Luận văn : Xác định các thành phần chủ yếu trong cà phê nhân, tạo chế phẩm Biocoffee-1 với hoạt tính cao của pectinase và cellulase part 6 pdf

66
Sau khi đo được mật độ quang (OD) ở bước sóng 540 nm, dựa vào đường
chuẩn glucose để suy ra lượng đường khử trong mẫu.
e. Xác định hàm lƣợng tinh bột [16]
(Sử dụng phương pháp thủy phân bằng acid)
Nguyên tắc
Dưới tác dụng của acid, tinh bột bị thủy phân tạo thành glucose. Xác định lượng
glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 ta được hàm lượng tinh bột.
(C
6
H
10
O
5
)
n
+ nH
2
O  nC
6
H
12
O
6

162,1 18,02 180,12
Hệ số
9,0
12,180
1,162
F

Cách tiến hành
Cân 200 – 250 mg mẫu (đã nghiền nhỏ và biết rõ độ ẩm) cho vào bình cầu 100 ml

Thêm 50 ml nước cất, lắc đều, giữ yên 30 – 45 phút

Lọc bỏ nước lọc để loại bỏ đường tan

Rửa tinh bột bằng nước cất 2 – 3 lần, chọc thủng giấy lọc và dùng 25 ml
dung dịch HCl 5% chuyển tinh bột vào bình cầu

Lắp ống làm lạnh hồi lưu, đun cách thủy hỗn hợp 3 – 5 giờ
Kiểm tra sự thủy phân hoàn toàn
của tinh bột bằng dung dịch Iod
Làm nguội, trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến pH = 5,6 – 6,0

Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 ml, kết tủa protein bằng dung dịch
chì acetate 10%, dùng Na
2
HPO
4
bão hòa loại bỏ chì acetate

Thêm nước cất tới vạch mức, lắc đều và lọc

Định lượng đường glucose theo phương pháp DNS
67
f. Định lƣợng Nitơ tổng và protein thô [24]
(Sử dụng phương pháp Kjeldahl)
Nguyên tắc

Dưới tác dụng của H
2
SO
4
đậm đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nitơ bị
phân hủy và bị oxi hóa đến CO
2
và H
2
O, còn nitơ chuyển thành NH
3
và tiếp tục kết
hợp với H
2
SO
4
tạo thành muối (NH
4
)
2
SO
4
tan trong dung dịch. Đuổi NH
3
ra khỏi dung
dịch bằng NaOH, đồng thời cất và thu NH
3
bằng một lượng dư H
2
SO

4
0,1N. Định
phân lượng H
2
SO
4
còn lại bằng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn, sau đó định lượng nitơ
có trong mẫu thí nghiệm.
Cách tiến hành
Bƣớc 1: Vô cơ hóa mẫu (tiến hành trong tủ hút để tránh khí độc SO
2
, CO
2
)
Lấy 0,5 g mẫu đã xay nhỏ

Thêm chất xúc tác acid perchloric HClO
4


Đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào
(chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã chuyển hoàn toàn sang lỏng)
Thỉnh thoảng lắc nhẹ và tráng khéo
để không còn mẫu sót lại trên thành bình
Đun đến khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng

Bƣớc 2: Cất đạm (tiến hành trong máy cất đạm bán tự động GERHARDT)
Chuyển toàn bộ dung dịch sau khi đã vô cơ hóa xong ở bình Kjeldahl vào bình
định mức 100 ml

Thêm nước cất đến vạch (chú ý phải làm lạnh và lắc thật đều)

Cho vào erlen 10 ml dung dịch H
2
SO
4
0,1N và lắp vào máy

Lấy 10 ml dung dịch thí nghiệm từ bình định mức
cho vào ống phản ứng và lắp vào hệ thống

68
Bƣớc 3: Định phân
Lấy erlen ra khỏi máy sau khi đã tráng nước cất để lấy hết mẫu bám trên ống.
Cho 10 giọt phenolphtalein vào bình và định phân bằng NaOH 0,1N.
Bƣớc 4: Định hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,1N
Lấy 10 ml H
2
SO
4
0,1N vào erlen, định phân bằng NaOH 0,1N.
Tính nồng độ thực tế và nồng độ tính toán của NaOH.
Tính kết quả
Lượng đạm có trong mẫu cà phê được tính theo công thức:
0,510
1001000,0014bT)(a
x

Trong đó:
x: Phần trăm nitơ có trong mẫu nghiên cứu

a: Số ml H
2
SO
4
0,1N đem hấp thụ NH
3

b: Số ml NaOH 0,1N tiêu tốn cho chuẩn độ
0,5: Lượng mẫu cà phê đem thí nghiệm
0,0014: Lượng nitơ ứng với 1 ml H
2
SO
4
0,1N
T: Hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,1N
 Tính hàm lƣợng protein thô
Nitơ trong vật liệu chủ yếu là nitơ protein, ngoài ra còn có một lượng nhỏ nitơ
trong các thành phần khác gọi là nitơ phi protein.
Nitơ tổng = nitơ protein + nitơ phi protein
Hàm lượng nitơ trong các vật liệu sinh học được tính bằng cách nhân hàm
lượng nitơ protein với một hệ số chuyển đổi xác định (do hàm lượng nitơ có tỉ lệ ổn
định từ 15 – 18% protein), đại đa số là 16%.
Trong các nguyên liệu sinh học, do hàm lượng nitơ phi protein nhỏ và việc tách
riêng rất phức tạp nên theo qui ước, người ta tính hàm lượng protein theo nitơ tổng và
gọi là protein tổng (hay protein thô).
Công thức tính hàm lượng phần trăm protein thô có trong đại đa số các nguyên
liệu là:
Protein (%) = Nitơ (%)
x
6,25

Riêng ngũ cốc và đậu có hệ số chuyển đổi là 5,7.
Sữa có hệ số chuyển đổi là 6,38.
69
g. Xác định hàm lƣợng tro và tổng hữu cơ [1], [9]

Tro hóa và xác định tổng lƣợng tro
Cân chính xác 4 g mẫu cà phê

Cho vào chén sứ đã biết trọng lượng khô tuyệt đối

Thêm vào 5 giọt HNO
3
đậm đặc và vài giọt H
2
O
2
30%

Cho vào lò nung ở 550
o
C đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng như tàn thuốc lá

Cho ngay chén sứ vào bình hút ẩm, để nguội và cân chính xác

Lặp lại đến khi trọng lượng không đổi

Tổng lượng tro được tính như sau:
Tổng lƣợng tro =
b
100a

(%)
Trong đó:
a: Trọng lượng tro (g)
b: Trọng lượng mẫu khô (g)
100: Hệ số chuyển đổi thành %

Xác định tổng hữu cơ
Cấu trúc hữu cơ của sinh vật dễ bị phá hủy bởi các tác nhân kiềm hay acid
mạnh có tính oxi hóa và ở nhiệt độ cao.
Các chất hữu cơ bị oxi hóa hoàn toàn chuyển thành CO
2
và H
2
O bay ra khỏi
chén sứ, chỉ còn lại một ít khoáng chất trong chén sứ.
Vì vậy, cách tính tổng hữu cơ như sau:

Tổng hữu cơ (%) = 100% – tổng lƣợng tro (%)

70
3.3.4. Phƣơng pháp ly trích enzyme

Cân 1 g chế phẩm

Nghiền nát với thủy tinh vỡ

Ly trích bằng 6 ml dung dịch NaCl 0,3%

Ly tâm (5000 – 6000 vòng trong 10 phút)

Thu được dịch trích enzyme thô

Pha loãng với dung dịch NaCl 0,3%

Định mức 100 ml

Thu dịch enzyme 1%

3.3.5. Phƣơng pháp thiết kế thí nghiệm
3.3.5.1. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ cơ chất (bột mì và bột sắn) đến quá
trình sinh tổng hợp hai loại enzyme pectinase và cellulase
Cố định thời gian nuôi cấy là 48 giờ.
Sau khi chuyển môi trường cám gạo vào môi trường chế phẩm, nuôi cấy trong
48 giờ, sau đó xác định hoạt tính hai enzyme pectinase và cellulase để chọn ra tỷ lệ tối
ưu nhất.
Chúng tôi khảo sát với 7 tỷ lệ (bột mì : bột sắn).
71
Bảng 3.3: Nghiệm thức tỉ lệ cơ chất trong chế phẩm

Tỷ lệ bột mì : bột sắn
%bột mì : %bột sắn
Mẫu 1
0 : 1
0 : 100
Mẫu 2
1 : 3
25 : 75
Mẫu 3
1 : 2
33 : 67 (xấp xỉ)

Mẫu 4
1 : 1
50 : 50
Mẫu 5
2 : 1
67 : 33 (xấp xỉ)
Mẫu 6
3 : 1
75 : 25
Mẫu 7
1 : 0
100 : 0

a. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ trộn đến sinh tổng hợp pectinase
Ly trích enzyme từ 7 mẫu chế phẩm, sau đó tiến hành xác định hoạt tính
pectinase, chọn mẫu tối ưu.
b. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ trộn đến sinh tổng hợp cellulase
Ly trích enzyme từ 7 mẫu chế phẩm, sau đó tiến hành xác định hoạt tính
cellulase, chọn mẫu tối ưu.
3.3.5.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi nấm sợi trong môi trƣờng chế
phẩm đến quá trình sinh tổng hợp hai loại enzyme pectinase và cellulase
Sau khi chọn được tỷ lệ cơ chất bột mì : bột sắn (cho môi trường chế phẩm) tối
ưu cho sinh tổng hợp 2 loại enzyme pectinase và cellulase, chúng tôi cố định tỷ lệ này.
Bước tiếp theo là khảo sát thời gian nuôi nấm sợi thích hợp nhất để thu được pectinase
và cellulase có hoạt tính cao nhất.
Chúng tôi khảo sát 11 mẫu với 11 khoảng thời gian nuôi khác nhau (cách đều
nhau 6 giờ).
72
Bảng 3.4: Nghiệm thức thời gian nuôi nấm mốc tạo chế phẩm

Thời gian nuôi cấy
Mẫu 1
12 giờ
Mẫu 2
18 giờ
Mẫu 3
24 giờ
Mẫu 4
30 giờ
Mẫu 5
36 giờ
Mẫu 6
42 giờ
Mẫu 7
48 giờ
Mẫu 8
54 giờ
Mẫu 9
60 giờ
Mẫu 10
66 giờ
Mẫu 11
72 giờ

a. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi đến sinh tổng hợp pectinase
Ly trích enzyme từ 11 mẫu và xác định hoạt tính pectinase, chọn mẫu tối ưu.
b. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi đến sinh tổng hợp cellulase
Ly trích enzyme từ 11 mẫu và xác định hoạt tính cellulase, chọn mẫu tối ưu.
3.3.5.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian lên men
Sau khi chọn được tỷ lệ cơ chất (bột mì : bột sắn) và thời gian nuôi cấy tối ưu,

chúng tôi tạo 1 mẫu chế phẩm tối ưu và sử dụng để lên men cà phê.
Chúng tôi cố định hàm lượng chế phẩm là 0,1%, tiến hành lên men cà phê với 6
mẫu thí nghiệm (lên men ở 6 khoảng thời gian khác nhau, cách đều 4 giờ).
Bảng 3.5: Nghiệm thức thời gian lên men cà phê

Thời gian lên men
Mẫu 1
12 giờ
Mẫu 2
16 giờ
Mẫu 3
20 giờ
Mẫu 4
24 giờ
Mẫu 5
28 giờ
Mẫu 6
32 giờ
73
Sau khi ngưng quá trình lên men cà phê lần lượt được rửa sạch, rang và xay
mịn. Sau đó, tiến hành trích chất hoà tan và khảo sát các chỉ tiêu.
Trong khóa luận này, khối lượng chất tan được hiểu là khối lượng các chất hòa
tan có trong 10 g cà phê bột sau khi đã trích ly, cô cạn và sấy khô. Độ hòa tan được
hiểu là lượng chất tan trong 50 ml nước và được trích từ 10 g cà phê bột.
a. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ủ đến khả năng trích ly cà phê
Chọn mẫu lên men với thời gian lên men thích hợp nhất, bằng cách chọn mẫu
có khả năng trích ly chất hòa tan cao nhất (thông qua khối lượng chất tan cao nhất).
b. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ủ đến độ hòa tan của cà phê lên men
Chúng tôi khảo sát độ hòa tan bằng dụng cụ đo độ Brix.
c. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ủ đến độ pH của dung dịch chất tan

trích từ cà phê lên men
Đo pH của dung dịch chất tan trích từ cà phê lên men (bằng máy đo pH) trước
khi đem sấy khô.
3.3.5.4. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chế phẩm
Sau khi chọn được thời gian lên men tối ưu, chúng tôi cố định thời gian đó và
tiến hành khảo sát hàm lượng chế phẩm cho vào khối cà phê lên men, với 6 nghiệm
thức (cách đều nhau 0,04%).
Bảng 3.6: Nghiệm thức hàm lƣợng chế phẩm sử dụng lên men cà phê

Hàm lượng chế phẩm (%)
Mẫu 1
0,04
Mẫu 2
0,08
Mẫu 3
0,12
Mẫu 4
0,16
Mẫu 5
0,20
Mẫu 6
0,24

a. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chế phẩm đến khả năng trích ly cà
phê
Chọn mẫu lên men với hàm lượng chế phẩm thích hợp nhất, bằng cách chọn
mẫu có khả năng trích ly chất hòa tan cao nhất (thông qua khối lượng chất tan cao
nhất).
74
b. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chế phẩm đến khả năng tăng độ hòa

tan chất trích cà phê
Đo độ hòa tan bằng dụng cụ đo độ Brix.
c. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chế phẩm đến độ pH của dung dịch
chất tan trích từ cà phê lên men
Đo pH của dung dịch chất tan trích từ cà phê lên men (trước khi sấy).
3.3.5.5. Khảo sát ảnh hƣởng độ ẩm hạt cà phê trƣớc khi lên men lên khả năng
trích ly chất hòa tan
Trước khi lên men, chúng tôi ngâm hạt cà phê trong nước với những khoảng
thời gian khác nhau (cách nhau 0,5 giờ). Sau đó, tiến hành lên men và trích chất hòa
tan.
Những khoảng thời gian ngâm nước khảo sát:
0,5 giờ – 1 giờ – 1,5 giờ – 2 giờ – 2,5 giờ – 3 giờ – 3,5 giờ – 4 giờ
3.3.5.6. Khảo sát sự thay đổi trọng lƣợng khối cà phê trƣớc và sau khi lên men
Với mỗi chỉ tiêu khảo sát, chúng tôi đều cân trọng lượng khối cà phê trước và
sau khi lên men.
Mỗi mẻ lên men, chúng tôi đều sử dụng 100 g cà phê để lên men (trọng lượng
khối cà phê trước khi lên men là 100 g).
3.3.5.7. Khảo sát nhiệt độ khối ủ theo thời gian lên men
Cố định thời gian lên men và hàm lượng chế phẩm tối ưu, tiến hành lên men 1
mẻ cà phê và khảo sát nhiệt độ khối ủ theo thời gian (cách nhau 2 giờ).
3.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Chúng tôi tiến hành xử lý số liệu theo phương pháp trung bình, nghĩa là tiến
hành lặp lại thí nghiệm nhiều lần (ít nhất là 3 lần lặp lại) đến khi thu được các kết quả
khá giống nhau.
Sau đó tiến hành cộng tất cả các số liệu của các lần thí nghiệm chia cho số lần
tiến hành thí nghiệm để có được kết quả trung bình trình bày trong khóa luận.

75
PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 4.1 và 4.2: Cà phê đang đƣợc lên men







Hình 4.3: Cà phê lên men Hình 4.4: Thành phẩm cà phê lên men
đã đƣợc rang đã đƣợc rang và xay thành bột
76
4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BA LOẠI CÀ PHÊ
4.1.1. Hình dạng hạt
Bi: hạt nhỏ nhất trong 3 loại cà phê, hơi tròn, bề mặt nhẵn, màu xanh lục.
Sẻ: hạt to hơn cà phê Bi nhưng nhỏ hơn cà phê Mokka, hạt dài và dẹp hơn
cà phê Bi, bề mặt hạt nhẵn, màu xanh lục.
Mokka: hạt to và dẻo nhất trong 3 loại, màu hơi đen, hơi sần sùi.
4.1.2. Số hạt cà phê trong 100 g
Các số liệu đã được lấy trung bình của 3 lần đếm.
Bi: 675 hạt
Sẻ: 591 hạt
Mokka: 610 hạt
4.1.3. Số hạt đen, hỏng trong 100 g
Các số liệu đã được lấy trung bình của 3 lần đếm.
Bi: 41 hạt
Sẻ: 50 hạt
Mokka: 128 hạt
4.1.4. Kích thƣớc trung bình hạt
Chọn ngẫu nhiên 30 hạt có kích thước tương đồng và phổ biến, đo các kích

thước bằng thước đo kỹ thuật, sau đó lấy kết quả trung bình.
4.1.4.1. Chiều ngang trung bình
Bi: 6,60 mm
Sẻ: 7,31 mm
Mokka: 8,32 mm
4.1.4.2. Chiều dài trung bình
Bi: 8,45 mm
Sẻ: 9,45 mm
Mokka: 10,92 mm
4.1.4.3. Bề dày trung bình
Bi: 5,34 mm
Sẻ: 4,47 mm
Mokka: 4,80 mm
77

Hình 4.5: Đo chiều dài hạt cà phê Bi


Hình 4.6: Đo chiều ngang hạt cà phê Sẻ


Hình 4.7: Đo bề dày hạt cà phê Mokka
78
4.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÀNH PHẦN CHỦ YẾU TRONG CÀ PHÊ NHÂN

Bảng 4.1: Các thành phần chủ yếu có trong cà phê nhân
Thành phần
Tỷ lệ phần trăm (%) so với khối lƣợng
Cà phê Bi
Cà phê Sẻ

Cà phê Mokka
1. Đường tổng số hòa tan
20,95
21,10
25,65
2. Hàm lượng đường khử
2,95
3,00
4,17
3. Hàm lượng pectine
54,71
52,62
55,14
4. Hàm lượng cellulose
15,29
16,80
17,04
5. Hàm lượng tinh bột
-
-
11,29
6. Hàm lượng nitơ
-
-
1,96
7. Hàm lượng protein thô
-
-
12,22
8. Hàm lượng tro

5,00
5,00
5,50
9. Tổng hữu cơ
95,00
95,00
94,50
10. Độ ẩm
7,86
7,26
10,60
(Nguồn từ thực nghiệm)
Nhận xét:
Từ các số liệu thu được, chúng tôi nhận thấy chất hữu cơ là thành phần chủ yếu
trong cà phê nhân. Trong đó hai thành phần pectin và cellulose chiếm một tỉ lệ khá lớn
và chúng là những thành phần rất cứng, bền và khó phân giải. Chính hai thành phần
khó phân giải này làm hạn chế khả năng trích ly các thành phần hòa tan của cà phê. Vì
lí do này mà chúng tôi đặt vấn đề phải tìm ra giải pháp bằng cách ứng dụng công nghệ
lên men và công nghệ enzyme để gia tăng tối đa hiệu suất trích ly của cà phê nhân, từ
đó thu được chất hòa tan cao nhất. Giải pháp này mở ra một tương lai đầy hứa hẹn cho
ngành công nghiệp chế biến cà phê hòa tan và các sản phẩm khác từ cà phê, góp phần
làm phát triển ngành công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong thực
phẩm nói riêng của Việt Nam chúng ta.