Luận văn : Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp. ) part 4 pdf

31

2.6 Công nghệ tạo hạt nhân tạo
2.6.6 Khái niệm về hạt nhân tạo





Hình 2.9 Hạt nhân tạo


32

Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ được dùng để nói đến các phôi
vô tính hoặc các thể nhân giống khác được bao lấy bởi một lớp gel mang chất dinh
dưỡng, giúp cho việc bảo quản trong thời gian dài, vận chuyển trở nên dễ dàng hơn.
Khái niệm được đưa ra lần đầu tiên bởi Murashige vào năm 1978.
Công nghệ hạt nhân tạo sử dụng phôi vô tính có vai trò rất quan trọng trong
việc trồng trọt ở những loài thực vật :
(1) Không tạo được hạt
(2) Hạt được tạo thành với một số lượng thấp
(3) Khả năng hạt sống sót thấp
(4) Việc nhân giống thực vật khó khăn và chất mầm không thể bảo quản
được.

2.6.2 Mục đích của sự ra đời công nghệ hạt nhân tạo
Sự biểu hiện thành công của việc tái sinh cây thông qua sự hình thành phôi vô
tính ở một vài loài thực vật đã mở ra một phạm vi ứng dụng mới đó là tạo hạt nhân tạo
nhằm tạo một hệ thống vận chuyển dễ dàng cho việc gieo trực tiếp phôi lên đất trồng.
Khả năng tái sinh cây của một số loài thực vật từ phôi vô tính và sự thích hợp khí hậu

sau đó của cây là một trong những yếu tố khó khăn nhất nhằm đạt đến thành công
trong việc tạo hạt này. Phôi vô tính được tạo thành in vitro thiếu một vỏ bao ngoài và
có khuynh hướng nẩy mầm ngay tức khắc (nếu phôi đã trưởng thành) dưới những điều
kiện tối ưu hoặc có thể chuyển vào trạng thái thụ động nếu bị thiếu nước (Litz và
Gray, 1992). Ngược lại phôi hợp tử với vỏ bao bên ngoài có một khả năng chịu hạn rất
cao (Senaratna và csv, 1990, 1995; Teng và Hor, 1997). Do đó, cần có một hệ thống
để cảm ứng phôi vô tính sao cho nó hoạt động giống phôi hợp tử, và từ đó có thể chịu
đựng được những tổn hại ở mức tối thiểu.






33

2.6.3 Qui trình tạo hạt nhân tạo

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu tạo hạt nhân tạo
 Với nguyên liệu là chồi (shootbud)



Dùng dao cắt những chồi (shootbud) có kích thước 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro.
 Với nguyên liệu là phôi vô tính



Dùng dao tách rời các phôi hình tim.
34

Bước 2. Dùng pince cấy gắp các phôi/chồi cho vào môi trường tạo vỏ alginate.

Bước 3 Dùng pipette 10ml hút môi trường alginate có chứa chồi/phôi nhỏ vào
dung dịch CaCl
2
.2H
2
O 100mM trong 15 phút.
Somatic embryos formed from cultured plant parts are ideal for artificial seed production.


Bước 4. Dùng pince gắp hạt vào đĩa petri có chứa nước cất vô trùng để làm
sạch lượng CaCl
2
.H
2
O còn sót lại.



Bước 5. Cấy hạt nhân tạo vào môi trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất
điều hòa sinh trưởng).

35

2.6.4 Các nhân tố cần thiết trong việc tổng hợp hạt nhân tạo
Quá trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phôi vô tính là một công việc được thực
hiện với nhiều bước nhưng ít tốn kém. Để việc tổng hợp hạt thành công thì đòi hỏi một
yêu cầu cơ bản đó là phải có một số lượng lớn các phôi vô tính chất lượng cao, có sức

sống tốt, và các phôi này phải phát triển đồng bộ. Yêu cầu về một chất lượng tốt toàn
diện của các phôi vô tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi từ
phôi đến cây con cao. Quá trình làm vỏ bọc cho phôi chỉ quan trọng trong sự vận
chuyển phôi, nó không phải là một nhân tố làm giới hạn sự phát triển của hạt nhân tạo.
Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc cho phôi. Đó có thể là
agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan,
gelrite (Kelko. Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum
… những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào môi trường có chất điện
phân thích hợp như đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào
những liên kết ion. Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó
là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv,
1993). Alginate được sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi như tính
dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dưỡng, có các đặc tính tương hợp sinh
học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để được lâu, độ cứng của gel vừa phải để có
thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ được phôi khỏi những tổn
thương bên ngoài.

2.6.5 Nguyên tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền alginate sodium

Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, muối của acid alginic, là một
polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G)
(Aoyagi và csv, 1998).
36

Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate
chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp
NaCl
2
.2H
2

O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na
+
có trong hỗn hợp sodium alginate
với Ca
2+
có trong hỗn hợp CaCl
2
.2H
2
O. Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số
lượng ion Na
+
trao đổi với ion Ca
2+
. Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium
alginate và CaCl
2
.2H
2
O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ưu để có thể
tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất.
Không như phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng
bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dưỡng,
chất điều hòa tăng trưởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa
cho tăng trưởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh
và Walker, 1990). Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nước, hay các tổn thương cơ
học, tăng sức đề kháng cho phôi người ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng
sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật.
Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate
cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn

đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ
bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã
có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng cao khả năng
sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn. Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cường
khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dưỡng nhiều hơn trong vỏ
bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi.
37

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ Sinh học của Trường Đại
học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Thời gian thí nghiệm từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005.

3.2 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu
 Dụng cụ
Tủ cấy, nồi hấp vô trùng, máy lắc, bình tam giác dung tích 300 ml, đĩa inox và
các dụng cụ khác.
Dụng cụ nuôi cấy được hấp khử trùng ở 1,2 atm, 121
o
C trong 25 phút.
 Mẫu cấy
PLB (protocorm like body) cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) in vitro.
 Môi trường nuôi cấy
Các thí nghiệm được thực hiện trên 2 môi trường MS (Murashige và Skoog,
1962) và VW (Vacin và Went, 1949).
Môi trường được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như BAP, 2,4D, TDZ,
và các chất khác (khoai tây, nước dừa, đường, than hoạt tính) tùy theo mỗi nghiệm

thức thí nghiệm. pH môi trường 5,7. Thể tích môi trường là 70ml/bình tam giác.
Bột sodium alginate, agar được dùng tạo gel và dung dịch CaCl
2
.2H
2
O 100mM
giúp tạo vỏ cứng cho hạt.
Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1,2 atm, nhiệt độ
121
0
C trong 20 phút.
 Điều kiện nuôi cấy
Phòng dưỡng cây có nhiệt độ 25
0
C± 2
0
C, thời gian chiếu sáng 16 giờ, cường độ
chiếu sáng 2.500 lux, ẩm độ 75-80%.



38

3.2.2 Phương pháp
3.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm
Thực hiện 5 thí nghiệm theo các giai đoạn sau :
- Giai đoạn 1 : tạo mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro.
- Giai đoạn 2 : tạo phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro.
- Giai đoạn 3 : tạo cây lan Hồ Điệp in vitro hoàn chỉnh từ phôi soma.
- Giai đoạn 4 : tạo hạt nhân tạo từ phôi soma và tạo cây hoàn chỉnh từ hạt

nhân tạo.
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Mỗi
nghiệm thức cấy 3 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 mẫu.
 Tổng số mẫu cấy ở mỗi thí nghiệm: 45 mẫu.




















39

 Các thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB (protocorm like body)
Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến
khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro

Thí nghiệm gồm 13 nghiệm thức


Nghiệm thức
Môi trƣờng
Nồng độ (mg/l)

2,4-D
BAP
1.1(đối chứng)
VW
0
0
1.2
VW
0,01
0
1.3
VW
0,1
0
1.4
VW
1
0
1.5
VW
0
0,01
1.6

VW
0
0,1
1.7
VW
0
1
1.8
VW
0,1
0,01
1.9
VW
0.1
0.1
1.10
VW
0.1
1
1.11
VW
1
0.01
1.12
VW
1
0.1
1.13
VW
1

1


Các chất khác agar (8,6g/l) + sucrose (40g/l) + nước dừa (200ml/l) + than (1g/l)






40

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành
mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro

Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức:

Nghiệm thức
Môi trƣờng
Nồng độ
Đƣờng (mg/l)
Nƣớc dừa (ml/l)
2.1(đối chứng)
VW
0
0
2.2
VW
20
100

2.3
VW
20
150
2.4
VW
20
200
2.5
VW
40
100
2.6
VW
40
150
2.7
VW
40
200
2.8
VW
60
200
2.9
VW
80
200

Các chất khác 2,4-D (0,1 mg/l) + BAP (0.01 mg/l) + agar (8,6 g/l) + than(1 g/l)