Luận văn : KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO part 2 ppt

21
và có đƣợc chỗ cƣ ngụ trong lá (mơi trƣờng chỉ thích hợp với một vài lồi vi
khuẩn) [44], [50].
Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, cịn nhiều bằng chứng cho thấy
mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dƣỡng từ cây chủ nhƣng không phải là mối quan
hệ một chiều. Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khoáng chất từ cây,
đồng thời tham gia vào các q trình sinh hố và chuyển hố quan trọng ở cây chủ.
Methylobacterium sp. nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng nhƣ khả năng tổng hợp
amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cƣờng tạo
hƣơng vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp
chất 2,4,6-trinitrotoluene, nitramine…; khả năng phân hủy và chuyển hóa một số
cơ chất khơng cần thiết ở thực vật thành sản phẩm có giá trị [35].
Chủng PPFM đầu tiên đƣợc Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích
sinh trƣởng ở cây địa tiền (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro [9].
Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc nhiễm vi khuẩn
Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào môi trƣờng nuôi cấy in vitro
tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mô thực vật. Thuốc lá, cây lanh và
khoai tây khi nhiễm khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn (số chồi tăng, rễ phát triển
mạnh) [39], [40].
Năm 1994, Holland và cộng sự công bố về khả năng tƣơng tác của vi khuẩn
Methylobacterium sp. và cây đậu nành trong việc chuyển hoá nickel [35].
Cây lúa (Oryza sativa) cũng là một loại cây có mối quan hệ mật thiết với
các vi khuẩn PPFM. Nhiều nhà nghiên cứu cũng đã chứng tỏ vi khuẩn
Methylobacterium sp. có tác động tích cực lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây
lúa cả trong điều kiện in vitro lẫn in vivo.
Maliti (2000) nghiên cứu, đánh giá ảnh hƣởng của một số chủng
Methylobacterium sp. đối với sự tăng trƣởng và phát triển của cây lúa ở 3 mức độ:
nuôi cấy mô, cây con trong điều kiện in vitro và cây trƣởng thành trong môi
trƣờng nhà kính. Kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. có khả năng

22
làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao cây mạ trong
điều kiện in vitro [46].
Năm 2004, Madhaiyan và cộng sự cũng đã tiến hành các thí nghiệm gây
nhiễm PPFM lên hạt lúa hay phun lên lá và kết quả cho thấy: vi khuẩn
Methylobacterium sp. có hoạt tính kích thích tăng trƣởng, gia tăng khả năng đẻ
nhánh của lúa góp phần gia tăng năng suất lúa từ 22,1 đến 24,1%. Ngoài ra, các vi
khuẩn Methylobacterium sp. cịn có vai trị ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh
trên cây lúa, góp phần làm giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8-23,7%. Cơng trình của
Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tƣơng quan giữa khả năng
kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia
tăng polyphenol oxidase trong cây [47].
Qua các kết quả khảo sát về ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobactreium sp.
lên sự hình thành mơ sẹo ở cây thuốc lá và cây cúc cho thấy: vi khuẩn có ảnh
hƣởng khác nhau lên q trình hình thành mô sẹo ở các loại mô hay các loại cây
nuôi cấy. Đối với Chrysanthenum sp. vi khuẩn hạn chế sự hình thành mơ sẹo
nhƣng kích thích sự hình thành phơi ở các mơ sẹo này, trong khi đó ở Nicotiana
tabacum vi khuẩn lại ức chế quá trình hình thành mơ sẹo ở mơ phiến lá và mơ
lóng thân. Nhƣ vậy, vi khuẩn Methylobacterium sp. có khả năng tác động lên q
trình biệt hóa cơ quan ở thực vật. Ngồi vai trị tác động của vi khuẩn thì bản chất
của mơ và lồi thực vật cũng quyết định đến khả năng và chiều hƣớng phát sinh cơ
quan của nuôi cấy invitro. Bên cạnh đó các kết quả thí nghiệm cịn cho thấy rằng
vi khuẩn Methylobacterium sp. cịn có khả năng tăng cƣờng quá trình hình thành
rễ ở P. fortunei và Chrysanthemum sp., so với đối chứng ở nghiệm thức có bổ
sung vi khuẩn mẫu cấy thành lập rễ sớm hơn, nhiều hơn [9].
Ngồi PPFM, cịn có những nghiên cứu sử dụng các lồi vi khuẩn có lợi
khác nhƣ khảo sát sự tăng trƣởng và phát triển của cây hoa Cúc, cây hoa Bi Bi và
cây Địa Lan có sự hiện diện của Bacillus spp. trong nuôi cấy in vitro [5] cho kết
quả: tuỳ theo từng loại cây mà Bacillus spp. có tác dụng khác nhau nhƣ tăng chiều
cao, số lƣợng rễ, trọng lƣợng tƣơi. Vi khuẩn Methanotropic có ảnh hƣởng đến sự

23
hình thành callus của hạt lúa mì, gia tăng sự tạo rễ, đồng thời gia tăng sự tái sinh
cây [40]. Với sự hiện diện của vi khuẩn Methylovorus mays trên môi trƣờng nuôi
cấy làm tăng khả năng tái sinh chồi của cây thuốc lá chuyển gen ipt [39]. Từ
những kết quả này chứng tỏ giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ tƣơng hỗ
có lợi tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và tăng trƣởng của thực vật trong
điều kiện in vitro và in vivo.
2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin
Khơng chỉ có thực vật mà vi sinh vật cũng có thể tổng hợp auxin và
cytokinin, đối với các vi khuẩn có lợi và vi khuẩn tƣơng tác với thực vật thì đây có
thể là nguyên nhân kích thích cây phát triển.
Omer và cộng sự (2004) đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi trƣờng
chứa dịch nổi của PPFM bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với phân
tích phổ NMR (Nuclear Mangnetic Radiation: cộng hƣởng từ hạt nhân) đã chứng
tỏ vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp hormone thực vật là IAA [50].
Holland và cộng sự (1994) kiểm tra mối quan hệ giữa PPFM, cytokinin và sự
phát triển của thực vật đã cho thấy PPFM có ảnh hƣởng đến lƣợng cytokinin có
trong mơ tế bào thực vật [35].


24

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian : từ tháng 3/2006 đến tháng 7/2006
Địa điểm : phịng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại
học Khoa học Tự nhiên.

3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên giống lúa VĐ20 đƣợc cung cấp từ Công ty
cổ phần giống cây trồng Miền Nam.
* Đặc tính nơng học
Giống lúa VĐ 20: là giống lúa cao sản ngắn ngày, thời gian sinh trƣởng 95100 ngày, cây cao 85- 90 cm, năng suất 6- 8 tấn/ ha. Dạng hình khá, bơng to, ít
lép, chín sớm, nhiễm bệnh vàng lá, chịu phèn trung bình. Hạt gạo thon dài, không
bạc bụng, cơm thơm dẻo (Công ty cổ phần giống cây trồng Miền Nam).

(a)

(b)

Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chƣa bóc vỏ trấu, (b) hạt bóc vỏ trấu


25
Chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. 1019 do phịng thí nghiệm sinh học
phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên phân lập cung cấp.
* Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của chủng 1019 [9]
Đặc điểm hình thái, sinh lý
Chủng 1019 là những vi khuẩn có màu hồng, hình que ngắn, có khả năng di
động, Gram âm, nhiệt độ tăng trƣởng thích hợp từ 25-35oC
Đặc điểm
Màu sắc khuẩn lạc trên MMS
Đƣờng kính khuẩn lạc
Hình dạng khuẩn lạc

Chủng 1019
Hồng nhạt

2-3 mm
Trịn, lồi, nhầy, có viền trắng
bên ngồi

Kích thƣớc tế bào

2-4 x 4-6 m

Khả năng di động

Có

Gram

-

pH thích hợp

5,8 ± 1

Nhiệt độ

25-35oC

Hình dạng tế bào

Dấu phẩy, phình to ở hai đầu

Trong giới hạn nồng độ các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật thƣờng sử
dụng trong môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật, thì nồng độ các chất điều hồ

tăng trƣởng thực vật không ảnh hƣởng tới sự phát triển của chủng 1019, do vậy
việc bổ sung hormone vào môi trƣờng nuôi cấy thực vật sẽ không ảnh hƣởng đến
sự tăng trƣởng của vi khuẩn.
Chủng 1019 tăng trƣởng tối đa sau 30 giờ ni cấy do đó thời gian thích
hợp để thu nhận sinh khối tế bào là từ 12 đến 32 giờ sau nuôi cấy.


26

log (N/ml)

11
10,5
10
9,5
9
8,5
8
7,5

h
0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

40

Đồ thị 3: Đƣờng cong tăng trƣởng của chủng 1019
Đặc điểm sinh hóa
Chủng có hoạt tính catalase dƣơng tính và hoạt tính oxidase yếu.

Hợp chất

Chủng 1019

Methylamine

-

Trimethylamine

+

Acetate

+

Citrate

+

L-Glutamate

+

D-Glucose

+

D-Xylose,
L-arabinose

+

Fructose

+

Betaine

+

Tartrate

+

Serbacate

+

44


27
Ethanol

+

Nutrient agar

+

Lactose

+

Sucrose

+

Chủng 1019 có khả năng tổng hợp cytokinin và một lƣợng thấp auxin trên
môi trƣờng nuôi cấy mô thƣc vật.
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu
Thiết bị : tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autoclave), máy đo pH, cân phân tích,

phịng ni cây…
Dụng cụ : pince, kéo, dao cấy, chai nƣớc biển, bình tam giác, đĩa petri, đèn
cồn…
3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy
Mẫu cấy : các hạt lúa giống VĐ20
Điều kiện nuôi cấy : môi trƣờng trƣớc khi cấy đƣợc hấp khử trùng ở 121oC,
áp suất 1atm trong thời gian 20 phút.
Phịng ni cấy:
-

Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux

-

Nhiệt độ : 27 ± 2oC

-

Ẩm độ 70%- 80%

-

Thời gian chiếu sáng : 16h/ngày

3.2.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn
Chủng 1019 đƣợc giữ trong glycerol 10%, sau đó phân lập trên mơi trƣờng
MMS + 1% methanol.


28

3.2.5 Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)
(Phụ lục 1).
Môi trƣờng phân lập và làm thuần chủng 1019 là môi trƣờng MMS
(methanol mineral salts) (Phụ lục 2): Môi trƣờng MMS đƣợc thanh trùng bằng
cách hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút, sau đó để nguội và bổ sung methanol
vào mơi trƣờng với thể tích từ 0,1 đến 0,2%, mơi trƣờng rắn có bổ sung agar 20g/l
trƣớc khi hấp. Hầu hết các chủng PPFM đều không cần vitamine hay các nhân tố
tăng trƣởng khác trong q trình tăng sinh.
Mơi trƣờng giữ giống chủng 1019 là môi trƣờng Glycerol-Pepton Agar (Phụ
lục 3).
* Các môi trường đều được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút.
Các thành phần khác:
-

Đƣờng: 20g/l

-

Agar: 7g/l
pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,7 – 5,8
Các chất kích thích sinh trƣởng:

-

BAP (6- benzylamino purine)

-

NAA (α- naphthaleneacetic acid)

3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mô sẹo)
Các hạt lúa giống VĐ 20 sau khi khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng MS + 2
mg/l 2,4- D để tạo mô sẹo [16].


29

Khử trùng mẫu:
Hạt lúa
bóc vỏ trấu
Rửa xà bơng trong 5-10 phút
Rửa sạch bằng nƣớc máy
mang vô tủ cấy
Tráng bằng nƣớc cất vô trùng
Lắc cồn 70o trong 1 phút
Lắc Javel (1 Javel:3 H2O) xấp mặt hạt
đổ Javel
Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần
Gấp vào cấy
Các mẫu cấy đƣợc đặt trong tối, nhiệt độ 27 ± 2oC, ẩm độ 72%.
Theo dõi sự hình thành và phát triển của mơ sẹo sau 2, 3 tuần, sau đó sử
dụng mơ sẹo làm vật liệu thí nghiệm.


30
Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên mơi trƣờng tạo sẹo
3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn

Nhân sinh khối vi khuẩn: vi khuẩn đƣợc cấy vào môi trƣờng MMS (sử dụng
phƣơng pháp đo OD để đạt mật độ 1010 tế bào/ml), lắc ở 37oC sau 87 giờ, sử dụng
để bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm.
3.3.3 Nội dung thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, tổng số mẫu ở
mỗi nghiệm thức là 30 mẫu.
* Xử lý số liệu:
Phân tích thống kê: số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phần mềm MSTATC,
sau đó dựa vào giá trị Prob trong bảng ANOVA để quyết định nên trắc nghiệm
phân hạng hay khơng. Nếu có, dùng trắc nghiệm LSD hoặc trắc nghiệm Ducan, ở
mức độ tin cậy 0,01 để đánh giá kết quả thí nghiệm.
3.3.3.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo
của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: xác định lại nồng độ 2,4-D tốt nhất cho khả năng nhân
sẹo ở giống lúa VĐ20.
Theo Đoàn Thị Phƣơng Thùy [6] có sự khác nhau giữa nồng độ auxin thích
hợp cho sự hình thành mơ sẹo và nồng độ auxin thích hợp cho sự tăng trƣởng mơ
sẹo của các giống lúa khác nhau, ở thí nghiệm này thay đổi nồng độ 2,4-D để xác
định lại nồng độ auxin thích hợp cho khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20.
Môi trƣờng nền (MTN): khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng + 1mg/l NAA +
0,5 mg/l BAP, bổ sung nồng độ 2,4-D [6].
Mẫu cấy: mơ sẹo có diện tích bằng nhau.
NT1: MTN + 0 mg/l 2,4-D
NT2: MTN + 1 mg/l 2,4-D


31
NT3: MTN + 2 mg/l 2,4-D
NT4: MTN + 3 mg/l 2,4-D
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mô sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở

các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mô sẹo: kích thƣớc, hình dạng,
màu sắc.
3.3.3.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng
tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ BAP/NAA tốt nhất lên khả năng tái
sinh chồi từ mô sẹo.
Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng + bổ sung nồng độ
BAP/NAA.
Mẫu cấy: mô sẹo
NT1: MTN + 1 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA
NT2: MTN + 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA
NT3: MTN + 1 mg/l BAP + 1mg/l NAA
NT4: MTN + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA
NT5: MTN + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA
NT6: MTN + 2 mg/l BAP + 1mg/l NAA
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tạo chồi từ mô sẹo, 7 ngày theo dõi 1
lần. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = (số mẫu tái sinh / số mẫu cấy)*100
số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu
3.3.3.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ
từ mô sẹo của giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ NAA tốt nhất lên khả năng tái sinh rễ
từ mô sẹo.


32
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA.
Mẫu cấy: mô sẹo
NT1: MTN + 0,5 mg/l NAA

NT2: MTN + 1 mg/l NAA
NT3: MTN + 1,5 mg/l NAA
NT4: MTN + 2 mg/l NAA
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo ở các nồng độ
nhiễm khuẩn khác nhau. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ ra rễ (%) = (số mẫu ra rễ / tổng số mẫu)*100
số rễ trên mẫu = tổng số rễ / mẫu
3.3.3.4 Thí nghiệm 4: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo
của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo
mô sẹo của giống lúa VĐ20.
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + 2mg/l 2,4-D.
Mẫu cấy: hạt lúa đã khử
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng
thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn.
NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS
NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn
NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mô sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở
các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng,
màu sắc.


33
3.3.3.5 Thí nghiệm 5: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của
giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân
sẹo.

Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + 0,5 mg/l BAP + 1
mg/l NAA, bổ sung nồng độ 2,4-D thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 1)
Mẫu cấy: mơ sẹo có diện tích bằng nhau.
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng
thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn.
NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS
NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn
NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mô sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở
các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng,
màu sắc.
3.3.3.6 Thí nghiệm 6: “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi
từ mô sẹo của giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái
sinh chồi từ mơ sẹo.
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ BAP/
NAA thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 2)
Mẫu cấy: mơ sẹo
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng
thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn.
NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS
NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn


34
NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn
NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ở các nồng độ

nhiễm khuẩn khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ nảy chồi(%) = (số cây nảy chồi / tổng số cây)*100
số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu
3.3.3.7 Thí nghiệm 7 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ
mô sẹo của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái
sinh rễ từ mơ sẹo.
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA
thich hợp (kết quả từ thí nghiệm 4)
Mẫu cấy: mô sẹo
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng
thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn.
NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS
NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn
NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo ở các nồng độ
nhiễm khuẩn khác nhau. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ ra rễ (%) = (số mẫu ra rễ / tổng số mẫu)*100
số rễ trên mẫu = tổng số rễ / mẫu
3.3.3.8 Thí nghiệm 8 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mơ
sẹo của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái
sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20.


35
Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng.
Mẫu cấy: mô sẹo
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng

thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn.
NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS
NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn
NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mô sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở
các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng,
màu sắc.


36

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của
giống lúa VĐ20”
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mơ sẹo (cm) sau 4 tuần
ni cấy
Nghiệm

2,4-D (mg/l)

BAP (mg/l)

NAA (mg/l)

thức

Kích thƣớc mơ sẹo

(cm) sau 4 tuần

1.1

0

0,5

1

0,91c

1.2

1

0,5

1

0,63a

1.3

2

0,5

1

0,78b

1.4

3

0,5

1

0,71ab

* Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau
khơng có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05).

cm
1

0,91

0,9

0,78

0,8

0,71
0,63

0,7

0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1.1

1.2

1.3

1.4

Nghiệ m thức

Đồ thị 4.1: Kích thƣớc mơ sẹo sau 4 tuần ni cấy ở các nghiệm thức khác nhau


37
Sau 4 tuần nuôi cấy, theo bảng 4.1 cho thấy nghiệm thức (1.1) có kích
thƣớc mơ sẹo lớn nhất và có sự khác biệt rõ rệt so với các nghiệm thức cịn lại. Sự
khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Bên cạnh đó các mẫu
mơ sẹo của nghiệm thức (1.1) có mơ phát triển tốt, xốp, mơ sẹo sinh phơi và có
xuất hiện chồi, cịn các mẫu mơ sẹo của các nghiệm thức cịn lại tuy có phát triển
về kích thƣớc nhƣng mơ sẹo chuyển sang màu vàng nâu và cứng, ít có khả năng
tái sinh cây.
Theo tác giả Đoàn Thị Phƣơng Thuỳ [6], các dịng lúa khác nhau có các đặc
tính di truyền khác nhau vì vậy nhu cầu chất điều hịa tăng trƣởng thực vật cho sự

hình thành và tăng trƣởng mơ sẹo là khác nhau. Có lẽ, nồng độ auxin ngoại sinh
trong nghiệm thức (1.1) là thích hợp, khơng cần bổ sung thêm 2,4-D vào môi
trƣờng, mô sẹo của giống lúa VĐ20 vẫn tăng trƣởng và phát triển tốt hơn so với
các nghiệm thức khác.
Qua bảng 4.1, nghiệm thức (1.1) cho kết quả tốt nhất, do đó nghiệm thức
này đƣợc chọn sử dụng cho thí nghiệm 4.

1 cm
Hình 4.1: Mơ sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5
tuần nuôi cấy (1.1)


38

(1.1)

(1.2)

(1.3)

(1.4)

1 cm

Hình 4.2: Các mơ sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần ni cấy
4.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tái
sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20”
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo
Nghiệm

BAP

NAA

Tỷ lệ tái sinh chồi (%)

thức

(mg/l)

(mg/l)

2 tuần

3 tuần

2.1

1

0,1

41,66ab

58,33ab

2.2

1

0,5

50ab

66,66ab

2.3

1

1

58,33ab

58,33ab

2.4

2

0,1

33,33a

33,33a

2.5

2

0,5

33,33a

50,33ab

2.6

2

1

66,66b

75b

* Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau
khơng có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05).


39

Tỷ lệ (%)

80
70
60
50
40
30

20
10
0

tuần 2
tuần 3

Nghiệm thức

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

Đồ thị 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian
Nhìn chung tỷ lệ tái sinh chồi khá cao. Theo kết quả thống kê, tỷ lệ tái sinh
chồi của các nghiệm thức đều tăng chỉ có ở 2 nghiệm thức (2.3) và (2.4) là không
tăng, và nghiệm thức (2.6) có tỷ lệ tái sinh cao nhất. Sự khác biệt này khơng có ý
nghĩa về mặt thống kê (P>0,05). Từ kết quả bảng cho thấy, tỷ lệ nồng độ giữa
BAP và NAA quá cao sẽ gây ức chế sự tái sinh chồi, nhƣ nghiệm thức (2.4) mô
sẹo không những tái sinh chồi ít mà một số mẫu bị đen khơng phát triển, do đó
việc kết hợp thích hợp tỷ lệ nồng độ BAP và NAA sẽ giúp mô sẹo tái sinh tốt.

40

Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến số chồi hình thành từ mơ sẹo
Nghiệm

BAP

NAA

Số chồi trên mẫu

thức

(mg/l)

(mg/l)

2 tuần

3 tuần

2.1

1

0,1

1.16ab

1,33ab

2.2

1

0,5

1,75ab

2,08b

2.3

1

1

1,91b

2,41b

2.4

2

0,1

0,66a

0,66a

2.5

2

0,5

1,66ab

2,16b

2.6

2

1

1,91b

2,5b

* Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau
khơng có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05).

3

Số chồi

2,5

2
tuần 2

1,5

tuần 3

1
0,5
0
2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

Nghiệm thức
Đồ thị 4.3: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời
gian


41

Số chồi hình thành ở mỗi nghiệm thức đều tăng theo thời gian. chỉ có

nghiệm thức (2.4) số chồi hình thành rất ít và khơng tăng (2,66). Ở nghiệm thức
(2.3) mặc dù tỷ lệ tái sinh ở tuần thứ 3 không tăng so với tuần thứ 2 (bảng 4.2),
nhƣng số chồi lại tăng rõ rệt, có thể ở tỷ lệ nồng độ này ức chế sự tái sinh chồi
nhƣng không ảnh hƣởng đến sự hình thành và phát triển của mẫu đã tái sinh. Sau 3
tuần, ở các nghiệm thức (2.2); (2.3); (2.5), (2.6) số chồi hình thành có sự khác biệt
so với các nghiệm thức còn lại và so với tuần thứ 2. Sự khác biệt này khơng có ý
nghĩa về mặt thống kê sinh học (P>0,05). Tỷ lệ Cyt/Aux có ảnh hƣởng rất quan
trọng, nó quyết định chiều hƣớng phát sinh hình thái của mơ ni cấy [6], do đó
với tỷ lệ Cyt/Aux trong mơi trƣờng thích hợp sẽ kích thích sự tạo chồi của mơ sẹo.
Điều này phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây: hoạt động của một chất điều hoà
tăng trƣởng phụ thuộc vào:
-

Sự cân bằng giữa các chất điều hoà tăng trƣởng thực vật trong mơ đích.

-

Loại mơ đích và trạng thái sinh lý của mơ đích.

[3]
Qua 2 bảng 4.2 và 4.3 cho thấy nghiệm thức (2.6) cho tỷ lệ tái sinh chồi và
số chồi hình thành cao nhất nên ta sẽ sử dụng kết quả nghiệm thức này cho thí
nghiệm 6.


42

1 cm
Hình 4.3: Mơ sẹo tái sinh chồi trên mơi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l
NAA sau 5 tuần ni cấy

(2.1)

(2.4)

(2.2)

(2.3)

(2.5)

(2.6)
1 cm

Hình 4.4: Các mẫu mơ tái sinh chồi ở thí nghiệm 2 sau 5 tuần ni cấy


43
4.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ
mô sẹo của giống lúa VĐ20”
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ hình thành
Nghiệm

NAA (mg/l)

thức

Tỷ lệ tái sinh rễ Số rễ trên mẫu sau 2 tuần
(%) sau 2 tuần

3.1

0,5

58,33a

2,08a

3.2

1

91,66a

4,16a

3.3

1,5

83,33a

4,25a

3.4

2

83,33a

2,66a

* Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau
khơng có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05).

4

60

3

40

2

20

1

0

0
3.1

3.2

3.3

số rễ

5

80

tỷ lệ (%)

100

tỷ lệ rễ
số rễ

3.4

Nghiệm thức
Đồ thị 4.4: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành ở các nghiệm thức khác nhau sau 2
tuần


44
Theo bảng 4.4 cho thấy tỷ lệ tái sinh rễ rất cao, 3 nghiệm thức (3.2), (3.3),
(3.4) có sự khác biệt rõ ràng so với nghiệm thức (3.1), sự khác biệt này khơng có ý
nghĩa về mặt thống kê sinh học (P>0,05). Nhƣ vậy nồng độ NAA cao sẽ kích thích
sự tái sinh rễ tốt hơn. Ở nghiệm thức (3.4) có tỷ lệ tái sinh rễ rất cao (83.33%)
nhƣng số rễ trên mẫu lại thấp, có thể ở nồng độ này kích thích sự tái sinh rễ từ mơ
sẹo nhƣng lại hạn chế sự phát triển rễ từ mẫu tái sinh. Sau 4 tuần nuôi cấy ở 3
nghiệm thức (3.1), (3.2), (3.3), một số mơ sẹo xuất hiện chồi, cịn nghiệm thức
(3.4) khơng có chồi xuất hiện, có thể do nồng độ NAA cao đã ức chế sự tạo chồi
của mơ sẹo.
Hai nghiệm thức (3.2), (3.3) đều có tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ trên mẫu cao,
khơng có sự khác biệt về mặt thống kê, nhƣng ở nghiệm thức (3.3) rễ phát triển

nhiều và tốt hơn. Nên ta chọn kết quả của nghiệm thức (3.3) sử dụng cho thí
nghiệm 7.

1 cm
Hình 4.5: Mơ sẹo tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau 5 tuần
nuôi cấy


45

(3.1)

(3.2)

(3.3)

(3.4)

1 cm
Hình 4.6: Các mẫu mơ tái sinh rễ ở thí nghiệm 3 sau 5 tuần ni cấy
4.4 Thí nghiệm 4: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên mô sẹo của giống lúa VĐ
20”
Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tạo sẹo của hạt lúa
Nghiệm thức

Vml dung dịch vi khuẩn

Tỷ lệ tạo sẹo (%)

4.1

0

85,33b

4.2

0,5

79,33b

4.3

1

84,66b

4.4

1,5

62,33a

* Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau
khơng có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05).