Luận văn : Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử part 3 pps

21
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1tháng 8 năm 2005
tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử thuộc Bộ Môn Di truyền và Chọn giống ở
Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn, TP. Cần Thơ.

3.2. Vật liệu
3.2.1. Nguồn gốc mẫu
Bảng 3.1: Danh sách các giống Cayenne đƣợc sử dụng trong đề tài
STT
Tên dòng
Nguồn gốc
Cơ quan
cung cấp
STT
Tên dòng
Nguồn gốc
Cơ quan
cung cấp
1
OMK5
Nhật
Long Định
26
OMK47
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
2

OMK12
Úc
Long Định
27
OMK52
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
3
OMK19
Khóm Tây Ninh
VLĐBSCL
28
OMK49
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
4
OMK10
Úc
Long Định
29
OMK50
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
5
OMK17
Codevoire (Pháp)
Long Định
30
OMK51
Thơm Bến Tre

VLĐBSCL
6
OMK2
Đài Loan-BL
Long Định
31
OMK61
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
7
OMK7
MontiqueI (Pháp)
Long Định
32
OMK66
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
8
OMK15
Thơm Phụng
Long Định
33
OMK67
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
9
OMK29
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
34

OMK64
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
10
OMK18
Khóm Hà Nội
VLĐBSCL
35
OMK65
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
11
OMK20
Thơm Tây Ninh
VLĐBSCL
36
OMK71
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
12
OMK4
Thơm Thái Lan
Long Định
37
OMK72
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
13
OMK11
Đài Loan

Long Định
38
OMK73
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
14
OMK1
Đài Loan
Long Định
39
OMK74
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
15
OMK8
Thơm Lâm Đồng
Long Định
40
OMK75
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
16
OMK9
Thái Lan-MC
Long Định
41
OMK56
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
17

OMK3
Thơm Trung An
Long Định
42
OMK76
Thơm Cần Thơ
VLĐBSCL
18
OMK59
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
43
OMK77
Phụng Hiệp
VLĐBSCL
19
OMK16
Thơm Kiên Giang
Long Định
44
OMK40
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
20
OMK44
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
45
OMK13
Trung Quốc

Long Định
21
OMK48
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
46
OMK62
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
22
OMK42
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
47
OMK63
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
23
OMK43
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
48
OMK68
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
24
OMK45
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
49

OMK69
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
25
OMK6
Thom Bến Lức
Long Định
50
OMK70
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL

22
Mẫu dùng để nghiên cứu trong đề tài này gồm 50 dòng dứa từ giống Cayenne
trong đó có một số ít dòng dứa thuộc giống Queen để làm đối chứng. Những dòng dứa
này được thu thập từ nhiều vùng khác nhau và trồng tại Viện Lúa Đồng Bằng Sông
Cửu Long, Ô Môn , TP Cần Thơ. Danh sách được trình bày ở bảng 3.1.
Trong tập đoàn dứa khảo sát thì các dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội được xử
lý đồng loạt và đem ra trồng từ dạng nuôi cấy mô, các dòng dứa còn lại được trồng ở
dạng hom có chiều dài khoảng 15 cm.

3.2.2. Dụng cụ và hóa chất
- Máy thanh trùng (autoclave), máy Waterbath, lò vi sóng
- Tủ lạnh 4
0
C và - 20
0
C
- Tủ sấy 37
0

C
- Cân, máy đo pH

3.2.2.1. Dụng cụ và hóa chất ly trích DNA
- Đĩa nghiền: phá vỡ màng tế bào, tube 1,5 ml, micropipet: 1 µl – 1000 µl
- Máy li tâm (Biofuge pico - Heraeus)
- Chloroform : iso amylalcohol (24:1) (Đức)
- Isopropanol (Đức)
- Ethanol 100 % và 70 % (Đức)
- Dung dịch đệm ly trích DNA
Bảng 3.2: Thành phần dung dịch đệm ly trích DNA
Thành phần
Nồng độ stock
Nồng độ cuối
Thể tích
Tris (pH8.0)
1 M
100 mM
5 ml
EDTA
0,5 M
20 mM
2 ml
NaCl
5 M
500 mM
5 ml
Nuớc cất

38 ml
Tổng cộng


50 ml
Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh tổn hại DNA
EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) (Mỹ): tạo phức Mg
++
, gây bất hoạt
enzyme phân hủy DNA trong quá trình tách chiết

23
SDS: (sodium dodecy sulphate) 20 % (Đức): phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào,
màng nhân để phóng thích DNA
- Dung dịch CTAB (Cetultrimethylammonium bromide): dùng để kết tủa
polysaccharide và tạp chất khác.
10 g CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) (Mỹ)
100 ml NaCl 0,5 M
- Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) pH 8.0 (Mỹ)
Bảng 3.3: Thành phần dung dịch đệm TE
Thành phần
Nồng độ stock
Nồng độ
Thể tích
Tris (pH 8.0)
1 M
10 mM
0,5ml
EDTA
0,5 M

0,5 mM
O,1ml
Nước cất


49,4ml
Tổng cộng


50,0ml

3.2.2.2. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện điện di trên gel agarose
- Máy điện di loại nằm ngang (Gibco BRL model 4001 - Life technologies)
- Máy chụp hình gel bằng tia UV
- Agarose (Mỹ)
- Dung dịch TAE 50X
Bảng 3.4: Thành phần dung dịch TAE 50X
Thành phần
Thể tích 1 lít
Tris base 2M
242 g
Glacial acetic acid
57,1 ml
EDTA 0,5 M, pH 8.0
100 ml

- Ethidium bromide
- DNA ladder làm thang chuẩn
- DNA loading buffer

24
Bảng 3.5: Thành phần dung dịch loading buffer
Thành phần
Thể tích
Tris 1 M (pH=8.0)
0,5 M
Glycerol
5,0 ml
EDTA 0,5 M (pH=8.0)
100 l
Xylen Cyanol 0,2 %
15 mg
Bromophenol blue 0,2 %
15 mg
Nước cất
4,5 ml
Tổng cộng
50 ml

3.2.2.3. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện phản ứng chuỗi PCR
- Máy thermal cycler (Biorad)
- Mẫu DNA ly trích
- Dung dịch stock của dNTPs (5 mM).
- Dung dịch stock của PCR buffer (10X).
Bảng 3.6: Thành phần dung dịch đệm PCR 10X
Thành phần
Nồng độ

Nồng độ cuối
Thể tích
Tris (pH 8.3)
1 M
200 mM
1,0 ml
KCl
1 M
500 mM
2,5 ml
MgCl
2

150 mM
15 mM
0,5 ml
Gelatin

0,01 %
0,5 ml
Nước cất


1,0 ml
Tổng cộng


5,0 ml

- Primer: 13 primer được sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của dứa có

kích thước 10 nucleotide từ các bộ kit của hãng Operon tổng hợp từ Nhật, pha dung
dịch kit tại Viện Lúa ĐBSCL.
- Taq polymerase tổng hợp : sản xuất tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long .




25
3.3. Phƣơng Pháp
3.3.1. Đánh giá kiểu hình
Tập đoàn 50 dòng dứa Cayenne được trồng trong đều kiện tự nhiên, không xử
lý ra hoa và tiến hành đo các đặc tính nông học trong cùng thời gian ở giai đoạn các
cây trưởng thành và bắt đầu cho hoa. Thí nghiệm được bố trí ngẩu nhiên hai lần lập
lại, cách đo được tiến hành như sau:
- Chiều cao cây (cm) đo từ mặt đất đến đỉnh của lá.
- Chiều rộng cây (cm) đo khoảng cách lá vươn rộng ra hai bên.
- Chiều dài lá (cm) đo ngẫu nhiên 3 lá trên / 1 cây, chiều rộng lá đo phần rộng của
lá.
- Số lá: thiết lập đo và điếm từng lá trên một cây.
- Ngày trổ hoa: tính từ ngày trồng cho đến khi cây có hoa và nhú trái.
- Trọng lượng trái (kg) đo lúc trái được thu hoạch.
- Quan sát hình dạng lá có gai, không gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở
một số vị trí trên lá như ngọn, gốc hoặc giữa lá) và màu sắc lá ghi nhận ở những mức
độ màu khác nhau.
Phân tích số liệu thu thập thông qua phần mềm IRRISTAT vesion 3.0 và sau đó
phân tích nhóm dựa vào chương trình NTSYS (Numercial Taxonomy System) version
2.1. Để phân tích nhóm dựa vào số liệu (numercial classficatory analysis), ta sử dụng
hệ số CORR (Pearson product-moment correlation coefficient) như là đơn vị để tính
sự tương quan giữa các dòng dứa dựa vào tính trạng hình thái và giá trị CORR được
tính toán theo Sneath và Sokal (1973). Dựa trên ma trận tương quan (Correlation

matrix), sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan được xây dựng theo phương pháp
UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average), một trong những
mô hình phân tích nhóm SAHN (sequential, agglom-erative, hierarchic, non-
overlapping) (Sneath và Sokal, 1973).

3.3.2. Đánh giá kiểu gen
3.3.2.1. Tách chiết DNA
DNA của dứa được tách chiết theo quy trình CTAB (Cetultrimethylammonium
bromide) cải tiến (Nguyễn Thị Lang, 2002). Phương pháp này đặc biệt ổn định cho ly
trích DNA từ mô thực vật giàu polysaccharide (Sun và ctv, 1994), cho DNA chất

26
lượng cao, tốn nhiều thời gian nhưng rẻ tiền hơn so với nhiều phương pháp khác
(Henry T Nguyen, 1998). Quy trình gồm những bước sau:
- Bước 1: Chọn và thu mẫu lá dứa (50 mẫu), chọn lá khỏe, non (2 cm) đặt vào ống
tube và ghi nhãn cẩn thận. Ống tube chứa mẫu được giữ trong thùng đá lạnh.
- Bước 2: Lá sẽ được rửa sạch, cắt nhỏ và đặt vào đĩa (spot test plate).
- Bước 3:Thêm vào đĩa 660 µl dung dịch đệm ly trích DNA (DNA extraction
buffer) (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 500 mM NaCl ). Nghiền các mô lá
với chài (dụng cụ này phải được khử trùng bằng cồn và lau sạch trước khi sử dụng).
- Bước 4: Tiếp tục nghiền đến khi dung dịch có màu xanh đó là dấu hiệu tế bào bị
phá vỡ và phóng thích diệp lục. Dung dịch nghiền xong phải đặt vào đá khoảng 30
phút.
- Bước 5: Thêm vào 660 l dung dịch tách chiết, trộn đều và chuyển 660 l dịch
nghiền vào một tube sạch với thể tích là 1,5 – 2 ml đã được ghi nhãn cẩn thận.
- Bước 6: Thêm 40 l SDS 20 % trộn đều và khéo léo, sau đó ủ trong water bath
và lắc đều 10 phút ở nhiệt độ 65
0
C.
- Bước 7: Thêm vào dung dịch 100 l NaCl 5M và trộn thật kỹ. Thêm tiếp 100 l

CTAB. Ủ dung dịch 10 phút ở nhiệt dộ 65
0
C.
- Bước 8: Thêm 900 l Chlorofom: iso amylalcohol (24:1) trộn đều và đem ly tâm
trong 3 phút với tốc độ 13.000 vòng / phút.
- Bước 9: Chuyển dịch nổi vào một tube mới 1,5 – 2 ml và thêm vào 600 l
isopropanol trộn đều, tiếp tục ly tâm trong 5 phút với tốc độ 12000 vòng / phút. Sau
khi ly tâm, đổ bỏ phần dung dịch phía trên.
- Bước 10: Rửa phần kết tủa còn lại với cồn 70 % và phơi khô.
- Bước11: Hòa tan DNA với 50 l TE . Giữ ở nhiệt độ -20
0
C.

3.3.2.2. Kiểm tra chất lƣợng DNA
Kiểm tra chất lượng DNA đã ly trích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0.8
% trong dung dịch TAE 1X.
Nhuộm gel với Ethidium bromide và chụp hình qua hệ thống gel document.
 Chuẩn bị gel agarose để điện di DNA
- Chuẩn bị dung dịch TAE 1X, cho dung dịch TAE 1X vào hộp điện di.

27
- Pha dung dịch agarose 0,8 %, gồm agarose và dung dịch TAE 1X
- Đun sôi dung dịch agarose trên lò viba đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá
trình đun mất nhiều nước thì cần bổ dung thêm dung dịch TAE 1X cho đủ nồng độ yêu
cầu.
- Để lên máy lắc cho dung dịch tan đều. Đợi đến khi nhiệt độ dung dịch agarose
xuống còn 55
0
C thì đổ vào khai điện di có cài sẳn lược. Chiều dày gel khoảng 5 mm là
thích hợp (Nguyễn Thị Lang, 1999).

- Sau khi gel cứng, di chuyển lược ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa TAE
1X sau cho gel ngập trong dung dịch. Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí.
 Tiến hành chạy điện di
- Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể
tích khoảng 2 l). Cho thêm 10 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều. Dùng
pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di.
- Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 100 mA, định thời
gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng).
- Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia UV.
Chú ý thao tác này phải thật cẩn thận bởi hoá chất nhuộm rất độc, dễ gây ung thư.

3.3.2.3. Tiến hành PCR cho phản ứng RAPD
 Trộn dung dịch PCR
Cho các thành phần dung dịch sau vào các tube PCR đã được đánh mã số:
- DNA 1,0 l (tuỳ thuộc vào nồng độ DNA).
- Dung dịch đệm PCR 10X 2,0 l.
- dNTP 2,0 l.
- Primer cần sử dụng trong mỗi phản ứng 1,0 l.
- Taq polymerase 0,5 l.
- Thêm nước cất 2 lần cho đủ 20,0 l.
Trộn đều, thêm giọt dầu (mineral oil) để tránh bay hơi, đậy nắp tube lại và cho vào
máy PCR đã cài sẳn chu trình nhiệt.



28
Bảng 3.7: Thành phần hỗn hợp dung dịch chạy PCR
Thành phần
Nồng độ
Nồng độ sau cùng

Thể tích ( l)
PCR buffer
10X
1X
2
dNTP
1 mM
100 M
2
Primer
5 M
0,25 M
1
Taq polymerase
5 unit / l
0,1 unit / l
0,5
DNA
25 ng / l
1,25 ng / l
1
H
2
O


13.5
Tổng cộng

20,0

 Chạy chương trình PCR
Sau khi lấy đủ các thành phần vào tube PCR, ta tiến hành chạy phản ứng với
các bước tiến hành (Nguyễn Thị Lang, 2002) như sau:
- Bước 1: Làm biến tính DNA ban đầu ở 94
0
C trong 5 phút.
- Bước 2: Biến tính DNA tiếp theo ở 94
0
C trong 30 giây
- Bước 3: Tiến hành lai primer và DNA ở 37
0
C trong 30 giây
- Bước 4: Tổng hợp ở 72
0
C trong 1 phút.
- Bước 5: Lặp lại bước 2 - 4 trong 36 lần.
- Bước 6: Tổng hợp lần cuối ở 72
0
C trong 5 phút.
- Bước 7: Giữ lạnh ở 4
0
C.
Bảng 3.8: Chƣơng trình chạy PCR cho RAPD marker
Chƣơng
trình
Kiểu
Giai đoạn1
Giai đoạn 2

Giai đoạn 3
Số
chu kì


Nhiệt
độ
Thời
gian
Nhiệt
độ
Thời
gian
Nhiệt
độ
Thời
gian

1
Chu kỳ
94
0
C
5 phút




1
2

94
0
C
30 giây
37
0
C
30 giây
72
0
C
1 phút
35-36
3

72
0
C
5 phút




1
4

4
0
C

29
 Kiểm tra và phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1.5 %
Hút 10 l sản phẩm PCR và tiến hành chạy điện di trên gel agarose 1.5 % để
kiểm tra sản phẩm. Trong khi cho sản phẩm PCR vào, ta nên để lại một giếng trên bản
gel để nạp DNA ladder vào với số lượng là 3 l. Phương pháp tiến hành giống như
kiểm tra sản phẩm DNA .
Sản phẩm PCR sau khi điện di sẽ được chụp trên hệ thống gel document, những
băng DNA có khuếch đại sẽ hiện lên trên bản gel nhờ nhuộm với ethiumbromide. Ta
sẽ ghi nhận lại những băng DNA và đem xử lý trên chương trình NTSYSpc.

3.3.2.4. Phân tích dữ liệu PCR bằng phần mềm NTSYSpc (Rolfh)
Phân tích đa dạng nguồn gen theo phần mềm NTSYSpc là chương trình phần
mềm do Rohlf (1992) thiết kế dùng để tìm kiếm và thành lập kiến trúc những dữ liệu
có nhiều biến. NTSYS (Numercial Taxonomy System) là hệ thống phân loại số trong
nghiên cứu đa dạng quần thể ở mức độ DNA, dựa vào kết quả từ phương pháp in dấu
vân tay DNA (DNA fingerpringting). Các băng được nhập vào chương trình theo quy
tắc: nếu không có băng DNA sẽ ghi 0, nếu có băng ghi 1. Số liệu này sẽ được sử dụng
để xây ma trận tương đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance
matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các
mẫu phân tích và được xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979):
S

xy
=2 xy / x + y
- Xy: số băng giữa hai mẫu.
- X: số băng của mẫu x.
- Y: Số băng của mẫu y.
- Sxy: Hệ số tương đồng giữa 2 mẫu x và y.
Từ S
xy
ta tính được khoảng cách di truyền giữa x và y
D
xy
= 1 - S
xy

Trên cơ sở toán học này, các nhà toán học đã xây dựng các phần mềm
WINDIST và NTSYS cho máy tính. Chương trình WINDIST tạo ra ma trận tương
đồng từ bộ dữ liệu nhập sẵn. Chương trình NTSYS version 2.1 tạo ra sơ đồ hình cây
phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Kangle Zheng và ctv,

30
1995). Hiện nay 2 chương trình WINDIST và NTSYS được gộp lại thành chương trình
package-NTSYS để tiện dụng hơn.
 Cách nhập số liệu
Dữ liệu thu được từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excell theo những qui định
chung. Nếu như sản phẩm có băng hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện
diện băng. Sau khi nhập số liệu, ở hàng đầu tiên chúng ta ký hiệu là 1 (đối với ma trận
hình chữ nhật), cột thứ hai ghi số hàng, cột thứ ba ghi số cột, và cột thứ tư ghi số 0 nếu
không có số liệu thiếu. Sau đó, bản số liệu trong excell sẽ được dùng để xây dựng ma
trận tương đồng trong phần mềm NTSYS-pc version 2.1.

3.3.3. Ƣớc đoán độ chính xác giữa phân nhóm di truyền dựa vào dữ liệu kiểu
hình và kiểu gen
Độ chính xác trong phân nhóm dựa trên kiểu hình và kiểu gen được đánh giá
thông qua kiểm tra ManTel (Mantel, 1967) với phương pháp Mxcomp (Matrix
comparison) từ chương trình xử lý NTSYSpc version 2.1.

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Đánh giá đa dạng nguồn gen dựa vào dữ liệu kiểu hình
Qua quan sát và ghi nhận những đặc tính nông học bao gồm chiều cao cây,
chiều rộng tán, chiều rộng lá, chiều dài lá, số lá trên bụi, hình dạng lá, màu sắc lá, thời
gian trổ hoa và năng suất trái của tập đoàn dứa Cayenne với 50 dòng khác nhau về đều
kiện địa lý đã cho thấy sự đa dạng về kiểu hình giữa các dòng dứa trong cùng một
giống với nhau. Những số liệu thu nhận được từ những chỉ tiêu hình thái đều khác biệt
có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 1 % (phụ lục I). Độ đa hình giữa các
nhóm trong giống được đánh giá theo phân tích nhiều biến (Multivariate analysis) và
phân tích phân biệt (Discriminant analysis). Kết quả phân tích này được trình bày
trong bảng 4.1, trong đó chỉ tiêu ngày trổ hoa và năng suất chỉ tính trên những dòng
cho trái và thu hoạch trái vào thời điểm khảo sát.