Luận văn : KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) part 5 pps

25

2.4.3. Chuẩn đoán vi sinh vật
2.4.3.1. Chuẩn đoán trực tiếp
Bệnh phẩm khác nhau tùy từng bệnh:
- Phân với nhiễm khuẩn đường tiêu hoá.
- Nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu.
- Máu nếu là nhiễm khuẩn máu…
Có thể làm tiêu bản soi trực tiếp với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâm nước
tiểu hoặc nước não tủy.
Phương pháp chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập. Bệnh phẩm được nhân lên trên
môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo. Nước tiểu giữa dòng được tiến
hành cấy đếm trên thạch thường. Máu được cấy vào canh thang.
Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hóa
học và định loại bằng kháng huyết thanh mẫu.
Đối với viêm màng não, hiện nay người ta còn tiến hành phương pháp chuẩn
đoán nhanh và đặc hiệu bằng kỹ thuật ngưng kết lactex để xác định kháng nguyên
trong dịch não tủy.
2.4.3.2. Chuẩn đoán gián tiếp
Trên thực tế chuẩn đoán gián tiếp không được sử dụng trong chuẩn đoán các
nhiễm khuẩn do E. coli.
2.4.4. Phòng bệnh
Hiện nay chưa có phương pháp phòng bệnh đặc hiệu. Để đề phòng nhiễm khuẩn
đường tiêu hóa do E. coli, thực hiện các biện pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu
giống như đối với các vi khuẩn đường ruột khác.
2.4.5. Chữa bệnh
E. coli thuộc vào các vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là chủng phân lập
được từ nước tiểu, vì vậy cần làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp.
Ngoài việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất có giá trị như bồi phụ nước,
điện giải trong trường hợp tiêu chảy (việc này nhiều khi có vai trò quyết định để cứu
sống bệnh nhân), giải quyết những cản trở trên đường tiết niệu, rút ống thông sớm nếu

có thể được…

26

Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu
3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1.1. Nguyên liệu
Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum).
Bộ phận dùng : lá.
Thu hái tại vườn thực vật ĐH Cần Thơ.
3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Tiến hành thí nghiệm phân tích thành phần hóa học trong lá cây
Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 7/2004, tại Phòng Hóa Lý-
Trung Tâm Phân Tích ĐHNL và Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên.
Giai đoạn 2: Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao được
điều chế từ lá Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ 4/8/2005 đến 26/8/2005. Thực hiện tại
phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Khoa Công Nghệ Môi Trường.
3.1.1.3. Hóa chất cần thiết
 Hóa chất dùng cho phân tích thành phần hóa học
- Ete dầu hỏa: chưng cất phân đọan < 90
0
C.
- Etylacetat: chưng cất phân đoạn ở 64 - 65
o
C, làm khan bằng Na
2
SO

4
.
- Chloroform: chưng cất phân đoạn ở 60 - 61
o
C, làm khan bằng Na
2
SO
4
.
- Ethanol : chưng cất phân đoạn ở 78
o
C, làm khan bằng Na
2
SO
4
.
- Nước cất hai lần.
- Thuốc thử hiện hình: H
2
SO
4
10 % / C
2
H
5
OH, đèn UV 254nm.
- Hạt silicagel dùng cho sắc ký cột: kích thước hạt 0,04 – 0,063 mm, dùng
lượng silicagel gấp 30 lần lượng cao, hoạt hóa ở 110
0
C trong 30 phút trước

khi sử dụng.
- Bản mỏng silicagel loại 25 DC - alufolien 20 x 20 cm, kieselgel 60 F
254
,
Merck.
- Na
2
SO
4
, Na
2
CO
3
, FeCl
3
.
27

- Mg kim loại.
- Natri acetat.
- H
2
SO
4
10%, H
2
SO
4
1%, H
2

SO
4
đđ
,
HCl đđ.
- Thuốc thử: Liebermann, Fehling, Mayer, Bouchardat, Bertrand, Bouchardat,
Dragendorff
 Hóa chất dùng cho thử nghiệm vi sinh
- H
2
SO
4
1 %, BaCl
2
.2H
2
O.
- Dung môi DMSO (dimethysulfoside).
- Nước cất.
- Môi trường lỏng BHI.
- Agar.
- Cồn 96
0
, cồn 70
0
.
3.1.1.4. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm
 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm sử dụng cho thí nghiệm phân tích thành
phần hóa học lá Xuân Hoa
- Bộ soxhlet 6 chỗ (Đức).

- Bộ chưng cất dung môi (Việt nam).
- Máy cô quay hiệu Buchi (Đức)
- Tủ sấy (Memmert).
- Bếp hồng ngoại (Scott, Đức).
- Bình lắng (Duran, Đức).
- Ống chạy sắc ký cột kích thước 5 x 100 cm và 2,5 x 40 cm.
- Điểm nóng chảy xác định trên máy BUCHI melting point - B545.
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy quang phổ hồng ngoại BURKER - IFS48 -
Carlo Erba - GC 6130.
- Phổ
1
H-NMR ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân AV - 500, tần số cộng
hưởng 500 MHz tại Viện Hóa học, Hà Nội.
- Phổ
13
C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT ghi trên máy cộng hưởng từ hạt
nhân AV - 500, tần số cộng hưởng 125 MHz tại Viện Hóa học, Hà Nội.
 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm cần cho thử nghiệm vi sinh
- Tủ cấy vô khuẩn (Nuaire).
28

- Autoclave (Tomy SS – 325).
- Tủ ấm (Memmert).
- Cân điện tử (Sartorius).
- Bếp điện (Airlux).
- Pipette loại 100 – 1000 μl.
- Đầu tipe loại 1000 μl.
- Ống nghiệm.
- Que cấy trang, que cấy vòng.
- Đèn cồn

3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Xử lý nguyên liệu
[19],[20]
Nguyên liệu sau khi thu hái rửa sạch, để khô, sấy khô đến trọng lượng không đổi
sau đó xay thành bột.
3.2.2. Xác định độ ẩm
-Nguyên tắc : Mẫu được sấy ở 105
0
C nước sẽ bốc hơi và làm giảm khối lượng.
Cân rồi suy ra độ ẩm.
-Tiến hành : sấy trong chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 10 g
mẫu sấy ở 105
0
C trong 2 giờ, sau đó lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút, sau đó
cân thu khối lượng còn lại (a g) và tính độ ẩm mẫu theo công thức:.
Độ ẩm mẫu = (10 - a ) x 100 %
3.2.3. Xác định tro toàn phần
Tro toàn phần là lượng hợp chất vô cơ còn lại khi nung cháy hoàn toàn mẫu
nguyên liệu, các ion còn lại ở dạng carbonat hay oxit.
- Tiến hành : Nung chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 10 g mẫu
trải đều thành một lớp mỏng. Đặt vào lò nung ở nhiệt độ 600
0
C trong 3 giờ, lấy ra để
vào bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân khối lượng tro còn lại (b g) và tính hàm lượng tro
theo công thức:
Hàm lượng tro = b/10 x 100 %


29

3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật
[6],[16],[20],[22]
3.3.1. Nguyên tắc
Dựa vào độ hòa tan trong các dung môi khác nhau của các hợp chất trong
nguyên liệu mà phân tích, dùng các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether, ethanol
và nước. Sau đó xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng
đặc trưng.
3.3.2. Cách tiến hành
Chuẩn bị dịch chiết:
- Dịch chiết ether:
Chiết 25 g mẫu bằng diethyl ether trong bể siêu âm cho đến khi dịch ether nhạt
màu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50 ml.
- Dịch chiết cồn:
Bã sau khi chiết bằng ether được chiết nóng bằng cồn 96
0
trong bể siêu âm đến
khi dịch gần không màu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50 ml.
- Dịch chiết nƣớc:
Bã sau khi chiết bằng cồn 96
0
, đem chiết nóng trong bể siêu âm 5 phút (3 lần)
với thể tích nước vừa đủ ngập mẫu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50ml.
Xác định các nhóm hợp chất:
Xác định các nhóm hợp chất trong dịch ether:
Chất béo Anthraglycosid
Triterpenoid tự do Alkaloid
Flavonoid Coumarin
Tinh dầu Carotenoid
Acid hữu cơ
Xác định các nhóm hợp chất trong dịch cồn:

Alkaloid Antraglycosid
Tanin Đường khử
Flavonoid Saponin


30

Xác định các nhóm hợp chất trong dịch nƣớc:
Alkaloid Antraglycosid
Saponin Flavonoid
Tanin Polyuronic
Đường khử
Phương pháp định tính:
Acid hữu cơ:
Lấy 2 ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Pha loãng với 1 ml nước cất, thêm một ít
tinh thể NaCO
3
. Nếu có bọt khí sủi lên từ các tinh thể NaCO
3
- Có acid hữu cơ.
Alkaloid:
Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử trong chén sứ, hòa cắn với 4 ml HCl 1%. Chia đều
trong 4 ống nghiệm, nhỏ lần lượt vào đó các thuốc thử sau cùng với kết quả nhận định
là có alkaloid:
Thuốc thử Valse-Mayer: Tủa trắng – vàng nhạt
Bertrand : Tủa trắng
Bouchardat : Tủa đỏ nâu
Dragendorff : Tủa đỏ cam
Antraglycosid:
Phản ứng Bortrager: Cho 5 ml dịch thử vào một ống nghiệm nhỏ, thêm vào đó

NaOH 10 %, lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ - Có anthraglycosid.
Carotenoid:
Phản ứng 1: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ, nhỏ vào đó vài giọt
thuốc thử Carr-Price (SbCl
3
bão hòa trong CHCl
3
). Dung dịch có màu đỏ - Có
carotenoid.
Phản ứng 2: Thêm vào cắn vài giọt H
2
SO
4
đậm đặc. Dung dịch có màu xanh
dương - Có carotenoid.
Chất béo:
Nhỏ vài giọt dịch ether lên cùng một chỗ trên giấy xác định chất béo, sấy nhẹ cho
hết dung môi, hết mùi tinh dầu (nếu có). Chỗ nhỏ để lại vết mờ - Có chất béo.


31

Đƣờng khử:
Bốc hơi 5 ml dịch thử đến cắn. Hòa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy. Để
nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5
Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm - Có các
hợp chất khử (chủ yếu là đường khử).
Coumarin:
Phản ứng 1: Nhỏ vài giọt dịch thử lên một miếng giấy lọc, sấy nhẹ. Nhỏ lên đó
hai giọt KOH 10 % trong cồn, tiếp tục sấy nhẹ cho khô. Che một nửa vết chấm bằng

một miếng kim loại, soi UV365 nm. Sau vài phút lấy miếng kim loại ra; nhận xét sự
thay đổi cường độ phát quang của nửa mặt bị che: sáng dần lên đến khi sáng tương
đương với nửa không bị che – có coumarin.
Phản ứng 2: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử. Hòa cắn với 2 ml cồn 70
0
, chia đều
vào hai ống nghiệm nhỏ, thêm vào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10 % và ống thứ hai một
lượng nước cất tương đương. Đun cách thuỷ cả hai ống nghiệm trong 2 phút, để nguội
soi UV365 nm. Dung dịch trong ống một có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong
ống thứ hai - có coumarin.
Flavonoid:
Phản ứng Cyanidin: Lấy khoảng 10 ml dịch thử cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn
khô. Hòa cắn với 2 ml cồn 25
0
gạn dịch cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào
đó một ít bột Mg kim loại và thêm từ từ 0,5 ml HCl đậm đặc. Sau phản ứng dung dịch
có màu từ hồng tới đỏ - có flavonoid.
Anthocyanosid: Lấy 1 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt HCl
10 %, nếu dung dịch có màu từ hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa
bằng dung dịch NaOH 10 % - Có anthocyanosid.
Proanthocyanidin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm, thêm 2 ml HCl
10 %, đun cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ - có
proanthocyanidin.
Polyuronic:
Nhỏ từng giọt một 2 ml dịch thử vào một ống nghiệm có chứa 10 ml cồn 95
0
.
Nếu có nhiều tủa bông được tạo thành - có polyuronid.

32

Saponin:
Lấy 5 ml dịch thử cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn. Hòa cắn với 5 ml cồn 25
0

trên bếp cách thủy. Lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm. Thêm 5 ml nước, lắc mạnh theo
chiều dọc ống. Nếu có bọt bền - có saponin.
Tanin:
Bốc hơi tới cắn dịch thử trong chén sứ, hòa cắn với 4 ml nước cất trên bếp cách
thủy. Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm:
Ống 1: Pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1:2, thêm hai giọt thuốc thử FeCl
3
5 %,
lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh rêu hay xanh đen - có polyphenol.
Ống 2: Thêm 5 giọt dung dịch gelatin mặn, lắc đều so sánh với ống chứng. Nếu
có tủa bông trắng - có tanin.
Tinh dầu:
Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ; nếu cắn có mùi thơm nhẹ cho vào
đó một ít cồn cao độ, bốc hơi tới cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng – có tinh dầu.
Triterpenoid:
Phản ứng Libermann-Burchard: bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử, hòa cắn với 0,5 ml
anhydrid acetic và 0,5 ml CHCl
3
, chuyển dung dịch vào ống nghiệm, nhỏ từ từ 1 ml
H
2
SO
4
đậm đặc theo thành ống đặt nghiêng. Nếu vòng ngăn cách có màu đỏ nâu hay
đỏ đến tím; lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím - có

triterpennoid tự do (phytosterol).
33










Sơ đồ 3.1: Qui trình tổng quát phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
FeCl
3
TT Fehling A, B
Nguyên
liệu
Mg/HClđđ
Chiết
bằng
ether
Bã
nguyên
liệu
Dịch
Ether
KOH
10%
Chiết

bằng
cồn
Lớp
kiềm
Lớp
ether
Dịch
chiết
cồn
Bã
nguyên
liệu
Dịch cồn
Dịch ether
Dịch acid
Bã nguyên liệu
Dịch acid
H2SO4
10%
vết trên giấy lọc
KOH 10%
Flavonoid
Acid béo
Anthraglycosid
Cắn có mùi thơm
Liebermann
H
2
SO
4đđ

Tinh dầu
Phytosterol
Carotenoid
TT Mayer, Bouchardat, Dragendoft

Alkaloid

KOH, HCl
TT Fehling A, B
TT Mayer, Bouchardat
Na
2
CO
3
Na Acetat + FeCl
3
3%
Mg/HCl
đđ
KOH 10%
Liebermann
Anthraglycosid
Sterolic
Flavonoid
Tanin
Acid hữu cơ
Alkaloid
Đường khử
Anthocyan
Saponin

Tạo bọt
Cồn cao độ
TT Mayer, Bouchardat
H2SO4
1%
H/c uronic
Đường khử
Tanin
Alkaloid
Saponin