Luận văn : Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan - Việt Nam part 5 docx

41

Hình 4.5: Sự sinh trƣởng hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum
trên môi trƣờng nhân giống
4.2.3. Sự sinh trƣởng sợi nấm Amauroderma subresinosum trên môi trƣờng
lỏng
Bảng 4.3: Khả năng tích lũy sinh khối hệ sợi nấm Amauroderma
subresinosum trên môi trƣờng lỏng
Thời gian (ngày)
Sinh khối (gam)
10
0,283 ± 0,02
15
0,38 ± 0,017
20
0,492 ± 0,023
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
N10 N15 N20
Ngày
Trọng
lượng
(g/ngày)

Biểu đồ 3: Khả năng tích lũy sinh khối nấm Linh chi đen trên

môi trƣờng lỏng

Nhận xét: Hai ngày sau khi cấy giống vào, hệ sợi nấm nổi lên bề mặt môi
trường, là một khối màu trắng và lan đều xung quanh gốc cấy ban đầu. Trong quá trình
tăng sinh khối, hệ sợi tiết ra sắc tố màu nâu - đỏ và sắc tố đậm dần theo thời gian nuôi

42
cấy. Những dẫn liệu ở bảng 4.3 cho thấy: Từ lúc cấy giống cho đến thời điểm 10 ngày
sợi nấm tăng trưởng nhanh, từ 10 – 20 ngày kế tiếp sợi nấm tăng trưởng chậm dần.

Hình 4.6: Sinh khối sợi nấm Amauroderma subresinosum trên
Môi trƣờng lỏng sau 10 ngày
4.2.4. Sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh chi đen trên môi trƣờng giá thể
mạt cƣa cao su
Tại Việt nam có nhiều triển vọng cho việc nuôi trồng nấm Linh chi do có nguồn
nhân lực dồi dào, các phế thải nông, lâm, công nghiệp đang còn tồn đọng và gây ô
nhiễm môi trường. Như vậy khi phát triển nghề trồng nấm nói chung và nấm Linh chi
nói riêng, không chỉ cung cấp nguồn dược liệu quí mà còn góp phần làm sạch môi
trường sống, bảo vệ sức khoẻ cho chúng ta.
Mạt cưa được sử dụng làm môi trường giá thể và chúng có hàm luợng cacbon
rất cao. Tuy nhiên, mạt cưa là nguyên liệu nghèo chất dinh dưỡng. Do đó để nâng cao
hiệu suất nuôi trồng nấm cũng như rút ngắn thời gian nuôi trồng thì cần thiết phải trộn
thêm nhiều chất bổ sung. Chất bổ sung chủ yếu thường là cám gạo, cám bắp, bột
khoai,… Các nguyên liệu này sẽ cung cấp vitamin hay acid amin cho hệ sợi nấm sinh
trưởng nhanh. Ngoài ra, các loại phân hóa học như: Urê, DAP, NPK,… cũng được sử
dụng rất nhiều trong nuôi trồng. Thực tế cho thấy khi bổ sung nguồn nitơ với hàm
lượng rất thấp nhưng lại có tác dụng tốt rõ rệt đối với sự phát triển của nấm. Chúng tôi
đã tiến hành khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) trên
giá thể mạt cưa cao su, sử dụng bịch PP kích thước 15 x 25 cm và chứa 180 gam cơ
chất khô/bịch với qui trình như sau:

43

Hình 4.7:Qui trình nuôi trồng nấm Linh chi đen
Qua quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy rằng pha ủ sợi kéo dài khoảng 25 –
27 ngày, khi hệ sợi bắt đầu bện kết, đưa các bịch nấm đã mọc trắng lên phòng nuôi,
tiến hành tưới phun sương để duy trì độ ẩm 80 – 95%, ánh sáng nhẹ (700 – 800 lux),
độ thông khí cao. Pha phát triển thể quả: ngày thứ 38 – 40 thì mầm quả thể bắt đầu
Cơ chất trồng nấm
Mạt cưa cao su
Ống thạch giống
Bịch mạt cưa đã khử
trùng
Chai lúa giống
(meo hạt)
- Rây (sàng) bỏ dăm bào
- Trộn nước vôi 0,25%
- Ủ đống qua đêm
- Thêm dinh dưỡng
- Bảo quản giống: Khi hệ sợi
nấm đầy ống nghiệm, tiến hành
cấy chuyền giống qua ống thạch
mới.
- Cấy một ít hệ sợi nấm sang
môi trường lúa để tạo một lượng
giống lớn cho giai đoạn trồng
trên cơ chất mạt cưa.
Cấy
giống
- Vào túi màng mỏng PP

- Thanh trùng ở 100
o
C
trong 5 giờ
Bịch phôi
-Nuôi ủ cho hệ sợi nấm
đầy bịch

Quả thể nấm
- Tháo nút bông
- Chuyển sang nhà tưới, duy trì độ ẩm
85 – 95%
- Nhiệt độ 26 – 35
o
C
- Ánh sáng tán xạ (700 – 800 lux)

Nấm khô
-Cắt gốc thu tai nấm
-Sấy khô ở nhiệt độ 50
o
C trong 5
giờ

44
hình thành, ngày thứ 50 – 80 thì mầm nấm đang trong giai đoạn tăng trưởng và từ
ngày 120 – 150 quả thể nấm bắt đầu già, có thể thu hái quả thể.
Trong quá trình chăm sóc cần tưới nước dạng phun sương đều đặn, đảm bảo độ
ẩm, nhiệt độ, khống chế ánh sáng và tránh gây tổn thương cơ học do ruồi, muỗi, chích
hút…. Đặc biệt trong giai đoạn phát triển của thể quả nếu nhiệt độ cao, cường độ ánh

sáng mạnh, phòng nuôi có độ thoáng khí kém sẽ gây ức chế sự hình thành và phát triển
của quả thể. Vì vậy trong quá trình nuôi trồng nên giữ nhiệt độ thích hợp, tưới nước
thường xuyên để tạo độ ẩm luôn cao, thiết kế trại nuôi trồng ở nơi mát mẻ và có độ
thông khí cao, chỉ nên cho nấm tiếp xúc với nguồn sáng khuyếch tán có cường độ
khoảng 700 – 800 lux, tránh sự xâm nhập của côn trùng hay các tác nhân gây tổn
thương cho quả thể nấm. Sau khi thu hái cần có phương pháp bảo quản quả tốt hay chế
biến ngay để bảo đảm chất lượng và độ cảm quan của nấm.


Hình 4.8: Bố trí thí nghiệm

4.2.4.1. Giai đoạn sinh trƣởng sợi nấm Linh chi đen
Sau khi sợi nấm mọc trắng túi, trên mặt môi trường có các khối nhỏ trắng đó là
mầm quả thể, lấy nút bông ra tăng cường tưới nước giữ độ ẩm 85 – 95%, nhiệt độ 26 –
28
o
C, để trong điều kiện ánh sáng tán xạ, thông thoáng gió. Khi thu hái ta có thể nhổ
cả cuống lẫn tán, hong khô hoặc sấy ở nhiệt độ thấp.

45
80.77
98
69.23
90.39
59.61
92.31
73.08
30.77
25
80.13

0
20
40
60
80
100
120
MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10
Tỷ lệ sinh
trưởng (%)

Biểu đồ 4: Tỷ lệ sinh trƣởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên môi trƣờng mạt cƣa

Nhận xét: Tỷ lệ sinh trưởng hệ sợi nấm ở môi trường 3, 5 và 7 nhanh hơn các
môi trường còn lại. Điều này chứng tỏ nguồn đạm SA, N-P-K202015, cám bắp được
sợi nấm hấp thu dễ dàng so với các nguồn dinh dưỡng khác. Trái lại tỷ lệ sinh trưởng
của sợi nấm ở môi trường 9 và10 rất chậm, nguyên nhân có thể là do nguồn cám gạo
và urê được nấm hấp thu chậm hơn.
Như vậy ta nên lựa chọn môi trường giá thể nào giúp cho sợi nấm sinh trưởng
nhanh và hạn chế sự phát sinh của các loài nấm gây bệnh. Đồng thời, thời gian xuất
hiện quả thể trên môi trường phải sớm. Trong quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy
hệ sợi nấm trên môi trường 3 sinh trưởng rất tốt, 98% các bịch có hệ sợi phủ kín bịch
chỉ sau 20 ngày.
4.2.4.2. Giai đoạn phát triển quả thể nấm Linh chi đen
Sau khi hệ sợi nấm phủ đầy bịch (giai đoạn sinh trưởng), chúng bắt đầu chuyển
sang giai đoạn phát triển. Trong giai đoạn mới, hệ sợi nấm đan vào nhau và bắt đầu kết
mầm nấm. Chúng tôi nhận thấy, thời gian kết mầm ở môi trường 3, 5 và 7 vào khoảng
40 – 45 ngày, riêng các môi còn lại thì thời gian kết mầm tương đối lâu 45 – 55 ngày.
Nhìn chung các bịch môi trường sau khi cấy giống vào đều xuất hiện mầm quả thể và
thời gian xuất hiện mầm giữa các môi trường chênh lệch nhau 10 – 15 ngày.

46
Khi hệ sợi không bện kết được ở đầu cổ bịch phôi, phải dùng dao tạo vết rạch ở
đáy hoặc ở gốc bịch giúp cho mầm nấm xuất hiện. Vết rạch quá sâu và miệng rạch hở
trên thành bịch dẫn đến nhiễm mốc hoặc làm vị trí rạch bị khô. Trong quá trình nuôi
trồng, hầu hết các môi trường có hiện tượng sợi nấm không bện kết ở đầu cổ bịch phôi.
Nguyên nhân có thể do điều kiện ngoại cảnh chưa phù hợp cho sự sinh trưởng và phát
triển loài Linh chi này. Như vậy, sau khoảng 3 – 5 ngày tạo vết rạch thì trên các bịch
phôi xuất hiện mầm nấm.
Hệ sợi bện kết Mầm nấm
(Sau 50 – 55 ngày) (Sau 60 – 70 ngày)



Mầm nấm tăng trƣởng Quả thể nấm
( Sau 80 – 85 ngày) (Sau 95 -100 ngày)



Hình 4.9: Quá trình hình thành và tăng trƣởng quả thể nấm
Amauroderma subresinosum
Theo dõi quá trình tạo quả thể nấm Linh chi đen, chúng tôi nhận thấy hình
dạng quả thể ở các môi trường rất đồng nhất: quả thể nấm hình quạt, cuống ngắn.
Riêng quả thể ở môi trường 4 và 6 không đồng nhất về kích thước, một số dị dạng.
4.2.4.3. Đánh giá hiệu suất sinh học trên các môi trƣờng giá thể mạt cƣa cao
su
Bảng 4.4: Hiệu suất sinh học đạt đƣợc trên các môi trƣờng giá thể mạt cƣa
Môi trường giá thể
Trọng lượng khô (gam)
Hiệu suất sinh học (%)

1
11,31 ± 1,32
12,44 ± 1,48
2
10,5 ± 0,78
11,54 ± 0,85
3
13,04 ± 1,66
14,36 ± 1,82
4
10,21± 1,0
11,22 ± 1,13

47
5
10,6 ± 0,26
11,66 ± 0,297
6
10,36 ± 0,83
11,38 ± 0,912
7
11,98 ± 1,15
13,2 ± 1,26
8
11,58 ± 0,81
12,46 ± 1,18
9
10,34 ± 0,59
11,38 ± 0,634
10

10,94 ± 0,76
12,04 ± 0,856
0
2
4
6
8
10
12
14
16
MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10
Hiệu suất
sinh học (%)

Biểu đồ 5: Hiệu suất sinh học nuôi trồng nấm Linh chi đen

Như vậy hiệu suất sinh học thu được ở môi trường 3 cao nhất (14,36%), ở môi
trường 4 thấp nhất (11,22%) và hiệu suất sinh học đạt được ở các môi trường thí
nghiệm đều cao hơn 11%.

Hình 4.10: Quả thể nấm Amauroderma subresinosum sau 120 ngày

MT- 7
MT - 8
MT - 3

48

Hình 4.11: Kết quả nuôi trồng nấm Amauroderma subresinosum

4.3. Xác định dƣợc chất có trong hệ sợi nấm và quả thể nấm Linh chi đen
4.3.1. Định tính alcaloid
Cho dịch chiết bột nấm Linh chi đen tác dụng với thuốc thử Mayer thì nhận
thấy xuất hiện kết tủa vô định hình màu trắng ngà.
Ống 1(đối chứng): Dịch chiết với nước acid
Ống 2: Dịch chiết với nước acid + thuốc thử Mayer
Ống 3: Nước cất + thuốc thử Mayer
1 2 3

Hình 4.12: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer
Cho dịch chiết bột nấm Linh chi đen tác dụng với thuốc Dragendorff thì nhận
thấy có xuất hiện kết tủa màu cam - nâu ở dạng tủa bông và từ từ lắng xuống đáy ống
nghiệm.
Ống 1 (đối chứng): Dịch chiết với nước acid
Ống 2: Dịch chiết với nước acid + thuốc thử Dragendorff
Ống 3: Nước cất + thuốc thử Dragendorff
1 2 3




Hình 4.13: Định tính alcaloid với thuốc thử Dragendorff

49
Nhận xét: Dịch chiết nấm Linh chi đen ở phần 1 đem thử nghiệm với 2 loại
thuốc thử Mayer và Dragendorff thì nhận thấy kết quả là dương tính. Đối với dịch
chiết ở phần 2 đem thử nghiệm thì kết quả là âm tính:
Bột dược liệu trích với nước – acid: có thể trích hết tấc cả các alcaloid ở dạng
baz tự do (N sẽ biến thành NH

+
tan trong nước), alcaloid dạng thứ cấp N
+
, dạng N –
oxid (N
+
-> O), dạng glycosid, alcaloid loại có tính phân cực mạnh, nhưng sẽ trích
luôn những hợp chất có chứa nitơ (protein, glycoprotein, nucleotide)… là những hợp
chất tuy không phải là alcaloid nhưng có thể cho kết quả dương tính với thuốc thử.
Bột dược liệu trích với dung môi hữu cơ – kiềm sẽ không trích được những
alcaloid dạng N – oxid, dạng N tứ cấp, dạng tan tốt trong nước. Phương pháp này trích
tốt các alcaloid dạng baz tự do có tính phân cực kém và tính baz yếu, cũng như các
alcaloid có cấu trúc đặc thù –C=C –N – .
Như vậy hoạt chất alcaloid không có trong quả thể nấm Linh đen hoặc có với
hàm lượng cực thấp mà phản ứng định tính không thể quan sát được.
4.3.2. Định tính saponin
4.3.2.1. Thử nghiệm tính chất tạo bọt
Kết quả ghi nhận như sau:
Độ bền của bọt
Kết quả
Sau 15 phút
+
Sau 30 phút
++
Sau 60 phút
+++

Như vậy dược liệu từ sinh khối và quả thể nấm Linh chi đen có chứa hoạt chất
saponin
Ống 1: dịch chiết dược liệu sau khi lắc

Ống 2 (đối chứng): nước cất sau khi lắc
1 2






Hình 4.14: thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Linh chi đen



50
4.3.2.2. Thử nghiệm Fontan – Kaudel
Kết quả ghi nhận:
- Bọt trong cả 2 ống nghiệm bền hơn 15 phút
- Cột bọt trong ống nghiệm 3 cao hơn 3 lần cột bọt trong ống nghiệm 2.
Như vậy, trong môi trường kiềm bọt bền hơn trong môi trường acid. Sơ
bộ kết luận là có saponin steroid.
Ống 1(đối chứng) : nước cất
Ống 2 : dịch chiết bột nấm sau khi cho acid vào
Ống 3 : dịch chiết bột nấm sau khi thêm baz vào
1 2 3

Hình 4.15: Thử nghiệm saponin toàn phần theo Fontan – Kaudel

4.3.3. Định tính triterpenoid
Kết quả thí nghiệm nhận thấy sinh khối và quả thể nấm Linh chi có chứa hoạt
chất triterpenoid (môi trường chuyển sang màu xanh lục sau khi cho acid H
2

SO
4
đậm
đặc vào từ từ).
Ống 1(đối chứng): nước cất + acid
Ống 2: Dịch chiết + acid đậm đặc
1 2

Hình 4.16: Định tính triterpenoid bằng phản ứng Liebermann – Burchard

4.3.4. Định tính acid hữu cơ
Sau khi cho dịch chiết nước bột nấm Linh chi đen tác dụng với tinh thể Na
2
CO
3

và hơ nóng thì nhận thấy có bọt khí xuất hiện và bay ra. Như vậy, dịch chiết nước từ
quả thể nấm Linh chi đen có chứa thành phần acids hữu cơ.