Luận văn : KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH part 3 pps

43










Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn trong thử nghiệm Gram vật kính 100X.
4.2.2. Mối quan hệ với oxy:
Trong thí nghiệm khảo sát mối quan hệ với oxy của các chủng phân lập được.
Trong tổng số 26 khuẩn lạc (chủng) vi khuẩn đều cho phản ứng catalase dương tính.
Từ đó, có thể kết luận rằng các chủng vi khuẩn đã phân lập được là vi khuẩn hiếu khí.
Ngoài ra, trong bốn chủng đại diện cho nhóm đều cho phản ứng oxydase dương tính
cũng cho phép chúng tôi xác nhận một lần nữa các chủng này là vi khuẩn hiếu khí. Kết
quả này phù hợp với các công trình nghiên cứu của Green (1992), trước đây [34].
4.2.3. Khả năng đi động
Kết quả thử nghiệm khả năng di động trong bốn chủng kiểm tra đều có khả
năng di động (mọc lan ra khỏi đường cấy). Từ đó chúng tôi cũng có thể kết luận răng
bốn chủng có roi (hay tiêm mao).
4.2.4. Kết quả khả năng sử dụng các chất cung cấp nguồn cacbon
Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cung cấp carbon và năng
lượng các khuẩn lạc thuần được tóm tắt trên bảng 4.2.
Bảng 4.2: Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn.

Arabinose

Fructose
ethanol
methylamine
trimethylamine
Betaine
serbacate
Glutamate
Acetate
nutrient agar
Catalase
Citrate
Mannitol
Maltose
Sucrose
LM1
–
–
+
+
–
+
–
–
+
+
+
+
+
+
+

LM2
–
–
+
+
–
+
–
–
+
+
+
+
+
+
+


44
LM3
–
–
+
+
–
+
–
–
+
+

+
+
+
+
+
BS16
–
–
+
+
–
+
–
–
+
+
+
+
+
+
+
BS17
–
–
+
+
–
+
–
–

+
+
+
+
+
+
+
BS18
–
–
+
+
–
+
–
–
+
+
+
+
+
+
+
BN21
–
–
+
+
–
+

–
–
+
+
+
+
+
+
+
TS9
+
–
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
BD11
+
–
–
–

–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
TN12
+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
TN13
+
–

–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
TD15
+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
GN19

+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
GS22
+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+

+
GS23
+
–
+
+
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
GD26
+
–
+
+
–
–
–
–
+
+
+
+

+
+
+
TN10
+
+
+
–
–
–
+
+
–
+
+
+
+
+
+
GD14
+
+
+
–
–
–
+
+
–
+

+
+
+
+
+
LM4
–
+
–
–
–
+
–
+
–
+
+
–
+
+
+
LB5
–
+
–
–
–
+
–
+

–
+
+
–
+
+
+
TS6
–
+
–
–
–
+
–
+
–
+
+
–
+
+
+
TS7
–
+
–
–
–
+

–
+
–
+
+
–
+
+
+
TS8
–
+
–
–
–
+
–
+
–
+
+
–
+
+
+
GS24
–
+
–
–

–
+
–
+
–
+
+
–
+
+
+
GN25
–
+
–
–
–
+
–
+
–
+
+
–
+
+
+
BN20
–
+

–
–
–
+
–
+
–
+
+
–
+
+
+

Từ các thử nghiệm sinh hóa này chúng tôi tiến hành phân nhóm các khuẩn lạc
có đặc điểm sinh hóa giống nhau. Các khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống nhau
được xếp vào cùng một nhóm và từ mỗi nhóm này chỉ dùng một đại diện để tiến hành
tính hệ số tương đồng Jaccard so với đặc điểm sinh hóa của các chủng đã được công
bố. Có tất cả 4 nhóm và bốn đại diện cho bốn nhóm được sử dụng trong tính toán hệ số
tương đồng là: LM2, TS7, TN10, TD15.


45

Hình 4.3: Kết quả khảo sát khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn.
Chú thích: 1: arabinose, 2: betaine, 3: citrate, 4: glucose, 5: ethanol, 6: fructose, 7:
glutamate, 8: acetate, 9: methylamine, 10: serbacate, 11: trimethylamine, 12: lactose,
DC: đối chứng âm.
4.2.5. Bộ thử nghiệm IDS 14GRN
Từ các chủng vi khuẩn đại diện cho nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa

để có thể khảo sát đầy đủ hơn một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của bốn chủng vi
khuẩn chúng tôi tiến hành dùng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm
để khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác. Kết quả bộ thử nghiệm định danh
IDS 14GNR được tóm tắt trên bảng 4.4
Bảng 4.4: Kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS14GNR.

LM2
DS7
DS15
DN10
Oxydase
+
+
+
+
ONPG
–
–
+
–
Nitrate
–
–
–
–
Citrate
+
–
+
+

Indole
+
+
+
+
PAD
–
–
–
–
Malonate
–
–
–
–
LDC
+
+
+
+
Di động
+
+
+
+
Glucose
–
–
–
+

46
Esculin
–
–
–
–
Urease
+
+
–
+
H
2
S
–
–
–
–
VP
–
–
+
–

4.2.6. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của vi
khuẩn
Hình 4.4: Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào.
Các chủng trong thí nghiệm đều có khả năng tăng trưởng tốt trên môi trường trong

khoảng nhiệt độ biến thiên từ 20 – 30
0
C. Trong đó, nhiệt độ tối ưu cho ba chủng LM2,
TS7, TD15 là 25
0
C và chủng TN10 là 30
0
C. kết quả này phù hợp với nghiên cứu của
Green và ctv (1992), [34]. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của các dòng vi
khuẩn được biểu diễn trên hình
Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của vi khuẩn.
y = 1.2566x + 7.165
R
2
= 0.9814
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
OD
log (N/ml)


47

Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của vi khuẩn.
Trong khi đó, từ biểu đồ (hình 4.6) chúng tôi nhận thấy rằng các chủng đều có thể tăng
trưởng tốt trong khoảng pH 5,0 – 7.5, tối ưu trong khoảng 6,5 – 7. Chủng TS7 có thể
tăng trưởng trong khoảng pH từ aicd đến trung tính. Ngược lai, chủng TD15 lại có thể
tăng trưởng trong khoảng pH từ acid đến pH hơi kiềm.
4.2.7. Đƣờng cong tăng trƣởng
Dựa vào đường cong tăng trưởng (Hình 4.7)chúng tôi nhận thấy rằng các chủng tăng
trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy. Và theo Green và ctv (1992), thì vi khuẩn
thuộc chi Methylobacterium tăng trưởng chậm. Thời gian để vi khuẩn tăng trưởng tới
pha ổn định có thay đổi giữa các dòng vi khuẩn. Dòng LM2 là 32 giờ, dòng TS7 là 40
giờ, dòng TN10 là 44 giờ và dòng TD15 là 36 giờ. Từ những dữ liệu này chúng tôi cho
rằng thời gian tốt nhất để thu hoạch tế bào là sau 24 giờ.








48
Hình 4.7: Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn.
Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng được tóm tắt trong bảng 4.4
Bảng 4.4: Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn.

LM2
TS7

TN10
TD15
Acetate
+
-
-
+
Arabinose
-
-
+
+
Betaine
+
+
-
-
Catalase
+
+
+
+
Citrate
+
-
+
+
Di dộng
+
+

+
+
Esculine
-
-
-
-
Ethanol
+
-
+
-
Fructose
-
+
+
-
Glucose
-
-
+
-
Glutamate
-
+
+
-
H
2
S

-
-
-
-
Indole
+
+
+
+
Lactose
-
-
-
+


49
LDC
+
+
+
+
Malonate
+
+
+
+
Maltose
+
+

+
+
Manitol
+
+
+
+
Methylamine
+
-
-
-
Nitrate
-
-
-
-
Oxidase
+
+
+
+
PAD
-
-
-
-
Serbacate
-
-

+
-
Sucrose
+
+
+
+
Trimethylamine
-
-
+
-
Urea
+
+
-
+
Kích thước khuẩn
lạc
1 – 3mm
1 – 3mm
1 - 3mm
2 – 5mm
Kích thước tế bào
0,99-1,45µm
0,99-1,98µm
0,99-2,19µm
1,32-2,64µm
Màu sắc khuẩn lạc
Pl

Pl
Pr
P
Hình dạng khuẩn lạc
Tròn, lồi
Tròn, lồi
Tròn, lồi
Tròn, lồi
Nhiệt độ tối ưu (t
0
C)
25
25
30
25
pH tối ưu
6,5
6,5
6,5
6,5
Gram
biến đổi
Âm
biến đổi
Âm
Chú thích: +: có sử dụng hay dương tính, -: không sử dụng hoặc âm tính, Pl: hồng
nhạt, P: hồng, Pr: hồng đỏ.
4.3. Định danh vi khuẩn
4.3.1. Hệ số tƣơng đồng di truyền-Jaccard.
Bảng 4.5: Hệ số tương đồng Jaccard từ 0 – 1 của các loài.

Thứ tự
Loài
LM2
TS7
TN10
TD15
01
M. aminovorans
0,600
0,600
0,400
0,400
02
M. aquaticum
0,333
0,667
0,667
0,167
03
M. chloromethanicum
0,889
0,556
0,222
0,667
04
M. dichloromethanicum
0,778
0,545
0,273
0,364

05
M. extorquens
0,750
0,583
0,167
0,500


50
06
M. fujisawaense
0,333
0,333
0,667
0,583
07
M. hispanicum
0,667
0,667
0,667
0,333
08
M. isbiliense
0,833
0,500
0,500
0,667
09
M. lusitanum
0,727

0,545
0,273
0,727
10
M. mesophilicum
0,333
0,333
0,667
0,417
11
M. nodulans
0,667
0,333
0,500
0,667
12
M. organophilum
0,455
0,545
0,455
0,455
13
M. populi
0,667
0,667
0,333
0,500
14
M. radiotolerans
0,500

0,333
0,583
0,500
15
M. rhodesianum
0,727
0,636
0,273
0,545
16
M. rhodinum
0,545
0,455
0,636
0,545
17
M. suomiense
0,727
0,545
0,273
0,545
18
M. thiocynatum
0,400
0,333
0,500
0,500
19
M. variabile
0,333

0,667
0,667
0,167
20
M. zatmanii
0,667
0,583
0,333
0,667
21
1019
0,462
0,385
0,769
0,385
22
LM2
1,000
0,615
0,615
0,615
23
TS7
0,615
1,000
0,462
0,462
24
TN10
0,615

0,642
1,000
0,385
25
TD15
0,615
0,642
0,385
1,000
Từ hệ số tương đồng Jaccard chúng tôi có thể kết luận rằng chủng TS7 có quan hệ gần
với bốn loài: M. variabile, M. populi, M. hispanicum và M. aquaticum. Chủng TD15
có quan hệ gần với loài M. hispanicum. Chủng LM2 rất có thể thuộc loài M.
chloromethanicum. Chủng TN10 có quan hệ gần với chủng 1019, loài M. variabile,
M. fujisawaense, M. aquaticum, M. hispanicum. M. mesophilicum. Tuy nhiên, kết quả
định danh dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chưa thể định danh chính xác các
chủng có thuộc chi Methylobacterium hay không và phương pháp định danh bằng sinh
lý, sinh hóa cũng không thể định danh các dòng vi khuẩn đã phân lập thuộc loài nào.
Nên việc định danh vi khuẩn đã phân lập bằng các kỹ thuật sinh học phân tử là rất cần
thiết.




51
300 base
234 base
4.3.2. Kết quả PCR
4.3.2.1. Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium
Khi khuếch đại DNA bộ gen bằng cặp mồi 2R và 2F các chủng điều tạo ra đoạn
DNA đăc trưng khoảng 234base. Trong khi đó, theo nghiên cứu của Nishio và ctv

(1997), [68] cho rằng cặp mồi 2F và 2R cho kết quả dương tính với 7 chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. Ngoài ra, ở chủng E.coli đối chứng âm không có đoạn DNA đặc
trưng. Từ đó, chúng tôi có thể kết luận rằng các chủng đã phân lập thuộc chi
Methylobacterium.
Hình 4.8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R
Chú thích: 1: E.coli, 2: LM2, 3: TS7, 4: TN10, 5: TD15, M: thang chuẩn
(Ladder).
4.3.2.2. Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn
Do kết quả đoạn DNA đặc trưng chỉ có thể định danh các dòng vi khuẩn có
thuộc chi Methylobacterium hay không, mà không cho kết quả định danh đến mức độ
loài. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn của vi khuẩn
bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 [9]. Tuy nhiên, cặp mồi này tạo ra trình tự tương
đối lớn gây khó khăn cho quá trình giải trình tự, nên chúng tôi sử dụng phối hợp với
cặp mồi 2F và 2R sản phẩm tạo ra là hai đoạn khoảng 500base và 1200base (hình 4.9).


52
1200 base
500 base

Chú thích: 1: LM2, 2: TS7, 3: TN10, 4: TD15, M: Ladder (Thang DNA chuẩn).
Hình 4.9: Sản phẩm điện di trên gel với cặp mồi FPGS6 với 2R và
FPGS1509 với 2F.
4.3.3. Kết quả giải trình tự và so sánh độ tƣơng đồng của các chủng với các loài
Methylobacterium đã công bố.
Kết quả giải trình tự được xác định độ chính xác bằng phần mềm fastPCR. Kết
quả cho thấy rằng trong các mẫu giải trình tự chỉ có hai mẫu chính xác ở mức tinh cậy
được là đoạn DNA 500base của mẫu LM2 và TN10, còn các mẫu còn lại có sự sai sót
đáng kểtrong quá trình giải trình tự do mẫu chưa được tinh sạch. Do đó, chúng tôi chỉ
tiến hành lấy hai trình tự đúng để so sánh với trình tự trên ngân hàng gen của BCBI.

Kết quả so sánh trình tự với dữ lệu trên ngân hàng gene của NCBI (Mỹ).
Bảng 4.6: Hệ số tương đòng Sj của chủng TN10 so với các chủng công bố
Tên loài
Độ tương đồng DNA (%)
Độ tương đồng sinh hóa (Sj)
M. aminovorans
96
0,400
M. chloromethanicum
96
0,222
M. dichlorometanicum
96
0,273
M. extorquens
96
0,167
M. jeotgali
96
N
M. organophilum
96
0,455
M. podarium
96
N


53
M. rhodesianum

96
0,273
M. rhodinum
96
0,636
M. soumiense
96
0,273
M. thiocyanatum
96
0,500
M. zatmanii
96
0,333
1019

0,769
chú thích: Hệ số Sj được tính trong khoảng 0 – 1(0% - 100%), N: không xác định.
Bảng 4.7: Hệ số tương đồng của chủng LM2 với các chủng đã công bố.
Tên loài
Mức độ tương đồng DNA (%)
Độ tương đồng sinh hóa (Sj)
M. aminovorans
99
0,600
M. chloromethanicum
99
0,889
M. dichlorometanicum
99

0,778
M. extorquens
99
0,750
M. fujisawaense
99
0,333
M. jeotgali
99
N
M. lusitanum
99
0,727
M. organophilum
88
0,455
M. podarium
99
N
M. populi
99
0,667
M. radiotolerans
88
0,500
M. rhodesianum
99
0,727
M. rhodinum
99

0,545
M. zatmanii
99
0,667
1019

0,462
Chú thích: hệ số Sj được tính trong khoảng 0 – 1(0% - 100%).


54
Mối quan hệ của trình tự hai chủng so với các chủng trên ngân hàng gen NCBI và của
phòng thí nghiệm được biểu diển trên cây sinh loài được vẽ bằng phần mềm CluxtalX
và Treeview.
Hình 4.10: Cây sinh loài của các chủng trong chi Methylobacterium.
Từ những số liệu so sánh này có thể thấy rằng mức độ tương đồng trình tự giữa
chủng thí nghiệm với chủng đã công bố tương đối lớn. Nên chúng tôi có thể kết luận
chính xác hơn là hai chủng đã giải trình tự đúng thuộc chi Methylobacterium. Chủng
LM2 có quan hệ gần với chủng 1019 và TN10 cả ba chủng này cùng xếp trong cùng
một nhánh lớn với M. thiocyanatum. Kết hợp với độ tương đồng sinh hóa thì chủng
LM2 và chủng 1019 (0,462), chủng TN10 với chủng 1019 (0,769) là tương đối nhỏ.
Nên chúng tôi cho rằng hai chủng LM2 và TN10 khác biệt lớn với chủng 1019 và các
loài Methylobacterium sp. đã công bố nên chúng tôi cho rằng có thể hai chủng LM2 và
TN10 là hai chủng mới Tuy nhiên, những kết luận này chưa chính xác 100% bởi vì
trình tự 500 base chỉ có thể định danh vi khuẩn Methylobacterium tới mức độ chi và
các đặc điểm sinh hóa cũng không thể định danh chính xác đến mức độ loài.



55

4.4. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp các hoạt chất thứ cấp
4.4.1. Kết quả định tính auxin
Kết quả định tính auxin bằng thuốc thử Salkowski cải tiến. Trong bốn chủng
thí nghiệm chỉ có hai chủng TS7 và TN10 có phản ứng dương tính với thuốc thử
Salkowski cải tiến. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), Ivanova và
ctv (2001), một số chủng thuộc chi Methylobacterium có thể tổng hợp auxin. Từ đó có
thể khẳng định rằng hai chủng này có khả năng tổng hợp auxin ở nồng độ đủ phát
hiện, còn hai chủng LM2 và TD15 có thể chúng không thể tổng hợp auxin hoặc nồng
độ auxin tạo ra của hai chủng này không đủ lớn để có thể phản ứng với thuốc thử
Salkowski cải tiến.

Chú thích:
DC1: Đối chứng âm chủng E.coli
DC2: Đối chứng dương IAA chuẩn
Hình 4.11: Kết quả định tính auxin











56

4.4.2. Kết quả định tính PHB.
Trong bốn chủng đã thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với thuốc thử Nile

Blue A. Trong khi đó, theo Trâm (2006) [8], thì các chủng thuộc chi
Methylobacterium có khả năng tổng hợp PHB. Từ kết quả này chúng tôi có thể kết
luận rằng, tất cả các chủng đã thử nghiệm có khả năng tổng hợp PHB. Với các hạt
sáng khác nhau chúng tôi cũng có thể khẳng định rằng các chủng có thể tổng hợp PHB
ở nồng độ khác nhau.

Chú thích: DC: Mẫu đối chứng chủng E.coli.
Hình 4.12: Sự phát sáng của các hạt PHB dưới kính hiển vi huỳnh quang.













57
Phần V: Kết luận và đề nghị
Sau thời gian nghiên cứu mặc dù có nhiều cố gắng. Tuy nhiên, do thời gian tiến hành
có giới hạn nên chúng tôi chỉ đạt được một số kết quả nhất định và những kết quả này
chỉ là kết quả bước đầu. Các kết quả đạt được:
- Phân lập và làm thuần và khảo sát được các đặc điểm sinh lý, sinh hóa tổng số
26 khuẩn lạc, trong đó chia thành bốn nhóm theo các đặc điểm sinh lý,sinh hoá.
- Đã định danh được các chủng thuộc chi Methylobacterium bằng các phương
pháp Sinh học Phân tử. Trong đó, có hai chủng TS7 và TD15 chỉ định danh

được ở mức độ có đoạn DNA đặc trưng và hai chủng LM2 và TN10 định danh
được tới mức độ so sánh trình tự đoạn DNA 500base trong vùng 16S rDNA.
- Khảo sát được khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn.
Trong đó, bốn chủng đều có khả năng tổng hợp PHB và có hai chủng LM2 và
TN10 có khả năng tổng hợp auxin là TS7 và TN10.
Từ những kết quả đó chúng tôi có những đề nghị sau:
Cần tiến hành giải trình tự lại đoạn 1200 base của hai chủng trên cũng như các
chủng đã giải sai để có thể định danh chính xác hơn đến mức độ loài.
Định lượng lượng PHB tạo ra là bao nhiêu để có thể ứng dụng trong thực tế.
Kiểm tra khả năng tổng hợp auxin, cytokinins, khả năng kích thích sự nẩy mầm
của hạt, khả năng kích thích sinh trưởng của thực vật ở điều kiện in vivo cũng như
trong điều kiện in vitro của các loài thuộc chi Methylobacterium trên để có thể ứng
dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp, sử dụng làm nguyên liệu trong
nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác.

58
Phần V: Tài liệu tham khảo
Tài liệu tiếng việt
[1] Bùi Huy Đáp. Một số vấn đề về cây lúa, NXB Nông Nghiệp, 1999.
[2] Trƣơng Đức. Kỹ thuật trồng các giống lúa mới, NXB Nông Nghiệp, 2000
[3] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. Vi sinh vật
học, NXB giáo dục 1998
[4] Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng, Huỳnh Lê Tâm. Sổ tay kiểm
nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, NXB nông nghiệp Hà Nội 2005.
[5] Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu. Sinh học phân tử giới thiệu phương
pháp và ứng dụng. NXB Nông Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 2005.
[6] Trần Linh Thƣớc, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phƣợng Trang,
Phạm Thị Hồng Tƣơi. Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại Học Quốc Gia
thành phố Hồ Chí Minh, 2001.
[7] Lê Duy Linh, Trần Thị Hƣờng, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng.
Thực tập vi sinh cơ sở. NXB Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh.
2001.
[8] Lê Thị Thuỳ Trâm. 2006. Nghiên cứu thu nhận nhựa phân huỹ sinh học
poly- -hydroxybutyrate (PHB) từ vi khuẩn Methylobacterium sp. phân
lập tại Việt Nam luận văn thạc sĩ sinh hóa, Đại Học Khoa Hoc Tự Nhiên.
Tài liệu tiếng nước ngoài.
[9] Abdoulaye Sy, Giraud E., Jourand P., Garcia N., Willems A., De
Lajudie P., Prin Y., Neyra M., Gillis M., Boivin-Masson C., Dreyfus
B. (2001). “Methylotrophic Methylobacterium bacteria nodulate and fix
nitrogen in symbiosis with legumes”, Journal of Bacteriology, Vol. 183,
No. 1, pp. 214–220.
[10] Ackermann J U., Müller S., Lösche A., Bley T., Babel W. (1995).
“Methylobacterium rhodesianum cells tend to double the DNA content
under growth limitations and accumulate PHB”, Journal of
Biotechnology, Vol. 39, pp. 9-20.

[11] Anesti V., McDonald I. R., Ramaswamy M., Wade W. G., Kelly D. P.,
Wood A. P. (2005). “Isolation and molecular detction of Methylotrophic


59
bacteria occurring in the human mouth”, Enviromental Microbiology, Vil.
7, No. 8, pp. 1227-1238.
[12] Anesti V., Vohra J., Goonetilleka S., McDonald I. R., Str bler B.,
Stackebrandt E., Kelly D. P., Wood Ann P. (2004). “Molecular
detection and isolation of facutatively methylotrophic bacteria, including
Methylobacterium podarium sp. nov., from the human foot microflora”,
Environmental Microbiology, Vol. 6, Iss. 8, pp. 820-830.
[13] Arauujo W. L., Maccheroni W. Jr., Aguilar-Vildoso C. I., Barroso P.
A. V., Saridakis H. O., Azevedo J. L. (2001). “Variability and
interractions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf
tissues of citrus rootstocks”, Cannada Journal Microbiol, Vol. 47, pp.
220-236.
[14] Arauujo W. L., Marcon J., Maccheroni W. Jr., Van Elsas J. D., Van
Vuurde J. W. L., Azevedo J. L. (2002), “Diversity of endophytic
bacterial populations and their interaction with Xyllella fastidiosa in
citrus plants”, Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 68, No. 10,
pp. 4906-4914.
[15] Arthi K., Appalaraju B., Parvathi S. (2003). “Vancomycin sensitivity
and KOH string test as an alternative to gram staining of bacteria”, India
Journal of Medical Microbiology, Vol. 21, pp. 121-123.
[16] Axel Ehmann (1977). “The van urk-salkowski reagent - a sensitive and
specific chromogenic reagent for silica gel thin-layer chromatographic
detection and identification of indole derivatives”, Journal of
Chromatography, Vol. 132, pp. 267-276.
[17] Aziz. N.H, El-Fouly. M.Z, El-Essawy. A.A, and Khalaf. M.A. Influence

of bean seadling root exudates on the rhizophere colonization by
Trichoderma lignorum for the control of Rhizoctonia solani. Bot. Bull.
Acad. Sin. 1997, 38: 33 – 39.
[18] Benchimol R., Chu E., Yuimuto R., Dias-Filho M. B. (2000).
“Fusariosis control in black perper plants with bacterial endophytes
survival and morphophylogical responses”, Pesq. Agropec. Bras.,
Brasília, Vol. 35, No. 7, pp. 1343-1348.


60
[19] Bloemberg, G. V., and Lugtenberg, B. J. J. 2001. Molecular basis of
plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria. Plant Biol.
4:343-350.
[20] Chistoserdova L., Chen S W., Lapidus A., Lidstrom M. E., (2003).
“Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AM1from a genomic
point of view”, Journal of Bacteriology, Vol. 185, No. 10, pp. 2980-2987.
[21] Chistoserdova L., Jenkins C., Kalyuzhnaya M. G., Marx C. J.,
Lapidus A., Vorholt J. A., Staley J. T., Lidstrom M. E. (2004). “The
enigmatic planctomycetes may hold a key to the origins of
Methanogenesis and Methylotrophy”, Molecular Biology ang Evolution,
Vol. 21, No. 7, pp. 1234-1241.
[22] De Marco P., Pacheco C. C., Figueiredo A. R., Moradas-Ferreira P.
(2004). “Novel pollutant-resistant methylotrophic bacteria for use in
bioremediation”, FEMS Microbiology Letters, Vol. 234, pp. 75-80.
[23] Department of health and ageing office of the gene technology
regulator. 2005. The biology and ecology of rice (Oryza sativa L.) in
Australia.
[24] Doronina N. V., Ivanova E. G., and Trotsenko Yu. A. (2002a). “New
evidence for the ability of Methylobacteria and Methanotrophs to
synthesize auxin”, Microbiology, Vol. 71, No. 1, pp. 116–118. Translated

from Mikrobiologiya, Vol. 71, No. 1, pp. 130–132.
[25] Doronina N. V., Trotsenko Y. A., Kuzentsov B. B., Tourova T. P.,
Salkinoja-Salonen M. S. (2002b). “Methylobacterium suomiense sp. nov.
and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented,
facultatively methylotrophic bacteria”, International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 52, pp. 773-776.
[26] Farah Ahmad, Iqbal Ahmad, Mohd Saghir Khan. Indole Acetic Acid
Production by the Indigenous Isolates of Azotobacter and Fluorescent
Pseudomonasin the Presence and Absence of TryptophanFarah.
Department of Agricultural Microbiology, Faculty of Agricultural
Sciences, Aligarh Muslim University, 2002.


61
[27] Figueira M. M., Larameùe L., Murrell J. C., Groleau D., Miguez C.
B. (2000). “Production of green fluorescent protein by the methylotrophic
bacterium Methylobacterium extorquens”, FEMS Microbiology Letters,
Vol. 193, pp. 195-200.
[28] Fournier D., Trott S., Hawari J. and Spain J. Metabolism of the
Aliphatic Nitramine 4-Nitro-2,4-Diazabutanal by Methylobacterium sp.
Strain JS179. Applied And Environmental Microbiology, Aug 2005, p.
4199 – 4202.
[29] Gallego V., García M.T., Ventosa A. (2005c). “Methylobacterium
isbiliense sp. nov., isolated from the drinking water system of Sevilla,
Spain”, International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, Vol. 55, pp. 2333-2337.
[30] Gallego V., García T. M.,Ventosa A. (2005a). “Methylobacterium
hispanicum sp. nov. and Methylobacterium aquaticum sp. nov., isolated
from drinking water”, International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp. 281-287.

[31] Gallego V., García T. M.,Ventosa A. (2005b). “Methylobacterium
variabile sp. nov., a methylotrophic bacterium isolated from an aquatic
environment”, International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, Vol. 55, pp. 281-287.
[32] Garcia de Salamone I. E., Hynes R. K., Nelson L. M. (2001).
“Cytokinin production by plant growth promoting rhizobacteria and
selected mutants” Canada Journal Microbiology, Vol 47, pp. 404-411.
[33] Glick, B. R. 1995. The enhancement of plant growth by free-living
bacteria. Can. J. Microbiol. 41:109-117.
[34] Green P. N. (1992). “The Genus Methylobacterium”, pp. 2342-2345. In
Balows A., Trüper H. G., Dworkin M., Harder V., Schleifer K. H. (ed.)
The Prokaryote, 2nd ed., Springer-Verlag, Berlin.
[35] Gromovykh. T, Tulpanova V, Shmarlovskaya. S, Gromovykh. V,
Makhova H. Strains of Trichoderma Benefit for Biological Control
Seedlings Pathogens.


62
[36] Hanson R. S., Hanson T. E. (1996). “Methanotrophic Bacteria”,
Microbiological reviews, Vol. 60, No.2: pp: 439-471.
[37] Hiraishi A., Furuhata K., Matsumoto A., Koike K. A., Fukuyama M.
and Tabuchi K. (1995). “Phenotypic and genetic diversity of chrorine-
resistant Methylobacterium strains isolated from various enviroment”,
Applied and Enviromental Microbiobiology, Vol. 61, No. 6, pp. 2099-
2107.
[38] Hirano. S.S., and C. D. Upper. 2000. Bacteria in the leaf cosystem with
emphasis on Pseudomonas syringae: a pathogen, ice nucleus, and
epiphyte. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:624–653.
[39] Holland M. A. (1997) “Are cylokinin produced by plant?”, Plant
Physiology, Vol. 115, pp. 865-868.

[40] Holland M. A., Polacco J. C. (1994). “PPFMs and other covert
contaminants: is there more to plant physiology than just plant?”, Plant
Physiology, Vol. 45, pp. 197-209.
[41] Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H. A., Staley J. T., Williams S. T.
(1994). Bergey’s manual of Determinative bacteriology, Ninth Edition,
The Williams and Willins Company, pp. 88-145.
[42] Hornschuh M., Grotha R., Kutschera U. (2002). “Epiphytic
bacteria associated with the bryophyte Funaria hygrometrica:
effects of Methylobacterium strains on protonema
development”, Plant biol (Stuttg) Vol. 4, pp. 682-687.
[43] Idris R., Trifonova R., Puschenreiter M., Wenzel W. W., Sessitsch A.
(2004). “Bacterial communities associated with flowering plants of Ni
hyperaccumulator Thlaspi goesingense”, Applied and Enviromental
Microbiology , Vol. 70, No. 5, pp. 2667-2677.
[44] Ilan Chet, Ada Viterbo, Yariv Brotman, Tamir Lousky. Enhancement
of plant disease resistance by the biocontrol agent Trichoderma.
[45] Jaftha J. B., Strijdom B. W., Steyn P. L. (2002). “Characterization of
pigmented methylotrophic bacteria which nodulate Lotonosis bainesii”,
Systematic and Applied Microbiology, Vol. 25, pp. 440-449.


63
[46] Jeon J S., Lee S S., Kim H Y., Ahn T S., Song H G. (2003). “Plant
growth promotion in soil by some inoculated microorganisms”, The
Journal of Microbiology, Vol. 41, No. 4, pp. 271-276.
[47] Kalyaeva M. A., Ivanova E. G., Doronina N. V., Zakharchenko N. S.,
Trotsenko Yu. A., Buryanov Ya. I. (2003). “Stimulation of wheat
morphogenesis in vitro by Methanotrophic bacteria” Doklady Biological
Sciences, Vol. 388, pp. 76–78, Translated from Doklady Akademii Nauk,
Vol. 388, No. 6, pp. 847–849.

[48] Kalyaeva M. A., Zacharchenko N. S., Doronina N. V., Rukavtsova E.
B., Ivanova E. G., Alekseeva V. V., Trotsenko Yu. A., Bur’yanov Ya.
I. (2000). “Plant growth and morphogenesis in vitro is promoted by
associative methylotrophic bacteria”, Russian Journal of Plant
Physiology, Vol. 48, No. 4, pp. 514-517. Translated from Fiziologiya
Rastenii, Vol. 48, No. 4, pp. 596-599.
[49] Katircioglu H.,Aslim B.,Yüksekdao Z. N., Mercan N., Beyatli Y.
(2003). “Production of poly-b-hydroxybutyrate (PHB) and differentiation
of putative Bacillus mutant strains by SDS-PAGE of total cell protein”,
African Journal of Biotechnology, Vol. 2, No. 6, pp. 147-149.
[50] Kloepper. J. W., and Schroth. M.N. (1978). Plant growth-promoting
rhizobacteria on radishes. Pages 879-882. Plant Pathogenic Bacter. Vol. 2,
Station de Pathologie Vegetale et Phytobacteriologie, INRA, Angers,
France.
[51] Koenig R. L., Morris R. O., Polacco J. C. (2002). “tRNA is the source
of low-level trans-zeatin production in Methylobacterium spp”, Journal of
bacteriology, Vol. 184, No. 7, pp. 1832-1842.
[52] Korotkova N., Lidstrom M. E. (2001) “Connection between Poly-β-
Hydroxybutyrate biosynthesis and growth on C1 and C2 compounds in
the methylotrop Methylobacterium extorquens AM1”, Journal of
Bacteriology, Vol. 183, No. 3, pp. 1038-1046.
[53] Kutchera U., Koopmann V., Grotha R. (2002). “Plant development in
the absence of epiphytic microorganisms”, Naturwisschaften, Vol. 89, pp.
319-321.


64
[54] Lee J. K., Kim S. Y., Kim S. U., Kim J. H. (2002) “Synthesis of cationic
polysaccharide derivatives and their hypocholesterolaemic capacity”,
Biotechnology Applied Biochemistry, Vol. 35, pp. 181-189.

[55] Lidstrom M. E., Chistoserdova L. (2002). “Plants in the pink: cytokinin
production by Methylobacterium”, Journal of bacteriology, Vol. 184, No.
7, pp. 1818.
[56] Liu Mei, Sun Zong-xiu, Zhu Jei, Xu Tong, Harman Gary E, Lorito
Matteo. Enhancing rice resitance to fungal pathogens by transformation
with cell wall degrading enzyme genes from Trichoderma atroviride.
Journal oj Zhejiang University Science. 2004, 5: 133 – 136)
[57] Long R. L. G. (2000). tRNA is the source of cytokinin secretion by plant-
associated members of the genus Methylobacterium, Ph. D. thesis.
University of Missouri, Columbia
[58] Long R. L. G., Morris R. O., Polacco J. C. (2002). “tRNA is the source
of low-level trans-zeatin production in Methylobacterium spp.”, Journal
of Bacteriology, Vol. 184, No. 7, pp. 1832-1842.
[59] Madhaiyan M., Ponguzhali S., Senthilkumar M., Seshdri S., Chung
H., Yang J., Sundaram S, SA T. (2004). “Growth promotion and
induction of systemic resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza sativa L.)
by Methylobacterium spp.” Bot. Bull. Acad. Sin., Vol. 45, pp. 315-324.
[60] Madhaiyan M., Poonguzhali S., Sundaram S.P., Tongmin Sa. A new
insight into foliar applied methanol influencing phylloplane
methylotrophic dynamics ang growth promotion of cotton (Gossypium
hirsutum L.) and sugarcane (Saccharum officinarum L.). Environmental
and Experimental Botany. 2005.
[61] Maliti C. M. (2000). Physiological and biochemical effects of
Methylobacterium sp. strains and foliar-applied methanol on growth and
development of rice Oryza sativa L, Ph. D. thesis, The city University of
New York, USA.
[62] Mantelin S., Touraine B. (2003). “Plant growth-promoting bacteria and
nitrate availability: impacts on root development and nitrate uptake”,
Journal of Experimental Botany, Vol. 55, No. 394, pp. 27-34.

65
[63] McDonald I. R., Doronina N. V., Trotsenko Y. A., McAnulla C. and
Murrel J. C. (2001). “Hyphomicrobium chloromethanicum sp. nov. and
Methylobacterium chloromethanicum sp. now, chloromethane-utilizing
bacteria isolate from a polluted enviroment”, International Journal of
Systemmatic and Evolutionary Microbiology, Vol. 51, pp. 119-122.
[64] McDonald I. R., Warner K. L., McAnulla C., Woodall C. A.,
Oremland R. S., Murrell J. C. (2002). “A review of bacteria methyl
hadide degradation: biochemistry, geneties and molecular ecology”,
Enviromental Microbiology, Vol. 4, No. 4, pp. 193-203.
[65] Mercan N., Aslime B., Yuksekdag Z.N., Beyatli Y., Production of Poly-
-Hydroxybutyrate (PHB) by Some Rhizobium Bacteria. Turk J Biol.
26 (2002) 215-219.
[66] Nelson. L.M. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR): Prospects
for New Inoculants. Okanagan University College. Published 1 March
2004.
[67] Nester E. W., Anderson D. G., Roberts C. E., Pearsall N., Nester M.
T. (2001). Microbiology a human perspecttine, third edition, Mc Graw
Hill Publisher, 820p.
[68] Nishio T., Yoshikura T., Itoh H. (1997). “Detection of
Methylobacterium species by 16S rRNA gene- targeted PCR”, Applied
and Environmental Microbiology, Vol. 63, No. 4, pp. 1594-1597
[69] Nogueira F., Botelho M. L,, Tenreiro R. (1998). “Radioresistance
studies in Methylobacterium spp.”, Radiat. Phys. Chem Vol. 52. No. 6,
pp. 15-19.
[70] Norbert C. A. de Ruijter, Ton Bisseling and Anne Mie C. Emons.
Rhizobium Nod Factors Induce an Increasein Sub-apical Fine Bundles of
Actin Filamentsin Vicia sativa Root Hairs within Minutes, MPMI Vol. 12,
No. 9, 1999, pp. 829-832.

[71] Omer Z. S., Tombolini R., Broberg A., Gerhardson B. (2004a).
“Indole-3-acetic acid production by pink-pigmented facultative
methylotrophic bacteria”, Plant Growth Regulation, Vol. 43, pp. 93-96.


66
[72] Omer Z. S., Tombolini R., Gerhardson B. (2004b). “Plant colonization
by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria (PPFMs)”, FEMS
Microbiology Ecology, Vol. 47, pp. 319-326.
[73] Patten C. L., Glick B. R. (2002). “Role of Pseudomonas putida
indoleacetic acid in development of the host plant root system”, Applied
and Environmental Microbiology, Vol. 68, No. 8, pp. 3795-3801.
[74] Persello-Cartieaux. F., Nussaume. L., and Robaglia, C. 2003. Tales
from the underground: Molecular plant-rhizobacteria interactions. Plant
Cell Environ. 26:189-199. 2004
[75] Picard C., Ponsonnet C., Paget E., Nesme X., Simonet P. (1992).
“Detection and enumerration of bateria in siol by direct DNA extraction
and polymerase chain reaction” Applied and Environmental Microbiology,
Vol. 58, No. 9, pp. 2717-2722.
[76] Pirttilä A. M., Laukkanen H., Pospiech H., Myllulä R., Hohtola A.
(2000). “Detection of intracellular bacteria in the bud of Scotch pine
(Pinus sylvestris L.) by in situ hybridization”, Applied and Environmental
Microbiology, Vol. 66, No. 7, pp. 3073-3077.
[77] Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (1996). Microbiology, third
Edition, Wm. C. Brown Publisher, printted in the USA, pp. 380-395.
[78] Rogers S. O., Bendich A. J. (1994). “Extraction of total cellular DNA
from plants, algae and fungi”, Plant Molecular Biology Manual D1, pp. 1-
8.
[79] Romanovskaia V.A., Stoliar S.M., Malashenko I.R., Dodatko T.N.
(2001). “Processes of plant colonization by Methylobacterium strains and

some bacterial properties”, Mikrobiologiia, Vol. 70, No. 2, Abstract.
PMID: 1138606 [PubMed-indexed for MEDLINE]
[80] Romanovskaya V. A. (1991). “Taxonomy of methylotrophic bateria”,
Biotechnology, Vol. 18, pp. 3-23.
[81] Romanovskaya V. A., Rokitko P. V., Shilin S. O., Chernaya N. A.,
Malashenko Yu. R. (2004). “Indentification of Methylobacterium strains
using sequence analysis of 16S rRNA genes”. Microbiology, Vol. 73, No.
6, pp. 729-731.


67
[82] Roumagnac P., Gagnevin L., Garden L., Sutra L.,Manceau C.,
Dickstein E. R., Jones J. B., Rott P. and Pryvost O. (2004). “Polyphasic
characterization of Xanthomomads isolated from onion, garlic and Welsh
onion (Allium spp.) and their relatedness to different Xanthomonas
species”, International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, Vol 54, pp. 14-24.
[83] Sanders. J. W., Martin J. W., Hooke M., Hooke J. (2000).
“Methylobacterrium mesophylicum injection: case report and literature
review of an unusual opportunistic pathogen”, Clinical Infectious
Diseases, Vol. 30, pp. 936-938.
[84] Sato K., Ueda S., Shimizu S., (1977). “Form of vitamine B
12
and its
rolein a methanol utilizing bacterium, Protaminobacter ruber”, Applied
and Enviromental Microbiology, Vol. 33, No. 3, pp. 515-521.
[85] Song J., Lee S C., Kang J W., Beak H J., Suh J W. (2004).
“Phylogenetic analysis of Streptomyces spp. isolated from potato scab
lesions in Korea on basis of 16S rRNA gen and 16S-23S rRNA internally
transceibed spacer sequences”, International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology, Vol. 54, pp. 203-209.
[86] Stocks P. K., McCleskey C. S. (1964). “Identity of the pink-pigmented
methanol-oxidizingbacteria as Vibrio extorquens” Journal of
Bacteriology, Vol. 88, No. 4, pp. 1065-1070.
[87] Tejera1. N, Lluch. C, Martinez-Toledo. M.V and Gonzalez-Lopez. J.
Isolation and characterization of Azotobacter and Azospirillum strains
from the sugarcane rhizosphere, Plant and Soil (2005) 270: 223–232 ].
[88] Van Aken B., Peres C. M., Doty S. L., Yoon J. M., Schnoor J. L.
(2004a). “Methylobacterium populi sp. nov., a novel aerobic, pink-
pigmented, facultatively methylotrophic, methane-utilizing bacterium
isolated from poplar trees (Populus deltoides x nigra DN34)”, Abstract.
Journal of Clinial Microbiology Online
[89] Van Aken B., Yoon J. M., and Schnoor J. L. (2004b). “Biodegradation
of nitro-substituted explosives 2,4,6-trinitrotoluene, hexahydro-1,3,5-
trinitro-1,3,5-triazine, and octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5-tetrazocine