Luận văn : Xác định các thành phần chủ yếu trong cà phê nhân, tạo chế phẩm Biocoffee-1 với hoạt tính cao của pectinase và cellulase part 3 pot

27
Trong thực vật, pectin có chức năng tự nhiên như một chất keo để giữ thành tế
bào cũng như các tế bào lại với nhau. Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối
lượng phân tử từ 80.000 – 200.000 Da.
Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác. Pectin tan trong
nước, NH
3
, dung dịch kiềm, Na
2
CO
3
và trong glycerin nóng.
2.4.2. Cấu trúc

Hình 2.7: Cấu trúc hóa học của phân tử pectin
2.4.3. Phân loại
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới 3 dạng:
o Pectin hòa tan: là ester methylic của acid polygalacturonic.
o Pectinic acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl
được ester hóa bằng methanol.
o Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước. Trong thành
phần có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca
2+
, Mg
2+
, các gốc
phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải
phóng pectin hòa tan.
2.5. CELLULOSE [12], [13], [23], [30]
Mỗi năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp nhờ quá
trình quang hợp. Trong số này có 172 tỷ tấn được tạo thành trên đất liền và 60 tỷ tấn

28
được tạo thành ở trong các đại dương. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực
vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 –
50% trong gỗ.
Ligno-cellulose là thành phần cấu trúc chính của cây gỗ và cây thân mềm (cỏ,
rơm rạ,…) gồm cellulose, hemicellulose và lignin.
2.5.1. Định nghĩa
Cellulose là polymer thẳng của các đơn vị -D-glucose được nối với nhau qua
liên kết -D-1,4-glucan. Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen người ta biết
rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi. Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là
các microfibril (vi sợi) có cấu trúc không đồng nhất, chúng có những phần đặc (phần
kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình).
2.5.2. Cấu trúc
Các phân tử cellulose kết hợp với nhau bằng lực hút Vanderwall và liên kết
hydro. Chúng tạo nên sợi sơ cấp, sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi.

Hình 2.8: Cấu trúc cellulose trong tế bào thực vật
2.5.3. Tính chất
Cellulose có trọng lượng phân tử từ 50.000 đến 2.500.000 Da
Cellulose thường chứa 10.000 – 14.000 gốc đường.
29
Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững. Nó không tan
trong nước mà chỉ có thể bị phồng lên do hấp thu nước, bị phân hủy khi đun nóng với
acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao. Cellulose bị thủy phân ở nhiệt độ bình thường hoặc
ở nhiệt độ 40 – 50
o
C nhờ các enzyme thủy phân cellulose – được gọi chung là
cellulase.
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều
kiện hiếu khí lẫn yếm khí. Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy cellulose đến

sản phẩm cuối cùng là glucose. Tuy nhiên, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự
nhiên thường rất chậm và thường không triệt để.
Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20 –
40% trọng lượng khô) là một loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide như
galactose, mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl. Do bản chất không
kết tinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết chặt chẽ
với lignin (10 – 25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất nhiều đến sự
thủy phân cellulose của enzyme. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi bông)
cellulose tồn tại ở trạng thái một polymer gần tinh khiết.
Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất
này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên liệu,
thực phẩm, rượu bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy, bột giấy,…
2.5.4. Vị trí
Cellulose là nguồn hữu cơ nhiều nhất trong thực phẩm, chất đốt và hóa chất.
Cellulose tồn tại một lượng rất lớn trong thực vật, không đều ở các cơ quan
khác nhau, ít nhất ở lá và nhiều nhất là ở thân cây.
Sự hiện diện của cellulose đóng vai trò là một vật liệu phổ biến của vách tế bào
thực vật được phát hiện lần đầu tiên bởi Anselm Payen vào năm 1838. Nó tồn tại ở hầu
hết những hình thức nguyên trong sợi cotton và trong tổ hợp với những vật liệu khác,
như lignin và hemicellulose, trong gỗ, lá và thân … Mặc dù, nhìn chung được xem như
vật liệu thực vật nhưng cellulose cũng được sản xuất bởi một số vi khuẩn.
Cellulose là nền tảng bộ xương của thành tế bào thực vật. Ngoài ra người ta còn
thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (cellulose ở vi sinh vật thuộc loại
vô định hình, việc phân hủy thường dễ thực hiện). Cellulose không có trong tế bào
động vật.
30
TÌM HIỂU VỀ HỆ ENZYME PECTINASE VÀ CELLULASE

2.6. ENZYME [12], [13]
Chữ “enzyme” được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là chất trong nấm

men.
Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa
học trong cơ thể. Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học
thường là chất vô cơ. Sau này, các nhà khoa học xác định chúng là protein.
Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa
học trong và ngoài cơ thể.
Pavlov đã nói: “Hoạt động của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động
sống. Không có sự sống nào lại không có quá trình enzyme”. Các enzyme xúc tác cho
hầu hết các phản ứng hoá học xảy ra trong cơ thể sống, bảo đảm cho các quá trình
chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng cân đối, theo
những chiều hướng xác định. Enzyme bảo đảm cho sự trao đổi thường xuyên giữa cơ
thể sống và môi trường ngoài, nghĩa là bảo đảm điều kiện tiên quyết cho sự tồn tại của
cơ thể sống.
Enzyme không những hoạt động xúc tác trong tế bào mà còn ngoài tế bào sinh
vật, chính điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng enzyme vào nhiều lĩnh
vực khác của công nghiệp và đời sống .
Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, hoạt độ xúc tác của enzyme lớn gấp
hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Ví
dụ như trong phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng saccharase làm xúc tác tốc độ
phản ứng tăng nhanh gấp 2 ×10
12
lần so với khi dùng acid làm xúc tác.
Điều quan trọng là enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện
nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể, pH môi trường gần pH sinh
lý. Hơn nữa enzyme lại có khả năng lựa chọn cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác
cũng như đối với chất mà nó tác dụng.
Vì enzyme là những chất không thể chế biến được bằng phương pháp tổng hợp
hóa học nên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học. Enzyme có trong tất cả
các cơ quan, mô của động thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật.
31

Enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau: động vật (pepsin từ dạ dày,
trypsin từ tụy tạng….), thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ thơm…). Tuy
nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm
enzyme với qui mô công nghiệp vì những lí do như khó tìm, tốc độ sinh sản chậm, đắt
tiền,… Mặc dù vậy, người ta có thể tận dụng phế phẩm từ hai nguồn này làm môi
trường và thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật cho sản xuất enzyme.
Trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật (nấm
men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Vi sinh vật là giới sinh vật
được xem như nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong thiên nhiên mạnh
nhất. Hiện nay người ta khai thác enzyme nhiều từ vi sinh vật và được ứng dụng rất
nhiều trong đời sống, sản xuất.
Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Vi sinh vật có thể đồng hóa bất
kỳ chất nào trong thiên nhiên, trong khi có nhiều chất mà động vật và thực vật không
thể đồng hoá được.
Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác. Do
vậy chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hoá một lượng lớn cơ chất.
Người ta tính rằng trong 24 giờ, vi sinh vật có thể chuyển hóa một lượng thức ăn gấp
30 – 40 lần so với trọng lượng cơ thể của chúng.
Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, tuy khối lượng nhỏ,
kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất
chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao. Trong một
thời gian ngắn, ta có thể thu nhận được một khối lượng enzyme rất lớn. Đối với một số
trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme.
Phần lớn thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh vật
cho enzyme thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản rẻ tiền như các
phế phụ liệu, phế phẩm của các ngành sản xuất.
Ưu điểm lớn của việc thu nhận enzyme từ vi sinh vật là có khả năng tăng
cường sinh tổng hợp các enzyme nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có
hoạt lực cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trường, có khả năng thích ứng
với nguồn dinh dưỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác

động lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzyme cũng
32
như hoạt tính của chúng và gia tăng tối đa quá trình sinh tổng hợp. Điều đó cho phép ta
có thể tạo được những enzyme theo ý muốn, dễ dàng thu nhận được enzyme có độ
thuần khiết cao.
Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học, đặc biệt trong lĩnh vực
sinh học nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, cùng với nhu cầu enzyme trong
các ngành công nghiệp ngày càng cao, phương pháp sinh tổng hợp enzyme ngày càng
được áp dụng rộng rãi, và có hiệu quả trong nhiều nước trên thế giới. Nhật Bản là một
trong những quốc gia đi đầu trong lĩnh vực này, ở Nhật đã có hơn 20 công ty sản xuất
chế phẩm enzyme. Mỗi năm Nhật sản xuất khoảng 9850 tấn amilase, 8960 tấn
protease, 2200 tấn glucoamilase, 100 tấn lipase, 200 tấn enzyme khác…Ở các nước
phát triển như Đức, Hungari, Nga, Pháp, Anh, Đan Mạch, Trung Quốc…ngành công
nghiệp sản xuất enzyme cũng được chú ý và phát triển khá mạnh.
2.7. PECTINASE [12], [13], [39]
2.7.1. Định nghĩa
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự
phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này có
một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.
Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặc
biệt là khả năng làm trong nước quả.
2.7.2. Ứng dụng
Pectinase được tạo ra trong suốt quá trình chín tự nhiên của một số quả (cùng
với cellulase), chúng giúp làm mềm thành tế bào của quả.
2.7.3. Phân loại
Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng
o Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester.
o Polygalacturonase: còn có tên gọi là poly -1,4-
galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết -1,4-glycoside.
 Polymethylgalacturonase: hay còn gọi là -1,4-galacturonite-

methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalacturonic acid đã được methoxyl hóa.
Enzyme này lại được phân thành 2 nhóm nhỏ là endo-glucosidase-
polymethylgalacturonase kiểu I và exo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu III.
33
 Polygalacturonase: enzyme tác dụng trên pectic acid (hoặc pectinic),
cũng được chia thành 2 nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và
exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV.
o Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị
ester hóa. Các enzyme vi sinh vật ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong
quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và
làm mục mô thực vật.
Ngoài ra còn có:
o Pectin-transeliminase
o Polygalacturonate-transeliminase
o Pectin lyase (PNL)
2.7.4. Chức năng
Pectinase làm đứt trạng thái gắn chặt giữa những phân tử acid galacturonic để
làm ngắn chuỗi pectin từ những đoạn lớn thành những đoạn nhỏ hơn.
Cơ chế xúc tác của pectinase sử dụng nước, vì thế pectinase được xem là một
enzyme thủy phân. Nó cắt đứt phân tử nước, gắn –H vào một C và gắn –OH vào một C
khác.

Hình 2.9: Hoạt động của pectinase
2.7.5. Các vi sinh vật tổng hợp pectinase
o Nấm mốc
 Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger,
Aspergillus terrus, Aspergillus saitoi
 Fusarium moniliforme
34
 Penicillium glaucum, Penicillium ehrlichii, Penicillium chrysogenum,

Penicillium expanam, Penicillium cilrrimim,…
o Nấm men
 Saccharomyces fragilis
o Vi khuẩn
 Bacillus polymyxa
 Flavobacterium pectinovorum
 Klebsiella aerogenes,…
Ngoài ra, pectinase cũng được tiết ra bởi một số mầm bệnh cây trồng như:
o Nấm Monilinia fructigena
o Vi khuẩn gây thối rữa Enwinia carotovora
2.8. CELLULASE [12], [13], [26], [34]
2.8.1. Định nghĩa
Cellulase là một phức hệ hydrolase gồm từ cellulase C
1
đến cellulase C
x
và
-glucosidase. Chúng sẽ phân hủy lần lượt cellulose để cuối cùng tạo ra sản phẩm
đường glucose.
2.8.2. Tính chất
Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất ở nhiệt độ nằm trong khoảng 40
– 60
o
C, pH nằm trong khoảng 4 – 7.
Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó như glucose,
cellobiose.
Hg ức chế hoàn toàn cellulase, trong khi các ion như Mn
2+
, Ag
+

, Cu
2+
và Zn
2+

chỉ ức chế nhẹ.
Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 – 15 phút ở 80
o
C.
2.8.3. Ứng dụng
Hiện nay, cellulase từ vi sinh vật được sản xuất với quy mô công nghiệp và
được ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau. Các ứng dụng quan trọng nhất có thể
kể đến là:
Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được sử dụng để sản xuất glucose,
mật đường từ nguyên liệu chứa nhiều cellulose như rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa,…
Trong công nghiệp sản xuất ethanol từ các phế liệu có chứa cellulose.
35
Trong chăn nuôi động vật ăn cỏ: việc bổ sung cellulase vào thức ăn sẽ tăng
cường sự tiêu hóa hấp thụ thức ăn ở các loài này.
Trong sản xuất dược liệu có nguồn gốc thực vật: cellulase phá vỡ thành tế
bào thực vật giúp cho việc trích ly được dễ dàng.
2.8.4. Phân loại
Enzyme cellulase được phân chia theo chức năng thành 3 nhóm sau :
Endocellulase
Exocellulase
-glucosidase
Theo danh pháp quốc tế thì được phân chia thành 3 nhóm:
1,4- -D-glucan cellobiohyrolase
1,4- -D-glucan-4-glucanohydrolase
-D-glucoside glucohydrolase

2.8.5. Chức năng
Cellulase C
x
còn được gọi là endocellulase hay endoglucanase, tên khác là
1,4- -D-glucan-4-glucanohydrolase.
Thủy phân liên kết -1,4-glucosid ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose,
chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose như Carboxyl Methyl Cellulose (CMC) và
Hydroxyethyl Cellulose (HEC).
Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến
cellulose kết tinh.
Sự thủy phân của endocellulase tạo ra những chuỗi cellodextrin có đầu không
khử.
Cellulase C
1
còn được gọi là exocellulase hay exobiohydrolase, tên khác là
1,4- -D-glucan cellobiohyrolase.
Thủy phân đặc hiệu liên kết -1,4-glucosid ở đầu không khử của chuỗi
cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose (cấu trúc gồm 2 phân tử D-
glucose nối với nhau bằng liên kết -1,4-glucosid).
Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm
thay đổi tính chất hóa lý, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng.
36

-glucosidase (cellobiase), tên khác là -D-glucoside glucohydrolase.
Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy mà tham gia phân
hủy cellobiose, cellodextrin tạo thành D-glucose.
2.8.6. Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase
Hệ vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase khá phong phú, thuộc 3
nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất cellulase hiện nay,
người ta chủ yếu nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn, còn vi khuẩn ít được sử dụng.

o Nấm sợi
Chủ yếu là nấm mốc và nấm quả thể, đa số có khả năng sinh tổng hợp hai hoặc
nhiều exocellulase, một vài endocellulase và một ít -glucosidase. Các enzyme này
đều là enzyme ngoại bào (được nấm tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy).
 Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus
oryzae, Aspergillus sydovii, Aspergillus terrus
 Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum, Trichoderma roseum,
Trichoderma reesei
 Penicillium spp
 Altenaria tenuis
 Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani,…
o Xạ khuẩn
 Actinomyces spp,…
 Chiếm ưu thế là loài xạ khuẩn chịu nhiệt Thermonospora cruvata được
phân lập từ phân rác ủ.
o Vi khuẩn
 Hệ vi sinh vật trong dạ dày của động vật ăn cỏ, ví dụ: Cillobacterium
cellulosolvens, Ruminococcus albus, Ruminobacter parum,…
 Celluvibrio gilvus
 Acetobacter xylinum,…

37
Trong đó, Trichoderma reesei được biết đến như một vi sinh vật sản xuất
cellulase rất tốt. Một số chủng đột biến của Trichoderma reesei có thể sản xuất 160 –
250 UI/g cellulase.



Hình 2.10: Hoạt động của cellulase

Ta có thể tóm tắt toàn bộ quá trình thủy phân cellulose nhƣ sau
38

Sơ đồ 2.2: Quá trình thủy phân cellulose
39


Hình 2.11: Mô hình sự phân hủy cellulose tinh thể
Vùng vô định hình

Vùng kết tinh

Đầu không khử
Đầu khử