffer (Amersham)
- Dung dịch rửa 1 (Primary wash buffer): Urea 2 M; SDS 0,1%; natri
phosphate.
- Dung dịch rửa 2 (Secondary wash buffer ): Tris-base 1M, NaCl 2M, pH
10.0.
Hóa chất để phát hiện phản ứng lai
- Chất phát hiện: detection reagent with CDP – star (Amersham)
- Bộ thuốc rửa phim Konica (developer + fixer)
Enzyme cắt giới hạn
Bảng 3.1. Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai
Tên enzyme
Trình tự nhận biết
Mã hàng
Nhà sản xuất
BamHI
EcoRV
HindIII
G /GATCC
GAT/ATG
A/AGCTT
Cat. No. 220 612
Cat. No. 667 145
Cat. No. 656 313
Roche

Roche
Roche




17


3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.5.1. Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm (isolate)
3.5.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng lỏng nhân sinh khối sợi nấm
Các mẫu phân lập được nuôi cấy trên môi trường lỏng CZA (Czapek- Dox)
(Tuite, 1969): 20g Glucose, 3g yeast extract, 0,5g KH
2
PO
4
, 0,5g K
2
HPO
4
, 0,5g
MgSO
4
-7H
2
O (hoặc 0.005g/500 ml FeSO
4
-H
2

O), một ít NaCL trên tổng thể tích
1000ml, pH 6.0-6.5.
Chuẩn bị một cốc dung tích 1000ml, cho vào cốc 800ml nước cất vô trùng, cân
đủ lượng tất cả các loại hóa chất này và cho vào cốc khuấy tan bằng máy khuấy từ.
Sau đó, môi trường được san đều vào 10 bình tam giác, mỗi bình 100ml, hấp khử
trùng trong nồi hấp 20 phút ở 121
0
C.
Sợi nấm được lấy ra trên một đĩa petri vô trùng, dùng dao vô trùng băm nhỏ ra
và cho vào bình chứa môi trường lỏng. Sinh khối nấm được nhân trong điều kiện lắc
với tốc độ 5000 vòng, trong khoảng 72 giờ. Sau đó, tôi thu được khối sợi nấm là
những hạt tròn nhỏ li ti, lọc lấy khối sợi nấm này qua vải lọc (đã được khử trùng) và
làm khô bằng giấy thấm, đặt khối sợi nấm vào giấy bạc và giữ ở -80
o
C.
3.5.1.2. Ly trích DNA theo phƣơng pháp lysis buffer
- Đặt 10 g sợi nấm đã được làm khô kiệt vào cối và nghiền nát trong dung
dịch nitơ lòng. Sau đó, sinh khối nấm đã nghiền nát được chuyển vào ống
ly tâm 15 ml. Chú ý, trong giai đoạn này tránh để bột nấm bị ướt.
- Thêm 400 l Lysis buffer, trộn đều hỗn hợp và đem ủ khoảng 1 giờ ở 65
o
C.
- Lấy ống nghiệm ra khỏi dung dịch nước ấm. Thêm vào khoảng 300 l
Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ, dung dịch lúc này
có màu trắng đục như sữa (không nên lắc mạnh tránh DNA bị đứt gãy).
- Ly tâm 20 phút 10000 vòng ở nhiệt độ phòng.
- Dùng pipet hút dịch nổi và chuyển vào một ống nghiệm mới.
- Thêm 0,5 vol Isopropanol, vào dịch nổi mới thu được, trộn nhẹ nhàng, ủ ở -
20
0

C khoảng 1 giờ, để làm kết tủa DNA, lúc này DNA kết tủa tạo thành
những sợi màu trắng đục.
18

- Dùng ống thủy tinh (hiệu Ikarea) được tạo thành một đầu cong dưới đèn cồn
và móc lấy DNA chuyển qua eppendorf sạch, dùng ethanol 70% rửa DNA
nhiều lần mỗi lầm khoảng 300 l.
- Làm khô DNA, hòa tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở tủ mát 4
0
C hoặc
tủ -20
0
C cho đến khi sử dụng.
3.5.1.3. Phƣơng pháp tinh sạch DNA
Các bước tinh sạch DNA bằng RNAse như sau:
- Cho hỗn hợp DNA pha loãng với nước cất vô trùng (hoặc TE 1X) vào
eppendorf (theo tỷ lệ 1:3)
- Thêm 2 l RNAse vào hỗn hợp trên và trộn đều
- Ủ ở 37
0
C trong khoảng 2 giờ
- Thêm vào 20 l phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1)
- Ly tâm 13500 vòng trong 10 phút, thu phần dịch nổi cho vào eppendorf mới
- Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -80
0
C khoảng 30 phút
- Ly tâm 13500 vòng 1 phút bỏ phần dịch nổi bên trên
- Làm khô DNA và hòa tan DNA với TE 1X
- Điện di trên gel agarose 0,8%, với dung dịch đệm TAE 0,5X, vận hành máy
điện di trong 30 phút ở 100V và 250mA. Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn

hợp ethidium bromide 1 l/ml và TAE 0,5X trong 15 phút.
- Kết quả được đọc bằng máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm
quantity one 2000).
3.5.2. Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn
3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp
- Cấy 30 l dịch vi khuẩn E.coli DH5 vào 3 ống nghiệm chứa 3 ml môi
trường LB lỏng.
- Nuôi cấy lắc ở 37
0
C trong 4 giờ đến khi đạt được mật độ khoảng 10
8
tế
bào/ml.
- Chuyển ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy vào thùng nước đá giữ lạnh trong
10 phút.
19

- Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 4000 vòng/phút
trong 10 phút ở 4
0
C, đổ bỏ phần dịch bên trên thu phần sinh khối ở bên
dưới, lập lại bước này 3 lần.
- Thêm 1 ml CaCl
2
100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu
được, votex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa.
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
0
C, đổ bỏ phần dịch bên trên, lật
ngược eppendorf để làm khô kết tủa.

- Thêm 150 l CaCl
2
100mM lạnh vào eppendorf hòa tan phần kết tủa trên,
thêm 20 l glycerol 98% trộn đều và trữ ở -70
0
C.
3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi
khuẩn E.coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình
của Sambrook và cộng sự, 1989)
- Hút 30 l dịch tế bào vi khuẩn E.coli DH5 đã được chuẩn bị cho vào
eppendorf 1,5 ml, thêm một thể tích phù hợp tương ứng với 100ng của DNA
plasmid, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá 20 phút
- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 42
0
C, giữ trong 90 giây.
- Chuyển nhanh eppendorf vào nước đá, giữ lạnh trong 2 phút.
- Thêm 800 l môi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 37
0
C trong 1 giờ.
- Hút 200 l huyền phù tế bào đã biến nạp ở trên cho vào 3 ml môi trường
LB chứa kháng sinh Ampiciline với nồng độ 70 g/ml, nuôi cấy lắc ở
37
0
C qua đêm.
Tôi tiến hành cùng một quy trình trên với tế bào khả nạp nhưng không cho
DNA plasmid vào để làm đối chứng.
3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp
Kết quả biến nạp có thể được kiểm tra trực tiếp bằng cách nuôi trong môi
trường LB chứa kháng sinh với nồng độ 70 g/ml. Những tế bào vi khuẩn nào có chứa
plasmid thì có thể sống và tăng sinh trong môi trường kháng sinh, cón những tế bào

nào không chứa plasmid thì không kháng lại được kháng sinh và chết. Từ đó, tôi có
thể chọn lọc được dòng vi khuẩn chứa plasmid, và ly trích được plasmid mà tôi cần sử
dụng với số lượng lớn.
20

Phƣơng pháp chiết tách plasmid sử dụng SDS-kiềm (theo quy
trình của Sambrook và cộng sự, 1989)
Nguyên tắc của phương pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác
nhân phá màng, Sau khi màng tế bào bị phá vỡ, dưới tác dụng của SDS protein của tế
bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh được sự phân hủy của enzyme DNAse.
Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình
tách triết, làm cho DNA genome và DNA plasmid bị biến tính. Sau đó, trung hòa
nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA plasmid sẽ được phục hồi nhanh chóng,
DNA của bộ gen có kích thước lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA
plasmid. Vì vậy, DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein và
DNA genome của tế bào sẽ bị tủa suống. Như vậy, ta có thể tách DNA plasmid ra khỏi
tế bào của bộ gen mà it bị lẫn DNA genome.
Chọn những ống vi khuẩn tăng sinh được trong môi trường kháng sinh ở trên để
ly trích DNA plasmid theo quy trình sau:
- Hút địch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1,5 ml, ly tâm
13000vòng/phút trong 1 phút ở 20
0
C để thu sinh khối.
- Hút bỏ dịch bên, tiếp tục hút dịch vi khuẩn từ những ống nghiệm tương ứng
cho vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 20
0
C, lặp lại cho đến khi
hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
- Cho 150 l dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, votex đến khi
sinh khối vi khuẩn tan ra hết.

- Thêm 200 l dung dịch II, đảo nhẹ khoảng 8 lần (dịch trong eppendorf trở
nên nhớt), sau đó thêm tiếp 150 l dung dịch III, đảo nhẹ eppendorf (chú ý
trong bước này không nên votex).
- Ly tâm 1200 vòng/phút trong 10 phút ở 20
0
C, thu hết dịch nổi cho vào
eppendorf mới tương ứng.
- Thêm 1 l RNAse vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi mới thu được, ủ 37
0
C
trong 1 giờ để khử hết RNA.
21

- Cho vào mỗi eppendorf 300 l phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1),
trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 20
0
C, thu dịch nổi cho vào
các eppendorf mới tương ứng.
- Cho vào mỗi eppendorf 300 l chloroform/isoamylalcohol (24:1), trộn đều ly
tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 20
0
C, thu dịch nổi cho vào các
eppendorf mới tương ứng.
- Thêm vào mỗi eppendorf trên 300 l isopropanol, ủ -20
0
C 30 phút, ly tâm
13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4
0
C. hút bỏ dịch nổi thu kết tủa.
- Rửa tủa trên bằng ethanol 70% 3 lần, úp ngược eppendorf trên giấy thấm để

làm khô DNA.
- Thêm 20 l TE 1X vào eppendorf để hòa tan kết tủa.
- Hút 4 l chạy điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra kết quả ly trích
3.5.2.4. Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit
DNA plasmid để sử dụng làm probe phải có độ tinh sạch cao nên tôi tiến hành
ly trích DNA plasmid bằng Aurum
TM
Plasmid mini kit của Bio-Rad. Quy trình ly trích
như sau:
- Chuyển 1ml dịch vi khuẩn vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000 vòng/phút
trong 1 phút, bỏ dịch nổi thu sinh khối, lập lại bước này 3 lần.
- Thêm 250 l dung dịch đệm hòa tan (resuspension solution), votex hoặc
dùng pipet làm tan kết tủa trong dung dịch.
- Thêm 250 l dung dịch ly trích (lysis solution), đảo ngược eppendorf 6-8
lần.
- Thêm 350 l dung dịch trung hòa (neutralization solution) trong vòng 5 phút
sau khi cho dung dịch ly trích, đảo ngược từ 6-8 lần (không votex).
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong vòng 5 phút, thu dịch nổi.
- Trong khi ly tâm, tiến hành chèn cột vào ống do bộ kit cung cấp
(capless wash).
- Hút dịch nổi cho vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để DNA
plasmid gắn vào màng, bỏ phần dịch bên dưới ống, lập lại bước này một
lần nữa.
22

- Thêm 750 l dung dịch rửa vào cột, ly tâm 1 phút, sau đó ly tâm tiếp
một phút.
- Loại bỏ dịch rửa chuyển cột chứa plasmid sang eppendorf 1,5 ml, thêm 50 l
dung dịch elution vào màng, để 1 phút, ly tâm 1phút để tách plasmid ra khỏi
màng, thu phần dung dịch chứa DNA plasmis.

3.5.3. Thực hiện đánh dấu plasmid pMGY-SB bằng biotin
Chúng tôi sử dụng plasmid pMGY-SB đã được ly trích ở trên, có chứa đoạn
MAGGY có kích thước 0,56 kp để tạo probe. Trước khi thực hiện phản ứng đánh dấu
cần phải pha loãng dung dịch cross - linker thành dung dịch có nồng độ sử dụng, dung
dịch này có thể bảo quản lạnh 2–8
0
C trong một tuần. Bên cạnh đó, DNA plasmid cũng
cần phải được pha loãng với nước tới nồng độ 10 ng / µl dùng để đánh dấu (nồng độ
muối trong mẫu DNA nên được giữ ở mức thấp nhất, không quá 50 mM). Thực hiện
phản ứng đánh dấu theo kit của Amersham gồm các bước như sau:
- Cho 10 µl DNA đã pha loãng vào eppendorf 200 µl, biến tính hoàn toàn bởi
nhiệt độ bằng cách đun 5 – 7 phút trong nước đang sôi mạnh.
- Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút, đem ly tâm nhanh ở tốc độ 4000
vòng/30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống.
- Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer vào DNA đã được làm
lạnh, đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá.
- Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent, trộn nhẹ, đều.
- Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross - linker. Trộn đều, ly tâm nhanh 4000
vòng / 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy.
- Ủ 30 phút ở 37
0
C cho phản ứng xảy ra.
- Probe có thể được dùng ngay, trong trường hợp muốn bảo quản lâu hơn,
probe đã đánh dấu được giữ trong 50 %V glycerol ở - 15
0
C đến – 30
0
C
trong 6 tháng (không cần xử lý gì thêm dung dịch probe này sau khi bảo
quản).

3.5.4. Tạo mẫu lai
3.5.4.1. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn
23

Sử dụng genomic DNA của các nòi đã được ly trích ở trên, tôi đã thực hiện
phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn BamHI, EcoRV và HindIII để ở thể tích 25 µl
và 50 µl như sau:

Bảng 3.2. Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl
BamHI
HindIII
EcoRV
Thể tích
DNA
10X đệm BamHI
Enzyme BamHI
Nước
DNA
10X đệm HindIII
Enzyme EcoRV
Nước
DNA
10X đệm EcoRV
Enzyme HindIII
Nước
8 µl (1µg)
2,5 µl
05 µl
14 µl
Tổng cộng

25 µl



Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl
BamHI
Hind III
Eco RV
Thể tích
DNA
10X đệm BamHI
Enzyme BamHI
Nước
DNA
10X đệm HindIII
Enzyme EcoRV
Nước
DNA
10X đệm EcoRV
Enzyme HindIII
Nước
16 µl (2-3 g)
5 l
1µl
28 µl
Tổng cộng
50 l

Tôi tiến hành trộn đều thành phần của các phản ứng cắt theo tổng thể tích đã
tính toán. Sau đó, hỗn hợp đó được phân chia đều thành các phản ứng riêng lẻ ra các

eppendorf để thực hiện phản ứng cắt. DNA được thêm vào eppendorf chứa hỗn hợp
trên, đậy nắp kỹ và đem đi ủ ở 37
0
C trong khoảng 2 giờ (có thể qua đêm nếu cần thiết).
Sản phẩm của phản ứng cắt được kiểm tra trên gel agarose 0,8%, các mẫu được bố trí
theo kiểu xen kẽ, liên tiếp nhau mẫu DNA chưa cắt, đến mẫu sản phẩm cắt.
3.5.4.2. Điện di sản phẩm cắt DNA genome của nấm M. grisea trên
gel agarose
24

Tôi thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, với kích thước
gel 20 cm x 15 cm x 0,5 cm, gel được gắn lược 20 giếng, thực hiện bố trí như sau:
Giếng 1: Hút 10 µl DNA plasmid dùng để tạo probe như một đối chứng
dương + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 2-9: Hút 25µl mẫu (2µg DNA đã được cắt bằng enzym cắt giới hạn) + 2 µl
loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 10: Hút 10 µl DNA plasmid dùng để tạo probe như một đối chứng dương
+ 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 11-20: Hút 25µl mẫu (2µg DNA đã được cắt bằng enzym cắt giới hạn) + 2
µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Tiến hành điện di ở hiệu điện thế là 50 V, trong 3 giờ. Sau đó, gel được cắt bỏ
giếng, nhuộm ngắn trong ethidium bromide trong 1 - 2 phút, rửa sạch và chụp gel lấy
lại hình ảnh để biện luận kết quả. Miếng gel đó sẽ được làm biến tính trước khi chuyển
lên màng (chú ý miếng gel trước khi chuyển lên màng không nên để lâu trong không
khí vì như thế sẽ làm cho bề mặt miếng gel bị khô và ảnh hưởng không tốt đến quá
trình chuyển lên màng. Thời gian giữ gel là 15 - 30 phút khi nó được ngâm trong dung
dịch đệm)
3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên
 Biến tính DNA trên gel trƣớc khi chuyển lên màng nitrocellulose
Sau khi hoàn thành giai đoạn điện di, gel được giữ trong dung dịch đệm TAE

0,5X. Chúng tôi thực hiện biến tính DNA như sau:
- Đổ bỏ đệm TAE 0,5X, rửa lại miếng gel bằng nước cất và đổ bỏ phần
nước rửa.
- Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5 M; NaCl
0,15 M), phải xem kỹ đảm bảo rằng miếng gel đã được phủ hoàn toàn
bởi dung dịch, đem lắc nhẹ 30 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần
dung dịch đó đi.
- Lặp lại bước trên, rửa lại gel bằng nước cất vô trùng, đổ bỏ phần
nước rửa.
- Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm trung tính (Tris – HCl 0,5 M;
NaCl 0,15 M; pH 7,0), miếng gel cũng phải được ngấm hoàn toàn
25

trong dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần
dung dịch đó đi.
- Lặp lại bước trên, trong thời gian này chuẩn bị màng, dung dịch chuyển,
giấy thấm, hệ thống mao dẫn và các dụng cụ cần thiết khác.
 Chuyển DNA lên màng bằng phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên (thiết bị
chuyển lên màng nitrocellulose đã đƣợc cải tiến)
Khi đã hoàn thành giai đoạn biến tính DNA trên gel agarose bằng dung dịch
biến tính, tiến hành chuyển lên màng theo các bước sau:
- Dùng hộp nhựa hình chủ nhật (30 cm x 20 cm) có chứa 500 ml đệm SSC
6X, phía trên có đặt một tấm mica (24 cm x 20 cm) làm bệ của hệ thống
mao dẫn.
- Cắt một tấm giấy lọc có kích thước phù hợp (30cm x 15 cm) được làm ướt
bằng dung dịch SSC 2X, phủ đều trên tấm mica (tránh có bọt khí, nếu có bọt
khí dùng que thủy tinh gạt theo một chiều) và hai đầu giấy ngấm vào trong
dung dịch đệm để làm cầu mao dẫn.
- Úp ngược miếng gel và đặt lên trên giấy lọc, giữa miếng gel và giấy lọc
tránh có bọt khí.

- Đặt màng Hybond N có kích thước (20 cm x 12 cm) được làm ướt bằng
SSC 2X lên trên miếng gel tránh để bọt khí.
- Đặt hai tấm giấy lọc có kích thước 20 cm x 12 cm được làm ướt bằng dung
dịch SSC 2X lên trên màng.
- Đặt một chồng giấy thấm có kích thước 20 cm x 12 cm với độ cao vừa phải
lên trên giấy lọc, màng và gel.
- Trên cùng được đặt vài miếng mica để giữ hệ thống và tạo lực mao dẫn.
- Khoảng trống xung quanh hộp nhựa được phủ bằng saran wrap, giảm sự tác
động của môi trường xung quanh. Hệ thống được giữ qua đêm (16 giờ).
3.5.4.4. Làm khô màng nitrocellulose
Sau 16 giờ , chúng ta tiến hành làm khô màng theo cách sau:
- Loại bỏ các thành phần ở trên cho đến khi tới màng thì dừng lại.
- Dùng kẹp giữ một góc màng và làm dấu bề mặt chứa DNA của màng