Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacteriumsp lên sự phát sinh cơ quan ở cây lúa nuôi cấy In Vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***




CHU LÝ HẢI ANH



KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN
METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ
QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO





Luận văn kỹ sƣ
Chuyên Ngành: Công nghệ sinh học

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN
METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ
QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO



Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành:Công nghệ sinh học




Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS. TS. BÙI VĂN LỆ CHU LÝ HẢI ANH
ThS. KIỀU PHƢƠNG NAM Khóa: 2002-2006

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006



MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY









STUDYING EFFECT OF METHYLOBACTERIUM SP. ON
MORPHOGENESIS OF IN VITRO RICE (Ozyra sativa L)



Engineer Thesis
Major: Biotechnology




Research adviser Researcher
BÙI VĂN LỆ, PROF, PhD CHU LÝ HẢI ANH

KIỀU PHƢƠNG NAM, MSc Term: 2002 - 2006









HCMC, 09/2006

iv

MỤC LỤC
Trang

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU …………………………………………………………………….. 1
TỔNG QUAN………………………………………………………………... 3
2.1 Giới thiệu về cây lúa…………………………………………………….. 3
2.1.1 Vị trí phân loại……………………………………………………. 3
2.1.2 Nguồn gốc và phân bố…………………………………………….. 4
2.1.3 Đặc điểm hình thái………………………………………………… 5
2.1.4 Đặc điểm hạt lúa…………………………………………………... 6
2.2 Ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô trong cải tiến giống lúa………... 7
2.3 Phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro………………………………10

2.3.1 Sự tái sinh mẫu cấy (sự tạo cơ quan)……………………………..10
2.3.2 Sự tạo mô sẹo từ cơ quan………………………………………….11
2.3.3 Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy trên sự
nuôi cấy tế bào…………………………………………………………….13
2.3.3.1 Môi trƣờng nuôi cấy………………………………………13
2.3.3.2 Các nhân tố vật lý…………………………………………13
2.3.3.3 Ảnh hƣởng của chất điều hòa tăng trƣởng thực vật……14
2.4 Ảnh hƣởng của vi sinh vật lên sự phát triển thực vật………………….14
2.5 Đặc điểm của chi Methylobacterium……………………………………..15
2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại…………………………………….15
2.5.2 Đặc điểm sinh thái………………………………………………….17
2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa……………………………...18

v

2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp………………..19
2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật……………………………………..19
2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin………………………….23
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP……………………………………………24
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu……………………………………….24
3.2 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………………….24
3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu………………………………………………24
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu………………………27
3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy………………………………….....27
3.3.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn………………………….....27
3.3.5 Môi trƣờng nuôi cấy………………………………………………..28
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………28
3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mô sẹo)……………………………………...28
3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn…………………………………………….30
3.3.3 Nội dung thí nghiệm…………………………………………………30

3.3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng
nhân sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………...30
3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả
năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………...31
3.3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái
sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………………………………..31
3.3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo
mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………32
3.3.3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân
sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………………...33
3.3.3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái
sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………………………………33
3.3.3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái
sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………………………………...34

vi

3.3.3.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng
sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………..34
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………………36
4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của
giống lúa VĐ20…………………………………………………………………36
4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh
chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………38
4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ
mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………….43
4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo của
giống lúa VĐ20………………………………………………………………….45
4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của
giống lúa VĐ20………………………………………………………………….47

4.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ
mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………….50
4.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô
sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………………53
4.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo
của giống lúa VĐ20……………………………………………………………..55
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………………………..58
5.1 Kết luận……………………………………………………………………...58
5.2 Đề nghị……………………………………………………………………….59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D : Dichlorophenoxy-acetic acid
Aux : Auxin
BAP : 6-Benzylamino-purin
Cs : Cộng sự
Cyt : Cytokinin
MS : Murashige-Skoog
MMS : Methanol mineral salts
NAA : α-naphthalene acetic acid

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mô sẹo (cm) sau 4 tuần
nuôi cấy………………………………………………………………………......36
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô

sẹo……………………………………………………………………………….38
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến số chồi hình thành từ mô
sẹo……………………………………………………………………………….40
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến tỷ lệ tái sinh và số rễ hình thành…43
Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tạo sẹo của hạt lúa…………….45
Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến đƣờng kính mô sẹo…………………47
Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lế tái sinh chồi và số chồi hình thành
từ mô sẹo…………………………………………………………………………50
Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lế tái sinh rễ và số rễ trên mẫu…...53
Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên sự tăng sinh mô sẹo sau 4 tuần nuôi
cấy………………………………………………………………………………..55

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Vi khuẩn có sắc tố hồng ngoại nhiễm vào môi trƣờng nuôi cây: A: Saintpaulia
ionantha; B: Paulonia fortunei; C: Pacciflora sp. [8]………………………………….2
Hình 2.1: Oryza sativa L………………………………………………………....6
Hình 2.2: Cấu trúc hạt lúa……………………………………………………….7
Hình 2.3: Methylobacterium sp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn chụp
qua kính hiển vi điện tử (B)…………………………………………………….17
Hình 2.4: Methylobacterium sp. chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trƣờng thạch LB
(A) vào môi trƣờng dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [36]...18
Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của loài cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trƣờng
MS không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy. (a): không bổ sung vi khuẩn
Methylovorus mays. (b): có bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays[21]……….20
Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chƣa bóc vỏ trấu, (b) hạt bóc vỏ trấu……..24
Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên môi trƣờng tạo sẹo……………………….29
Hình 4.1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5
tuần nuôi cấy (1.1)……………………………………………………………..37

Hình 4.2: Các mô sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần nuôi cấy…………………….38
Hình 4.3: Mô sẹo tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l
NAA sau 5 tuần nuôi cấy………………………………………………………42
Hình 4.4: Các mẫu mô tái sinh chồi ở thí nghiệm 2 sau 5 tuần nuôi cấy………42
Hình 4.5: Mô sẹo tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau 5 tuần
nuôi cấy…………………………………………………………………………44
Hình 4.6: Các mẫu mô tái sinh rễ ở thí nghiệm 3 sau 5 tuần nuôi cấy…………45
Hình 4.7: Sự tạo mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l 2,4-D: (a) có bổ sung
1ml dung dịch khuẩn, (b) không có bổ sung khuẩn sau 2 tuần nuôi cấy……….47
Hình 4.8: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP và 0,5mg/l
NAA: (a) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (b) không bổ sung khuẩn sau 4 tuần
nuôi cấy…………………………………………………………………………49

x

Hình 4.9: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP, 0,5mg/l
NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (5.4)…………………49
Hình 4.10: Sự tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA
và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.2)………………………..52
Hình 4.11: Sự tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA
và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.4)………………………..52
Hình 4.12: Sự tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 0,5ml dung
dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.2)………………………………………..54
Hình 4.13: Sự tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 1,5ml dung
dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.4)………………………………………..55
Hình 4.14: Sự tăng sinh mô sẹo ở thí nghiệm 8 trên môi trƣờng MS không bổ sung
hormone: (a) không có bổ sung khuẩn, (b) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (c)
bổ sung 1ml dung dịch vi khuẩn, (d) bổ sung 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần
nuôi cấy………………………………………………………………………..57

xi

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3: Đƣờng cong tăng trƣởng của chủng 1019……………………………...26
Đồ thị 4.1: Kích thƣớc mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức khác nhau36
Đồ thị 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian……..39
Đồ thị 4.3: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời
gian……………………………………………………………………………….40
Đồ thị 4.4: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành ở các nghiệm thức khác nhau sau 2
tuần……………………………………………………………………………….43
Đồ thị 4.5: Tỷ lệ tạo mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần…………..46
Đồ thị 4.6: Kích thƣớc mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian…….48
Đồ thị 4.7: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian……..50
Đồ thị 4.8: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời
gian………………………………………………………………………………..51
Đồ thị 4.9: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác
nhau sau 2 tuần…………………………………………………………………...53
Đồ thị 4.10: Số chồi, số rễ hình thành trên mẫu, kích thƣớc mô sẹo ở các nghiệm
thức khác nhau sau 4 tuần………………………………………………………...56

xii

TÓM TẮT
CHU LÝ HẢI ANH, Đại học Nông Lâm TPHCM. Tháng 8/2006.
“ KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP.
LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CÂY LÚA (Oryza sativa L.) NUÔI CẤY IN
VITRO”.
Giáo viên hƣớng dẫn:
PGS. TS. Bùi Văn Lệ
ThS. Kiều Phƣơng Nam

Đề tài đƣợc thực hiện tại trại thực nghiệm – khoa Sinh học - trƣờng Đại học
Khoa học Tự nhiên trên đối tƣợng là giống lúa VĐ20 và chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. 1019. Tiến hành nhân sẹo, tạo chồi, tạo rễ từ mô sẹo của
giống lúa VĐ20 bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro, sau đó khảo sát ảnh hƣởng
của chủng 1019 lên khả năng phát sinh cơ quan của mô sẹo bằng cách bổ sung
những nồng độ khuẩn khác nhau vào môi trƣờng nuôi cấy với 34 nghiệm thức,
mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu nhƣ tỷ lệ tái sinh, số chồi trên mẫu,
số rễ trên mẫu, đƣờng kính mô sẹo.
Những kết quả thu đƣợc:
- Chủng 1019 có tác dụng kích thích sự phát triển rễ, ức chế khả năng tái
sinh chồi và thay đổi trạng thái, cấu trúc của mô sẹo. Chứng tỏ chủng
khuẩn có tác động đến quá trình trao đổi chất, sinh lý, sinh hóa của tế bào
mô sẹo, ảnh hƣởng đến sự phát sinh hình thái của sẹo.
- Chủng 1019 có ảnh hƣởng đến quá trình phát sinh hình thái của giống lúa
VĐ20, chiều hƣớng phát sinh cơ quan tuỳ thuộc vào bản chất của mô cấy
và loài thực vật.
- Nồng độ khuẩn cao sẽ ức chế hoàn toàn mô sẹo, không thấy đƣợc sự phát
sinh cơ quan từ mô sẹo.

xiii








Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
Phó Giáo sư- Tiến sĩ Bùi Văn Lệ. Ngƣời đã gợi ý đề tài, luôn giúp đỡ và tận

tình hƣớng dẫn em trong suốt thời gian làm khoá luận.

Thạc sĩ Kiều Phương Nam, đồng hƣớng dẫn, thầy đã tận tình hƣờng dẫn và
tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khoá luận này.

Tiến sĩ Trần Thị Dung, cô đã giảng dạy và truyền đạt cho em nhiều kinh
nghiệm quý giá trong suốt thời gian theo học ở trƣờng.

Tiến sĩ Từ Bích Thủy, cô đã truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm làm việc,
trình bày khóa luận và đóng góp những ý kiến quý báu cho khóa luận này.













xiv




Em xin chaõn thaứnh caỷm ụn
Ton th quớ thy cụ trong b mụn Cụng ngh sinh hc. Trng i hc

Nụng Lõm TPHCM. Nhng ngi ó ging dy v truyn t cho em nhng kin
thc quý giỏ trong thi gian hc tp ti trng.

Ton th quớ thy cụ trong b mụn Sinh hc. Trng i hc Khoa hc T
nhiờn - i hc Quc gia TPHCM. Nhng ngi ó to iu kin thun li v
úng gúp nhiu ý kin trong sut quỏ trỡnh thc hin khúa lun ny.

Tp th cỏc bn sinh viờn khúa DH02SH, Trng i hc Nụng Lõm
TPHCM, v cỏc bn thõn ó giỳp v ng viờn tụi trong sut quỏ trỡnh hc tp
cng nh thc hin khoỏ lun ny.

Cỏc anh, ch v cỏc bn sinh viờn khoa Cụng ngh sinh hc, Trng i hc
Khoa hc T nhiờn - i hc Quc gia TPHCM, ó giỳp v ng viờn em
trong thi gian thc hin khúa lun.

Con xin t lũng thnh kớnh v bit n Ba, M. Ngi ó sinh thnh v
dng dc con.

Con xin t lũng thnh kớnh v bit n B ngoi, B ni. Ngi ó ht lũng
thng yờu, dy d con cú c ngy hụm nay.

Con xin t lũng bit n Cụ, Dỡ, Dng ó thng yờu v ng viờn con.


1


GIỚI THIỆU

Lúa là cây lƣơng thực quan trọng, là nhu cầu không thể thiếu đối với con
ngƣời, đặc biệt ở các nƣớc Châu Á. Do đó, việc nghiên cứu, cải tiến và tạo ra các
giống lúa có phẩm chất tốt, khả năng chống chịu cao là vấn đề quan tâm của nhiều
nhà khoa học.
Công nghệ nuôi cấy mô thực vật hiện nay đang phát triển rất mạnh mẽ và
ngày càng mang lại hiệu quả kinh tế cao. Công nghệ này giúp tạo ra một số lƣợng
lớn cây trồng đồng nhất, duy trì các tính trạng tốt, tạo cây sạch bệnh… Việc nâng
cao năng suất lúa bằng cách phối hợp giữa phƣơng pháp thông thƣờng và công
nghệ sinh học là chiến lƣợc đƣợc nhiều quốc gia quan tâm.
Tuy nhiên, một trở ngại cần quan tâm trong nuôi cấy mô thực vật là hiện
tƣợng nhiễm nấm, khuẩn sẽ ảnh hƣởng không tốt đến sự sinh trƣởng và phát triển
của các mô thực vật. Nhƣng điều đó không có nghĩa là tất cả các loài nấm, khuẩn
nhiễm trong môi trƣờng nuôi cấy đều có hại. Ngoài ra chính điều kiện vô trùng
trong quá trình nuôi cấy đã loại bỏ các mối tƣơng tác có ích giữa thực vật và vi
sinh vật. Theo một số nghiên cứu, sự hiện diện của một số loài nhƣ Bacillus spp.
[5], Methylobacterium sp. [46], [47] .. trong môi trƣờng nuôi cấy không những
không làm chết mô thực vật mà ngƣợc lại dƣờng nhƣ còn kích thích sự sinh trƣởng
của cây.

2



A B C
Hình 1: Vi khuẩn có sắc tố hồng ngoại nhiễm vào môi trƣờng nuôi cây:
A: Saintpaulia ionantha; B: Paulonia fortunei; C: Pacciflora sp. [9]

Đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành trên cây lúa (Oryza sativa L) và kết
quả cho thấy vi khuẩn Methylobacterium sp. có khả năng làm gia tăng tỷ lệ nảy
mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao của cây mạ trong điều kiện in vitro

…Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI
KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở
CÂY LÚA (Oryza sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO”.

Mục đích
Tìm hiểu ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên sự phát sinh
cơ quan cây lúa: mô sẹo, chồi, rễ.
Yêu cầu
Xác định nồng độ kích thích tố thích hợp đến khả năng tạo mô sẹo, nhân
sẹo, tạo chồi, nhân chồi, tạo rễ ở cây lúa bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro.
Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên khả năng tạo
mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ ở cây lúa.
So sánh ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. với ảnh hƣởng của
các kích thích tố lên sự phát sinh cơ quan.

3


TỔNG QUAN



2.1. Giới thiệu về cây lúa
Lúa là cây lƣơng thực chính cho nhiều ngƣời và đồng thời lúa gạo cũng
tham gia vào các hoạt động kinh tế quan trọng nhất trên thế giới. Châu Á là nơi
sản xuất 90% tổng sản lƣợng và cũng là nơi tiêu thụ lúa gạo nhiều nhất. Khoảng
85% sản lƣợng gạo, 72% lúa mì và 19% ngô đƣợc con ngƣời tiêu thụ trực tiếp
[38]. Lúa gạo cung cấp 21% năng lƣợng và 15% protein cho loài ngƣời [30].
Từ 1989 trở lại đây, Việt Nam trở thành một trong những nƣớc xuất khẩu
gạo hàng đầu trên thế giới. Năm 2001 các nƣớc xuất khẩu gạo chính (tính theo

triệu tấn) bao gồm: Thái Lan (6,4), Việt Nam (4,0), Trung Quốc (3,0), Mỹ (2,8)
(USDA, 2001). 14 năm qua, cây lúa đặc biệt là ở ĐBSCL đã đóng góp cho đất
nƣớc gần 8 tỷ USD trị giá xuất khẩu và đã góp phần to lớn cho công cuộc đổi mới
ở Việt Nam có kết quả. Tuy sản xuất với số lƣợng nhiều, nhƣng chất lƣợng và giá
gạo xuất khẩu của Việt Nam thƣờng thấp hơn so với một số nƣớc nhƣ Thái Lan,
Mỹ, Úc, đặc biệt có sự chênh lệch lớn ở loại gạo đặc sản và gạo cao cấp [8].
2.1.1 Vị trí phân loại
Lớp: Monocotyledonae
Họ: Poaceae
Giống: Oryza
Loài: Oryza sativa L.


4


Lúa O. sativa có 2n = 24 nhiễm sắc thể, thƣờng đƣợc phân biệt làm 3
nhóm:
Lúa Indica: thƣờng trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, có thân cao,
dễ đổ ngã, nhiều chồi, lá ít xanh và cong và kháng đƣợc nhiều sâu bệnh nhiệt đới.
Hạt gạo dài hoặc trung bình, có nhiều tinh bột. Năng suất kém hơn lúa Japonica.
Lúa Japonica: thƣờng đƣợc trồng ở những vùng ôn đới hoặc những nơi có
độ cao trên 1000 m (trên mặt biển), có thân ngắn, chống đổ ngã, lá xanh đậm,
thẳng đứng, ít chồi, hạt gạo thƣờng tròn, ngắn hoặc trung bình, dẻo khi nấu vì ít
chất tinh bột. Lúa Japonica có năng suất cao.
Lúa Javanica (bulu) hay lúa Japonica nhiệt đới đƣợc trồng ở Indonexia, có
đặc tính ở giữa hai loại lúa Japonica và Indica. Hình thức gần giống nhƣ lúa
Japonica, có lá rộng với nhiều lông và ít chồi. Thân cứng, chắc và ít cảm quang.
Hạt lúa thƣờng có đuôi [7].
2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Cây lúa đƣợc canh tác từ vĩ tuyến 40
0
phía nam bán cầu đến vĩ tuyến 53
0

của bắc bán cầu, và đƣợc trồng từ mặt đất thấp hơn mặt nƣớc biển cho đến độ cao
2000m trên mặt biển. Trên thế giới có 20 loài lúa hoang và 2 loài canh tác. Cây lúa
hiện đƣợc canh tác đại trà để cung cấp lƣơng thực cho con ngƣời trên thế giới là
Oryza sativa L. ở châu Á, có năng suất cao và đƣợc ƣa chuộng. Loài lúa Oryza
glaberrima Steud. đƣợc canh tác ít hơn ở Tây châu Phi, có năng suất và chỉ số thu
hoạch thấp hơn O.sativa.
Các cuộc nghiên cứu trên đất gạch bằng trấu trong các thành phố danh tiếng
đổ nát ở Ấn Độ và trong vùng sông Cửu Long nhƣ Myanma, Thái Lan, Lào,
Campuchia và Việt Nam phát hiện rằng cây lúa trồng ở Đông Dƣơng do phát triển
theo 2 ngả: từ Lào theo sông Cửu Long đi xuống phƣơng nam có đặc tính cây lúa
Japonica nhiệt đới, một ngả khác từ Ấn Độ qua vịnh Bengal đến bờ biển Đông
Dƣơng, với đặc tính của cây lúa Indica. Vì vậy, Việt Nam với khí hậu nhiệt đới
nằm trong vùng đa dạng sinh thái của thảo mộc gồm cả cây lúa Indica và Japonica
nhiệt đới [7].
5



2.1.3 Đặc điểm hình thái
O. sativa là cây thân thảo, hệ thống rễ chùm, sống hằng năm, có thời gian
sinh trƣởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng vá các điều kiện sinh
thái và kéo dài trong khoảng từ 75-250 ngày.
Cây mọc thẳng đứng hay mọc nghiêng rồi bò dài (lúa nổi), lúa sống ở cạn, đất
cao hay nƣớc ngập chân hoặc một phần thân hay trong nƣớc sâu 2-4m.
Thân cao từ 70-150cm, một số giống lúa nổi có thân cao 2-3m, hay 5-6m (lúa

nổi ở Bangladesh). Đốt thân nhẵn và cách nhau bởi những dóng dài, ngắn khác
nhau. Phiến lá thẳng hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp. Bẹ
lá có thìa lìa, lá dìa hình mũi mác hay chẻ đôi, các đầu chẻ đều nhọn.
Lúa thƣờng tạo ra thành nhiều nhánh (dảnh lúa: tillers), bao gồm cọng và lá
có hoặc không có bông (panical). Nhánh bậc 1 xuất hiện từ những đốt gần thân
chính và nhánh bậc hai, bậc ba xuất hiện từ những nhánh bậc một này. Lá mọc liên
tiếp trên thân bao gồm bẹ lá bao lấy thân và phiến lá. Cổ lá nối giữa phiến lá và bẹ
lá có một lƣỡi bẹ và 2 thìa lìa từ cổ lá. Bông mọc trên đốt trên cùng của thân từ
bên trong lá cờ và mang nhiều hoa trong một bông con. Cụm hoa là một chùm
thƣa, thẳng, hẹp, đầu hơi cong xuống, dài 15-30cm hoặc dài hơn. Hoa nhỏ hình
thuôn dài, mày hoa thuôn dài hình mũi mác, hoa màu hồng vàng hay màu tím, có
hoa lƣỡng tính, tự thụ phấn. Hoa có 6 nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa có vòi,
nhụy ngắn và hai đầu nhụy có lông tơ [28].
Về cơ bản, lúa là cây thích nghi với điều kiện có nƣớc. Ba giai đoạn chính
trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây lúa theo viện nghiên cứu quốc tế
IRRI là:
- Nẩy mầm và sinh trƣởng sinh dƣỡng
- Giai đoạn phát triển cơ quan sinh sản
- Giai đoạn hạt chín [28]


6

Hình 2.1: Oryza sativa L.

2.1.4 Đặc điểm hạt lúa
Cơ cấu hạt lúa là quả dĩnh nhỏ gồm có:
 Vỏ trấu gồm trấu trên và trấu dƣới.
 Cám gồm biểu bì, quả bì và chủng bì (nucellus). Màu sắc hạt gạo do lớp
chủng bì.
 Phôi nhũ gồm có lớp aleuron và phôi nhũ tích tụ tinh bột.
 Mầm cây gồm có phôi (mầm) lá, phôi rễ và trụ phôi giữa ở phần dƣới
của hạt.
Hạt lúa là noãn sào thụ tinh đã chín, có hai mày trấu nhỏ trên và dƣới, hai
vỏ trấu trên và dƣới, cuống trấu ở phần dƣới của hạt và đuôi ở chót hạt (ngắn hoặc
dài). Một hạt lúa có trọng lƣợng từ 12 – 44 mg ở 0% ẩm độ.

7



Hình 2.2: Cấu trúc hạt lúa
Theo IRRI, hạt gạo đƣợc phân loại theo chiều dài của hạt gạo nhƣ sau: rất
dài: > 7,50 mm, dài: 6,61 – 7,50 mm, trung bình: 5,51 – 6,60 mm, và ngắn: < 5,50
mm. Theo Ủy ban thực phẩm Codex (1990), sự xếp hạng gạo theo tỉ lệ bề dài –
đối với – bề rộng nhƣ sau: hạt dài: 3,1, hạt trung bình: 2,1 – 3,0, và hạt ngắn:
2,0 [38].

2.2. Ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô trong cải tiến giống lúa
Các tiến bộ mới đây về kỹ thuật sinh học đặc biệt là nuôi cấy mô, tế bào và
sinh học phân tử đã mở ra những hƣớng mới cho việc cải tiến cây lúa có năng suất
cao và ổn định, tạo ra cơ hội tốt để hoàn thiện các mục tiêu chọn giống mà trƣớc
đây chúng ta không thể làm đƣợc. Phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật là
phƣơng pháp nhân giống lý tƣởng không chỉ do đòi hỏi ít diện tích, nhanh mà còn
8


giữ nguyên đƣợc tính ƣu việt của giống ban đầu. Trong quá trình nghiên cứu cơ sở
di truyền của sự biến đổi các tế bào thực vật nuôi cấy, ngƣời ta thấy rằng công
nghệ nuôi cấy tế bào cho chúng ta lợi thế quan trọng làm thay đổi giống cây trồng
theo hƣớng có lợi [4]. Bên cạnh đó nuôi cấy in vitro góp phần quan trọng trong
việc tạo ra các vật liệu cần thiết nhƣ chồi, phôi mầm… cho các phƣơng pháp chọn
lọc giống, phƣơng pháp chuyển nạp gen trên lúa và các đối tƣợng thực vật khác.
* Nuôi cấy túi phấn
Nuôi cấy túi phấn để phát triển các dòng đồng hợp tử hay dòng đơn bội kép.
Sự tái sinh cây trồng từ túi phấn chỉ giới hạn trong kiểu gen japonica, nó có nhƣợc
điểm là khá năng trồng cây lai rất thấp nhất là đối với các giống lúa indica. Cho
đến nay kỹ thuật này chỉ mới thành công để cái tiến các giống lúa japonica ở
Trung Quốc, Hàn Quốc [57].
* Cứu sống phôi mầm
Cứu sống phôi mầm để tạo ra con lai đặc biệt: các loài hoang dại là nguồn
phong phú của các gen hữu ích. Phôi mầm 10 ngày tuổi đƣợc tách ra và cấy vào
môi trƣờng, tiếp tục hồi giao với giống lúa trồng để có con lai vừa nhận đƣợc gen
cần thiết của lúa hoang và dạng hình cải tiến của lúa trồng. Kỹ thuật này thành
công trong việc khai thác nguồn gen kháng rầy nâu, rầy lƣng trắng trong tổ hợp lai
giữa O. officinalis và O. sativa [42].
* Khai thác biến dị tế bào soma và chọn lọc các đột biến có ích trong nuôi cấy

mô tế bào
Tính chất biến dị này đã đƣợc biết với các đột biến nhƣ đặc tính kháng bệnh,
kháng mặn, kháng độ độc nhôm, đặc tính chiều cao và thời gian sinh trƣởng. Trên
lúa, Oono (1981, 1983) đã ghi nhận sự biến dị của một số đặc tính con lai trong
nuôi cấy mô, quan sát dòng R2 có 52% biểu hiện dạng hình mới [51], [52], [58] .
Schaeffer và cs (1984) đã tìm thấy biến dị đối với đặc tính dạng hạt, hàm lƣợng
protein, chiều cao, số chồi khi nuôi cấy túi phấn của giống Calrose 76 [56]. Nguồn
biến dị đƣợc kích thích bởi kỹ thuật nuôi cấy mô của con lai cần đƣợc nhấn mạnh
9


đặc biệt về cách du nhập các gen trong những genome khác nhau mà trong đó
không có tính chất tƣơng đồng của nhiễm thể.
* Khai thác biến dị phôi (somatic embryogenesis)
Nuôi cấy tế bào phôi đang trở nên quan trọng đối với việc tạo ra một tần suất
cao của sự tái sinh từ tế bào, từ hạt phấn, từ tế bào trần cũng nhƣ các tế bào
chuyển nạp. Ngƣời ta tạo ra hạt tổng hợp (synthetic seeds) bằng cách nuôi cấy tế
bào phôi, sau đó bảo quản phôi trƣởng thành trong túi (encapsulation) để làm vật
liểu giống cây trồng. Đối với lúa nghiên cứu hạt tổng hợp vẫn còn rất mới mẻ, cần
nghiên cứu sâu hơn invitro để phát triển các phôi somatic có thể nảy mầm thành
cây. Kỹ thuật hạt giống tổng hợp trên cây lúa có tiềm năng rất lớn để khai thác ƣu
thế lai, vì nó giúp cho việc nhân giống, cũng nhƣ phát triển các cây lai có ƣu thế
mạnh đƣợc sớm đƣa ra sản xuất rộng rãi [2].
* Kỹ thuật chuyển nạp gen và sản xuất cây lúa transgenic
Các tiến bộ gần đây trong nuôi cấy mô và sinh học phân tử đã mở ra những
hƣớng mới trong thu nhập các gen lạ vào cây trồng. Gen lạ đƣợc lắp ghép thành
công ở nhiều loài cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium cũng nhƣ phƣơng
pháp chuyển nạp DNA trực tiếp [61].
Có 2 cách để đƣa vật liệu di truyền ngoại lai ở dạng từng gen riêng biệt vào
tế bào thực vật:

(1) Chuyển gen qua vector: các plasmid có thể đƣợc dùng làm vector để
chuyển các vật liệu di truyền vào tế bào thực vật. Các plasmid này gọi là Ti
và Ri.
(2) Truyền trực tiếp DNA
- phƣơng pháp vi tiêm
- biến nạp bằng xung điện
- biến nạp do mở lỗ bằng điện
- biolistics
Nghiên cứu sản xuất cây lúa transgenic đã đƣợc báo cáo [45] . Nhiều đặc tính
cây lúa có thể đƣợc cải tiến bằng phƣơng pháp du nhập các gen mới. Đề án hợp
10


tác giữa IRRI và PGS (Plant Genetic System) Bỉ, nhằm thực hiện tách gen Bt (từ
Bacillus thurigiensis) dòng có độc tính đối với sâu cuốn lá và sâu đục thân - đồng
thời chuyển gen này vào cây lúa. Chuyển nạp gen giữa các tế bào trần đã áp dụng
thành công trên giống Tepei Boro (Bangladesh) và IR43 [37]: cả hai phƣơng pháp
lai tế bào trần và bắn gen đều đƣợc sử dụng, những cây đƣợc chuyển nạp đều có
hai gen của bacteria.

2.3. Phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro
2.3.1 Sự tái sinh mẫu cấy (sự tạo cơ quan)
Môi trƣờng và chất điều hòa sinh trƣởng thực vật thích hợp cho sự phân chia
tế bào để tế bào tăng sinh nhanh chóng thì không thể cảm ứng cho sự phát sinh
hình thái (tạo chồi, rễ). Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô thực vật, sự phát sinh cơ
quan xảy ra khi mô sẹo đƣợc nuôi lâu trong môi trƣờng, nhƣng có thể sự phát sinh
hình thái này bị ức chế nếu mô sẹo cấy chuyền liên tục. Trong trƣờng hợp khác,
mô sẹo hình thành từ mẫu cấy trong môi trƣờng tạo mô sẹo, sau đó chuyển sang
môi trƣờng khác có thành phần dƣỡng chất và chất điều hòa sinh trƣởng thực vật
thay đổi thì sự phát sinh cơ quan (chồi, rễ) sẽ xảy ra.

Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo tƣơng tự nhƣ sự phát sinh cơ quan trực tiếp
từ mẫu cấy. Khi thay đổi thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng
thực vật thì tế bào mô sẹo lại đƣợc cảm ứng để phân hóa tạo cơ quan [13].
Tái sinh cây từ mô sẹo lúa: khi đƣờng kính mô sẹo đạt 0,5-1mm, mô sẹo
sẽ đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng tái sinh. Nếu các mô sẹo còn non (0,5mm
hay nhỏ hơn) mà đã cấy chuyền sang môi trƣờng tái sinh thì sẽ bị chết nhiều và
cho số chồi xanh ít. Mô sẹo càng già thì khả năng tái sinh càng kém. Vì vậy nên
chọn những mô sẹo trung bình và đang tăng trƣởng tốt để cấy chuyền. Kích thƣớc
mô sẹo tăng khá nhanh, sau vài tuần, trên một số mô sẹo xuất hiện những điểm
xanh, từ những điểm xanh này sẽ hình thành chồi và phát triển thành cây [13].


11



2.3.2 Sự tạo mô sẹo từ mô hay cơ quan
Kỹ thuật tạo mô sẹo đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 1920,
đầu những năm 1930, và là một trong những phƣơng pháp đầu tiên của kỹ thuật
nuôi cấy mô trong nhiều năm [59]. Trong phƣơng pháp này, mô sẹo ở những điều
kiện môi trƣờng thích hợp có thể tái sinh cơ quan theo chiều hƣớng mà ta mong
muốn, tạo ra những vật liệu sử dụng trong các phƣơng pháp sinh học khác nhƣ:
chuyển gen, chọn lọc dòng soma, tạo giống cây sạch bệnh…
Mô sẹo (callus) là một khối tế bào không có tổ chức, có đặc tính phân chia
mạnh, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dƣới các điều kiện đặc biệt:
có vết thƣơng, xử lý các chất điều hòa tăng trƣởng nhƣ 2,4- D trong tối… Các tế
bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ tế bào của mô phân sinh, phải chịu
một sự phản phân hóa trƣớc lần đầu tiên. Sự phản phân hóa có vai trò rất quan
trọng, nó cho phép một tế bào đã trƣởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa). Sự trẻ
hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích

hợp [54].
* Vai trò của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo
Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái
sinh lý, sinh hóa và kiểu gen [59]. Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân
bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trƣờng nuôi cấy [13].
- Các mô và các cơ quan có thể đƣợc sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo nhƣ:
rễ, thân, lá, củ, chồi hoa, túi phấn, phôi hợp tử chƣa trƣởng thành, phôi
hợp tử trƣởng thành…Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan, thƣờng
phải sử dụng các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật với loại và nồng độ
khác nhau tuỳ theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ
quan đó.
- Những mảnh cơ quan đã trƣởng thành thƣờng không có khả năng tạo
mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo. Ngƣợc lại, cây non