Luận văn : Xác định các thành phần chủ yếu trong cà phê nhân, tạo chế phẩm Biocoffee-1 với hoạt tính cao của pectinase và cellulase part 5 doc

53
3.3.2.2. Phƣơng pháp trích chất hòa tan
Phương pháp trích chất hòa tan trong cà phê sau khi lên men:


3.3.2.3. Phƣơng pháp đo kích thƣớc
Dùng thước đo kỹ thuật để đo chiều ngang, chiều dài và bề dày của hạt cà phê.
Cân 10 g cà phê bột
Bổ sung 30 ml nước sôi
Thu lấy dịch lọc
Thêm 20 ml nước sôi
Thu lấy dịch lọc
Sấy khô
Thu chất khô là chất hòa tan
Đem sấy ở nhiệt độ 100 – 105
o
C
Thu chất khô
Cân trọng lượng
Đo pH
Đo độ hòa tan
đun trên bếp
cho vào tủ sấy
Cho vào becher đã xác định trọng lượng
54
3.3.2.4. Phƣơng pháp nghiền
Dùng máy xay để nghiền cà phê (cà phê tươi và cà phê lên men) khi cần lượng
cà phê bột để nghiên cứu.
3.3.2.5. Phƣơng pháp ray
Dùng lưới ray để ray những nguyên vật liệu còn tạp chất hoặc khi cần thu lượng
bột mịn.

3.3.2.6. Phƣơng pháp đếm
Dùng mắt thường để đếm số hạt cà phê, thu nhặt những hạt hư, hỏng và tạp
chất.
3.3.2.7. Phƣơng pháp ngâm
Dùng nước để ngâm cà phê, mục đích là để hạt cà phê đạt được độ ẩm cần thiết.
3.3.3. Phƣơng pháp hóa sinh
3.3.3.1. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme
a. Xác định hoạt tính cellulase [14], [25]
Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thủy phân CMC (Sodium carboxymethyl
cellulose) bằng enzyme ở nhiệt độ 40
o
C và pH 5,0.
Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, lượng đường khử này
sẽ phản ứng với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid).
Sau đó tiến hành đo độ hấp thu OD của dung dịch đường bằng máy đo mật độ
quang ở bước sóng 540 nm.
55
Cách thực hiện
Phản ứng enzyme
Phản ứng thử không

Thêm 1 ml dung dịch CMC vào dung
dịch mẫu

Lắc đều

Ổn nhiệt 40 0.1
o
C trong 10 phút

Thêm 4 ml dung dịch lactose – DNS

Lắc thật kỹ

Dùng nylon bịt kín miệng ống nghiệm

Đặt trong nước sôi 15 phút

Làm nguội bằng nước lạnh

Tiến hành đo OD ( = 540 nm)
(dùng nước cất làm đối chứng)
 A
T


Thêm 4 ml dung dịch lactose – DNS
vào dung dịch mẫu

Lắc đều



Thêm 1 ml dung dịch CMC

Lắc đều

Dùng nylon bịt kín miệng ống nghiệm

Đặt trong nước sôi 15 phút

Làm nguội bằng nước lạnh

Tiến hành đo OD ( = 540 nm)
(dùng nước cất làm đối chứng)
 A
B

1 ml dung dịch mẫu  ổn nhiệt
40 0.1
o
C trong 5 phút
Cơ chất CMC  ổn nhiệt
tương tự


1 ml dung dịch mẫu  ổn nhiệt
40 0.1
o
C trong 5 phút
Cơ chất CMC  ổn nhiệt
tương tự




56
Dựng đƣờng chuẩn glucose
Pha dung dịch glucose 1 mg/ml bằng cách hòa tan 100 mg glucose

monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất
đến vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng dưới đây:
Bảng 3.1: Dựng đƣờng chuẩn glucose
Ống số
0
1
2
3
4
5
6
Nồng độ dung dịch glucose
chuẩn (mg/ml)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
- ml dung dịch glucose 1 mg/ml
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
- ml dung dịch CMC 1%
1

1
1
1
1
1
1
- ml dung dịch lactose-DNS
4
4
4
4
4
4
4
- ml nước cất
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4

Lắc đều các ống nghiệm này

Dán nylon lên miệng ống nghiệm

Đun sôi cách thủy trong 15 phút

Làm lạnh về nhiệt độ phòng

(bằng một chậu nước lạnh)

Đo độ hấp thụ OD ở bước sóng 540 nm  A
G

Ống số 0 là ống đối chứng  A
W

Tính kết quả
Định nghĩa đơn vị hoạt tính
Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra
đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC với vận tốc 1 mol/phút dưới các điều
kiện phản ứng.
57
Tính toán
 Tính hệ số glucose
o Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn bằng hiệu số
A
G
- A
W

o Dựng đồ thị đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD), trục
hoành là nồng dộ glucose (mg/ml).
Hệ số glucose được tính bằng công thức:
WG
G
AA
C
F

Trong đó:
F: Hệ số glucose
C
G
: Nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/ml)
A
G
: Độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn
A
W
: Độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất
o Chia nồng độ (mg/ml) cho độ hấp thu OD của mỗi dung dịch glucose chuẩn
để thu được giá trị hệ số glucose, sau đó tính giá trị hệ số trung bình.
 Xác định hoạt tính enzyme
Hoạt tính CMCase được tính theo công thức sau:

C
1
ml 1
1
phut 10
1
180
1000
F)A(A(UI/g) CMCase
BT


Trong đó:

A
T
: Độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzyme
A
B
: Độ hấp thu OD của phản ứng thử không
F: Hệ số glucose (mg/ml)
1000: Chuyển từ mg sang g
180: Trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ g sang mol
10 phút: Thời gian phản ứng
1 ml: Thể tích dung dịch enzyme
C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml)
58
b. Xác định hoạt tính pectinase [14]
Sử dụng phương pháp so màu, là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh
cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định.
Phương pháp so màu cho phép sai số 5%.
Nguyên tắc
Định lượng acid galacturonic, là sản phẩm của quá trình thủy phân pectin dưới
tác dụng của pectinase không kết tủa bởi ZnSO
4
.
Cách thực hiện
20 ml dung dịch pectin

Cho vào becher 100 ml

Thêm 10 ml dung dịch enzyme 1%

Lắc đều

Để ở nhiệt độ 30
o
C (nhiệt độ phòng) trong 60 phút

Thêm 2 ml dung dịch ZnSO
4
15%

Lọc qua giấy lọc

Thu dịch lọc

Pha loãng 5 lần

Ta có dung dịch pha loãng gọi là dung dịch (*)
59
5 ml dung dịch antron cho vào ống nghiệm

Thêm 2,5 ml dung dịch (*)

Lắc mạnh 10 phút

Đun cách thủy 70
o
C trong 12 phút

Làm nguội

Tiến hành đo OD ở bước sóng 584 nm

Tính kết quả
Một đơn vị hoạt tính pectinase là lượng enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn có
khả năng xúc tác 1 g pectin thành acid galacturonic trong 60 phút.
Điều kiện tiêu chuẩn:
Nhiệt độ: 30
o
C, thời gian: 60 phút
pH 3,9 – 4,1
Nồng độ pectin: 0,66%
Mức độ thủy phân pectin: 30%

Hoạt tính pectinase
V
0,0104OD0,34
(UI)
Trong đó:
OD: Mật độ quang của dung dịch sau khi phản ứng với antron
V: Lượng enzyme lấy tiến hành phản ứng (g hoặc ml)
3.3.3.2. Các phƣơng pháp xác định thành phần chủ yếu trong cà phê
a. Xác định hàm lƣợng cellulose [16]
Nguyên tắc
Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền vững của cellulose
trước tác dụng của acid mạnh, kiềm mạnh, không bị thủy phân dưới tác dụng của acid
yếu. Trong khi đó, các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose,
lignin,… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxi hóa, phân giải và tan
60
vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid
nitric với acid acetic.
Cách thực hiện
Cân 2 g mẫu cà phê đã nghiền nhỏ

Sấy khô đến trọng lượng không đổi (100 – 105
o
C)

Cho vào bình tam giác 250 ml

Thêm vào bình 16,5 ml hỗn hợp 1,5 ml HNO
3
đậm đặc
15 ml CH
3
COOH đậm đặc

Đun sôi 30 phút (có làm lạnh hồi lưu) Giấy lọc

Để nguội, pha loãng bằng nước nóng Sấy khô đến trọng lượng không đổi


Lọc

Rửa kết tủa cellulose 3 lần (10 – 15 ml nước cất nóng/lần)

Rửa bằng rượu etylic 96% 2 lần (10 – 15 ml/lần)

Rửa bằng ete etylic 1 lần (15 – 20 ml)

Sấy giấy lọc có chứa cellulose đến trọng lượng không đổi
(100 – 105
o

C trong 2 – 3 giờ)

61
Tính kết quả
w
100a
X

Trong đó:
X: Hàm lượng cellulose tính bằng %
a: Trọng lượng cellulose (g)
w: Trọng lượng mẫu thí nghiệm (g)
100: Hệ số chuyển đổi thành %
b. Xác định hàm lƣợng pectin (Sử dụng phương pháp Canxi pectat) [9], [16]
Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa.
Cách thực hiện
Cân 0,15 g mẫu cà phê

Thêm vào 100 ml dung dịch NaOH 0,1N

Để hỗn hợp qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin thành acid pectic

Thêm 50 ml dung dịch CH
3
COOH 1N
5 phút
Thêm vào 50 ml dung dịch CaCl
2
2N Giấy lọc không tro

1 giờ
Đun sôi 5 phút Sấy khô đến trọng lượng không đổi

Lọc

Rửa kết tủa canxi pectate bằng nước cất nóng đến khi không còn ion Clo nữa
(thử nước rửa không có kết tủa trắng bằng dung dịch AgNO
3
1%)

Sấy giấy lọc đến trọng lượng không đổi (100 – 105
o
C)
Tính kết quả
Hàm lượng canxi pectate được tính bằng hiệu số của trọng lượng giấy lọc có kết
tủa và giấy lọc không.
62
Hàm lượng pectin được tính theo công thức sau:

B
1000,92w
P

Trong đó:
P: Hàm lượng pectin (%)
W: Trọng lượng kết tủa canxi pectat (g)
B: Lượng pectin lấy đem xà phòng hóa (g)
(khoảng 0,15 g)
0,92: Hệ số chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa
(pectin chiếm 92% trọng lượng canxi pectat)

100: Hệ số chuyển đổi thành %
c. Xác định hàm lƣợng đƣờng tổng số hòa tan [1], [9]
Nguyên tắc
Sự định phân này căn bản dựa trên sự phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường
và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của acid sulfuric (H
2
SO
4
).
Sự chính xác của kết quả phụ thuộc vào:
o Độ sạch các dụng cụ
o Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H
2
SO
4

o Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun
63
Cách thực hiện
Trích đƣờng
Cân 1 g mẫu cà phê đã nghiền nhỏ

Cho vào becher 100 ml và thêm vào 10 ml cồn 90
o

Đun cách thủy cho sôi 3 lần

Khuấy đều, để nguội

Lọc qua giấy lọc không tro (giữ cặn, không đổ cặn lên giấy lọc)

Thêm 10 ml cồn 80
o
vào cốc chứa cặn, khuấy đều

Đun cách thủy cho sôi 2 lần

Khuấy, để nguội, lọc

Lặp lại 2 lần

Đưa cặn lên giấy lọc và rửa sạch 2 – 3 lần bằng cồn 80
o
nóng

Đun nhẹ dịch lọc trên nồi cách thủy để cồn bay hơi hết

Pha loãng cặn thu được với nước cất, định mức 50 ml

Để lắng
64
Thực hiện phản ứng màu
Ta có thể tạo phản ứng màu của dung dịch đường với một trong những thuốc
thử sau đây: phenol, orcinol hay antron. Trong đề tài này, chúng tôi chọn thuốc thử là
antron.
Thực hiện theo bảng dưới đây:
Bảng 3.2: Bảng thực hiện phản ứng màu với antron
Ống số
1
2

3
4
5
6
7
8
9
Glucose mẫu 0,01% (ml)
0
0
1
2
3
4
5


Nước cất (ml)
5
5
4
3
2
1
0


Dung dịch đường nghiên cứu (ml)

5
5
Nồng độ đường mỗi ống (mg/ml)
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
x
x

Để tất cả các ống vào một nồi nước đá

Thêm thật chậm 10 ml thuốc thử antronvào mỗi ống (chảy theo thành ống nghiệm)

Dùng đũa thủy tinh khuấy chậm

Đun sôi cách thủy đúng 7,5 phút

Làm lạnh trong nước đá

Khi nguội, đo OD ở bước sóng 630 nm

Tính kết quả
Trị số mật độ quang của những ống mẫu sau khi đã trừ đi trị số của ống thử
không sẽ xác định được đường chuẩn.
Với dung dịch đường cần định nồng độ, ta cũng lấy trị số mật độ quang trừ đi
trị số mật độ quang của ống thử không rồi chiếu vào đường chuẩn để suy ra nồng độ x,
từ đó tính ra % lượng đường trong mẫu.
65
d. Xác định hàm lƣợng đƣờng khử [16]
Sử dụng phương pháp Acid dinitrosalicylic (DNS).
Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử
DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong
một phạm vi nhất định.
Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính
được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Cách thực hiện
Dựng đƣờng chuẩn glucose
Pha dãy glucose chuẩn từ 0,1 – 0,8 mg/ml

Cho 1 ml dung dịch glucose chuẩn vào 8 ống nghiệm

Thêm 4 ml thuốc thử DNS

Đun sôi 15 phút

Làm lạnh về nhiệt độ phòng

Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm (đối chứng là nước cất)

Dựng đường chuẩn glucose

(với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose)

Xác định lƣợng đƣờng khử
Dung dịch đường cần phân tích cũng được chuẩn bị như phần trích đường của
phương pháp xác định đường tổng số.
Hỗn hợp phản ứng giữa glucose với thuốc thử DNS được tiến hành như phần
dựng đường chuẩn glucose (thay 1 ml dung dịch glucose chuẩn bằng 1 ml dung dịch
đường cần phân tích).