Luận văn : Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử part 5 ppt

41









Hình 4.7: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPC15 trên gel agarose
1,5%
- Primer RAPD2: số lượng dòng dứa cho sản phẩm khuếch đại ít chiếm 36%, với 5
băng đa hình được tạo ra có kích thước từ 0,7- 1,6 kb. Primer này cũng không cho sản
phẩm khuếch đại với các dòng dứa Hà Nội (hình 4.8).









Hình 4.8: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer RAPD2 trên gel agarose
1,5%.

- Tương tự đối với primer OPA04 tạo ra 5 băng đa hình có kích thước từ 0,3 – 2,5
kb (hình 4.9) và OPA10 có 4 băng đa hình có kích thước từ 0,2 – 1,5 kb (hình 4.10)
cũng cho thấy sự đa dạng về nguồn gen giữa những dòng trong cùng một giống. Cả hai

marker này cũng ít có sản phẩm với những dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội và
không có sản phẩm duy nhất. Các băng đa hình tạo ra rõ và dể dàng thấy được sự khác
biệt giữa các dòng.



42








Hình 4.9: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPA04 trên gel agarose
1,5%








Hình 4.10: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPA10 trên gel agarose
1,5%.

- Ngoài ra, primer RAPD6 với 3 sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 1,1 – 2,5
kb, primer OPD02 với 4 sản phẩm đa hình được tạo ra có kích thước từ 0,3 – 1,3 kb

cũng cho thấy sự khác biệt về di truyền giữa các dòng dứa Cayenne. Trong tổng số
những primer khảo sát thì primer AJ01 có số lượng dòng dứa có sản phẩm khuếch đại
PCR thấp nhất chỉ chiếm 18 % trên tổng số dòng thí nghiệm và số băng đa hình được
tạo ra là 3 băng với kích thước từ 0,4 – 1,018 kb. Đối với primer này thì các dòng dứa
Hà Nội có sản phẩm khuếch đại. Hiệu quả tạo sản phẩm PCR của primer này không
cao so với các primer khác có thể do bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong phản ứng
PCR như lượng DNA, nồng độ Taq polymerase, đều này đã được chứng minh bởi
Boonsermuk và ctv (1997).



43
Từ kết quả phân tích sản phẩm PCR với 9 primer cho thấy các primer đều tạo ra
các băng đa hình có thể phân biệt được sự khác biệt về di truyền giữa các dòng dứa
trong cùng một giống và số lượng dòng dứa có đa hình cũng khác nhau ở từng primer
(bảng 4.4). Primer OPA10 cho đa hình với số lượng dòng cao nhất (58 %) và thấp nhất
là AJ01 (18 %), RAPD4 có số lượng allen tạo ra trên một dòng cao nhất. Trong 50
dòng dứa Cayenne nghiên cứu thì các dòng có nguồn gốc từ Hà Nội ít có sản phẩm
khuếch đại. Do vậy, đối với các dòng dứa này cần phải tiếp tục chọn lựa các marker
khác để kiểm tra thêm. Số lượng sản phẩm PCR tạo ra đối với những primer thì còn
phụ thuộc nhiều vào đều kiện phản ứng PCR (Ellsworth và ctv, 1993) cho nên chỉ có
một số primer cho ra các băng đa hình. Bên cạnh đó, một số sản phẩm PCR khó nhận
diện trên gel có thể do số lượng sản phẩm khuếch đại ít nên băng bị mờ hoặc thời gian
nhuộm với ethiumbromide ít vì vậy việc thu thập các dữ liệu để phân nhóm cần tiến
hành cẩn thận.
Bảng 4.4: Sự đa hình của 9 primer với 50 dòng dứa Cayenne
Primer
Cấu trúc primer
Vị trí allen
Số dòng tạo băng

Tỉ lệ (%)
OPD 02
Đa hình
A, B, C,D
21
42 %
OPA10
Đa hình
A, B, C, D
28
56 %
RAPD3
Đa hình
A, B, C, D
25
50 %
OPC15
Đa hình
A, B, C, D
25
50 %
RAPD2
Đa hình
A, B, C, D, E
18
36 %
RAPD4
Đa hình
A, B, C, D, E, F
24

48 %
RAPD6
Đa hình
A, B, C
23
46 %
AJ01
Đa hình
A, B, C
9
18 %
OPA04
Đa hình
A, B, C, D, E
23
46 %

Bên cạnh đó, có một đều lý thú khi phát hiện đa hình trên các primer kết hợp
với xem xét kiểu hình cho thấy những primer trong nghiên cứu này có thể tách được
hai nhóm dứa với hình dạng lá có gai và không có gai dựa trên những băng đa hình
khác nhau trên từng primer (bảng 4.5).



44
Bảng 4.5: Sự khác biệt về kiểu gen giữa dòng dứa có gai và không có gai dựa vào
sự đa hình của các primer
Tên dòng
OPD02
OPA10

RAPD3
OPC15
RAPD2
RAPD4
RAPD6
OPA04
OMK44*
OMK19
C
No
D
A, B
B, C, D
No
C, D
B, C, D
D, E
No
D, E
A, C, D
No
A, B, C
A, B, C, D, E
No
OMK8*
OMK36
A, D
C
C, D
B, C, D

B, C, D
A, B, D
B, C, D
A, C, D
D, E
D
B, C, E
E
A, B, C
A
A, B, C
A, B, C, D, E
Chú thích: *: dòng dứa không có gai,
No: không có sản phẩm khuếch đại.
A, B, C, D, E: các vị trí của allen.
Qua sự đa hình khác nhau chứng tỏ rằng những primer này có thể sử dụng trong
nghiên cứu thiết lập bản đồ phân nhóm của gen qui định tính trạng về hình dạng lá có
gai và không có gai trên cây dứa. Đồng thời, kết quả này cũng xác định rằng dòng
OMK19 có nguồn gốc từ Tây Ninh thuộc nhóm giống đối chứng Queen. Qua đó, cũng
có thể xác định được dòng OMK36 có nguồn gốc từ Kiên Giang là dòng dứa bị phân
ly trong quá trình tiến hóa của giống Cayenne bởi bản chất của giống này là không có
gai hoặc rất ít nhưng chúng thì có kiểu hình gai và khác nhau về kiểu gen so với những
dòng khác trong giống Cayenne. Như vậy, đối với dòng OMK36 cần phải kiểm tra và
xác định lại nguồn gốc giống nhằm góp phần phân nhóm giống Cayenne một cách
chính xác hơn cũng như tránh nhầm lẫn giống trong lai tạo và chọn lọc. Kết quả khác
biệt này cũng sẽ được biểu hiện trong sơ đồ phân nhóm dựa vào phần mềm NTSYS
theo phương pháp phân tích nhóm UPGMA .

4.2.3. Phân tích nhóm của 50 dòng dứa Cayenne dựa trên dữ liệu RAPD
Những dữ liệu thu thập từ việc mã hoá sản phẩm PCR theo quy tắc có băng ghi

1 và không có băng ghi 0 sẽ được dùng để tạo ra ma trận khoảng cách của 50 dòng dứa
Cayenne sử dụng chỉ số tương ứng giản đơn SM (simple coefficient), từ đó xây dựng
sơ đồ phân nhóm hình cây biểu diễn mối quan hệ về di truyền giữa các dòng trong
cùng một giống thông qua phần mềm NTSYS-pc.



45




















Hình 4.11: Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan về di truyền giữa 50 dòng dứa
Cayenne trên cơ sở kiểu gen.

Kết quả thu được ở hình 4.11 cho thấy nếu xét mức độ tương đồng di truyền
của 50 dòng Cayenne ở 66 % thì sẽ được chia thành 3 nhóm chính sau:
 Nhóm I
Nhóm này gồm 20 dòng Cayenne có mức độ tương đồng di truyền nằm trong
khoảng 0,66 – 0,74. Các giống thuộc nhóm này phần lớn là các dòng nhập ngoại 9 / 20
dòng. Nhóm I được chia thành 2 nhóm phụ với khoảng cách di truyền gần hơn như
sau:
- Nhóm Ia: có mức độ tương đồng di truyền nằm trong khoảng 0,74 – 0,83 gồm các
dòng dứa nhập ngoại: OMK5, OMK7, OMK2, OMK9, OMK11, OMK1 và các dòng
PHAN NHOM DI TRUYEN DUA
SM Coefficient
0.49 0.57 0.66 0.74 0.83 0.91 1.00
OMK12
OMK5
OMK11
OMK1
OMK9
OMK20
OMK8
OMK2
OMK7
OMK29
OMK12
OMK10
OMK51
OMK6
OMK50
OMK17
OMK3

OMK15
OMK48
OMK42
OMK45
OMK16
OMK44
OMK52
OMK19
OMK18
OMK4
OMK43
OMK66
OMK71
OMK70
OMK68
OMK62
OMK69
OMK73
OMK76
OMK13
OMK47
OMK64
OMK63
OMK40
OMK67
OMK72
OMK77
OMK65
OMK74
OMK56

OMK75
OMK49
OMK59
OMK61


46
dứa nhập nội: OMK20, OMK59, OMK8. Trong đó, OMK8 có mức độ tương đồng
thấp 0,73 nhất nghĩa là có sự khác biệt nhiều về di truyền so với các dòng dứa còn lại
trong nhóm. Đồng thời, OMK1 với OMK9 có quan hệ gần nhau về di truyền trên 90 %
mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau. Tuy nhiên, OMK11, OMK1 với OMK5 có
cùng nguồn gốc nhưng lại nằm khác nhánh với nhau chứng tỏ về nguồn gen có sự đa
dạng.
Qua phân tích các dòng trong nhóm Ia cho thấy có sự giống nhau về di truyền
giữa các dòng dứa Cayenne nhập ngoại với nhau và dòng nhập nội với dòng nhập
ngoại. Sự khác nhau giữa dòng dứa OMK8 và OMK9 chứng tỏ chúng là các quần thề
xa nhau về nguồn gốc di truyền. Kết quả này cũng đã được xác nhận trong nghiên cứu
về đa dạng di truyền trên dứa (Hoàng Thị Bích Thuỷ và ctv, 2004).
- Nhóm Ib: nằm trong khoảng tương đồng từ 0,74 – 0,91 bao gồm 11 dòng và
phân thành 2 nhóm phụ với mức tương quan di truyền 70 %.
Nhóm Ib1: chứa 5 dòng OMK10, OMK12, OMK50, OMK51 và OMK6.
Trong đó, OMK10 và OMK12 nằm cùng nhánh bởi chúng xuất phát từ một quần thể
và cùng tương quan đến 80 % vớI OMK50. Ngoài ra, OMK51 và OMK6 có thể xuất
phát từ cùng một quần thể bởi tương đồng 80 % về di truyền.
Nhóm Ib2: gồm những dòng dứa OMK17, OMK3, OMK15, OMK42,
OMK45, OMK48 với mức tương đồng di truyền trên 80 %, trừ dòng OMK45 có sự
khác biệt di truyền cao với hệ số tương đồng thấp 0,63. Trong nhóm này còn cho biết
dòng OMK3 có thể cùng quần thể với OMK17, và sự khác biệt về di truyền giữa dòng
OMK45 với OMK42 và OMK48 mặc dù chúng có cùng nguồn gốc từ Bến Tre.
 Nhóm II

Nhóm II chỉ có 3 dòng OMK16, OMK52 và OMK44 với mức tương đồng về di
truyền đối với các nhóm khác nằm trong khoảng 0,66 – 0,83. Trong nhóm này, dòng
OMK16 và OMK44 cùng nhánh chứng tỏ chúng có thể xuất phát từ cùng một quần
thể.
 Nhóm III
Với 27 dòng dứa còn lại, nhóm III có hệ số tương đồng giữa các dòng dứa nằm
trong khoảng từ 0,66 – 1,0, các dòng dứa trong nhóm này hầu hết là dòng nhập nội
như có nguồn gốc từ Hà Nội, Bến Tre và chỉ có 2 dòng nhập ngoại là OMK4 và
OMK13. Nhóm III được phân thành 2 nhóm khác biệt:

47
- Nhóm IIIa: chỉ duy nhất dòng OMK19 với mức độ tương đồng là 67 %.
- Nhóm IIIb: gồm 26 dòng dứa với khoảng cách tương đồng từ 0,75 – 1,0. Có thể
chia nhóm này thành 2 nhóm phụ nhỏ sau:
Nhóm IIIb1: chỉ gồm OMK18 với độ tương đồng là 70% so với nhóm.
Nhóm IIIb2: gồm 25 dòng còn lại với hệ số tương đồng rất cao nằm trong
khoảng 0,85 – 1,0. Bao gồm các dòng: OMK4, OMK40, OMK49, OMK47, OMK56,
OMK59, OMK77, OMK13, OMK76 và các dòng OMK61 – OMK75. Các dòng dứa từ
Hà Nội phần lớn không có sự khác biệt về di truyền bởi có mức độ tương đồng cao
trên 90 % và cùng tương quan gần về di truyền với dòng có nguồn gốc từ Trung Quốc,
Cần Thơ và Bến Tre. Đều này cho biết chúng có thể xuất phát từ các quần thể có quan
hệ gần nhau. Đây sẽ là yếu tố quan trọng góp phần vào công tác chọn giống nhằm hạn
chế việc chọn những giống ít có sự khác biệt di truyền.
Kết quả thu được từ phân tích nhóm III cho thấy một số dòng gần như giống
nhau hoàn toàn về mặt di truyền bởi chúng đều xuất phát từ một giống. Tuy nhiên đây
chỉ là phân tích bước đầu do số lượng primer dùng để phân tích chưa đủ lớn và còn
nhiều vấn đề xảy ra trong lúc tiến hành phản ứng mà chưa thể kiểm soát triệt để do đó
chưa phân nhóm một cách chi tiết hơn đối với những dòng này.
Như vậy, với 9 marker RAPD được sử dụng, 50 dòng dứa từ Cayenne được
phân thành 3 nhóm chính (bảng 4.6) với mức độ tương đồng về di truyền giữa các

nhóm được thể hiện trong bảng 4.7. Khoảng cách di truyền giữa các dòng dứa
Cayenne dao động lớn từ 0,27 – 1,0 (phụ lục III) chứng tỏ có sự đa dạng về mặt di
truyền cao. Qua phân nhóm, những dòng dứa thuộc các nhóm khác nhau có thể được
sử dụng để làm vật liệu lai tạo trong chọn giống, cụ thể nhóm I, nhóm II có thể lai tạo
với nhóm III sẽ tạo ra những quần thể đa dạng về nguồn gen bởi những nhóm có
khoảng cách di truyền càng xa thì khả năng cho con lai có nhiều tính trạng càng cao
(Bùi Chí Bửu, 2002).







48
Bảng 4.6: Kết quả phân tích nhóm của 50 dòng dứa Cayenne
STT
Tên dòng
Nguồn gốc
Phân nhóm
STT
Tên dòng
Nguồn gốc
Phân nhóm
1
OMK5
Nhật
I
26
OMK47

Thơm Bến Tre
III
2
OMK12
Úc
I
27
OMK52
Thơm Bến Tre
II
3
OMK19
Khóm Tây Ninh
III
28
OMK49
Thơm Bến Tre
III
4
OMK10
Úc
I
29
OMK50
Thơm Bến Tre
I
5
OMK17
Codevoire (Pháp)
I

30
OMK51
Thơm Bến Tre
I
6
OMK2
Đài Loan-BL
I
31
OMK61
Thơm Hà Nội
III
7
OMK7
MontiqueI (Pháp)
I
32
OMK66
Thơm Hà Nội
III
8
OMK15
Thơm Phụng
I
33
OMK67
Thơm Hà Nội
III
9
OMK29

ThomBT9
I
34
OMK64
Thơm Hà Nội
III
10
OMK18
Khóm Hà Nội
III
35
OMK65
Thơm Hà Nội
III
11
OMK20
Thơm Tây Ninh
I
36
OMK71
Thơm Hà Nội
III
12
OMK4
Thơm Thái Lan
III
37
OMK72
Thơm Hà Nội
III

13
OMK11
Đài Loan
I
38
OMK73
Thơm Hà Nội
III
14
OMK1
Đài Loan
I
39
OMK74
Thơm Hà Nội
III
15
OMK8
Thơm Lâm Đồng
I
40
OMK75
Thơm Hà Nội
III
16
OMK9
Thái Lan-MC
I
41
OMK56

Thơm Bến Tre
III
17
OMK3
Thơm Trung An
I
42
OMK76
Thơm Cần Thơ
III
18
OMK59
Thơm Bến Tre
III
43
OMK77
Phụng Hiệp
III
19
OMK16
Thơm Kiên Giang
II
44
OMK40
Thơm Bến Tre
III
20
OMK44
Thơm Bến Tre
II

45
OMK13
Trung Quốc
III
21
OMK48
Thơm Bến Tre
I
46
OMK62
Thơm Hà Nội
III
22
OMK42
Thơm Bến Tre
I
47
OMK63
Thơm Hà Nội
III
23
OMK43
Thơm Bến Tre
III
48
OMK68
Thơm Hà Nội
III
24
OMK45

Thơm Bến Tre
I
49
OMK69
Thơm Hà Nội
III
25
OMK6
Thom Bến Lức
I
50
OMK70
Thơm Hà Nội
III

Bảng 4.7: Mối tƣơng quan về di truyền giữa các nhóm
Nhóm
I
II
III
I
0,67


II
0,63
0,71

III
0,49

0,49
0,69



49
4.3. Ƣớc đoán độ chính xác giữa phân nhóm dựa trên đặc tính kiểu hình và
chỉ thị RAPD
Qua phân nhóm của 50 dòng dứa Cayenne dựa trên kiểu hình (bảng 4.2) và kiểu
gen (bảng 4.6) cho thấy về mặt kiểu hình những dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội
nằm trong 3 nhóm khác nhau, về mặt kiểu gen chúng nằm trong cùng một nhóm với
mức tương quan gần với nhau. Tương tự, về kiểu hình OMK16 và OMK44 khác nhau
về chiều cao, số lá / bụi, màu sắc, hình dạng lá nhưng trong phân tích kiểu gen thì
tương đồng 86 %. Đều này cho thấy sự đa dạng kiểu hình chưa thể nói lên được sự
khác biệt về di truyền, kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Bachmann
(1992).
Dựa trên phần mềm NTSYS-pc, độ tin cậy trong phân nhóm dựa vào kiểu hình
và chỉ thị RAPD được đánh giá thông qua kiểm tra Mantel (Mantel, 1967) với kết quả
hệ số tương quan trong phân nhóm dựa vào kiểu hình r = 0,66 (p = 1) và phân nhóm
dựa trên kiểu gen r = 0,9 (p = 1). Hệ số tương quan càng lớn chứng tỏ độ tin cậy của
phương pháp càng cao, đều này cho thấy đánh giá sự đa dạng nguồn gen dứa bằng chỉ
thị RAPD chính xác hơn so với kiểu hình, kết quả này cũng đã được báo cáo trong
nghiên cứu của Phạm Trung Nghĩa và ctv (1999). Khi so sánh hai ma trận khoảng cách
giữa hai phương pháp, kết quả với giá trị tương quan r = 0,073 (p = 0,99) có thể thấy
những tính trạng hình thái đang nghiên cứu bị tác động nhiều bởi môi trường nên hệ số
tương quan chưa cao. Hệ số này có thể cải tiến nếu như nhiều dữ liệu hình thái được
nghiên cứu và nhiều primer được sử dụng để đánh giá sự đa hình hơn nữa ( Martínez
de Toda và Sahcha, 1997a).
Tóm lại, nghiên cứu và phân nhóm dựa vào đặc tính kiểu hình và kiểu gen có
thể giúp đoán được sự tương quan di truyền giữa những dòng dứa có nguồn gốc khác

nhau từ giống Cayenne, từ đó giúp cho các nhà chọn giống định hướng sơ khởi về
những vật liệu lai tạo, dự kiến các qui trình chọn lọc sao cho đạt hiệu quả cao nhất và
rút ngắn thời gian.






50
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận
- Dựa vào kiểu hình 50 dòng dứa từ giống Cayenne thuộc 4 nhóm khác nhau, có
sự tương quan giữa các giống nhập nội với các giống có nguồn gốc nhập ngoại. Những
dòng có cùng nguồn gốc nhưng vẫn có sự đa dạng về kiểu hình.
- Trong tổng số 13 primer tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền thì chỉ có 9
primer cho sản phẩm khuếch đại.
- Qua phương pháp RAPD đã cho thấy được sự đa dạng và phân nhóm khác nhau
trong tập đoàn dứa Cayenne gồm 50 dòng có nguồn gốc khác nhau.
- Tập đoàn dứa Cayenne khảo sát được phân thành 3 nhóm chính thông qua 9
marker RAPD ở mức độ tương đồng về di truyền là 66%. Trong đó, những dòng dứa
trong nhóm II có khác biệt về di truyền cao hơn so với nhóm I và nhóm III.
- Xác định được dòng OMK19 không phải giống Cayenne mà thuộc giống Queen.
Một số dòng bị phân ly và lai tạp giữa giống Queen và Cayenne như OMK36, OMK1
- Sử dụng phương pháp marker phân tử có thể dự đoán những cá thể có khả năng
tạo ưu thế lai trong chọn tạo giống
- Phương pháp phân nhóm di truyền dựa trên marker RAPD thì tương đối chính
xác hơn kiểu hình. Dựa vào marker phân tử có thể đánh giá gián tiếp sự hiện diện hay
không hiện diện của gen chọn lọc nhờ marker mà không bị ảnh hưởng của môi trường.

- Ứng dụng các phương pháp marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền đòi
hỏi có sự đầu tư lớn về trang thiết bị, máy móc cũng như sự kiên trì và lâu dài.

5.2. Đề nghị
- Nghiên cứu và phân tích sự đa dạng trên nhiều tính trạng hình thái để có sự phân
nhóm chính xác hơn về kiểu hình. Từ đó tìm hiểu những tính trạng có đóng góp nhiều
trong sự khác biệt di truyền để kiểm soát và khai thác dễ dàng hơn.
- Tiếp tục thử nghiệm, phân tích để tìm ra nhiều primer khác phân biệt những dòng
dứa từ Cayenne một cách chi tiết hơn, tạo cơ sở cho việc xây dựng hoàn chỉnh sơ đồ
phân nhóm di truyền dứa.
- Tiếp tục ứng dụng marker RAPD để tìm sự liên kết với những gen quy định về
tính trạng hình thái như năng suất, thời gian sinh trưởng, hình dạng trái, hình dạng lá