Luận văn : BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR part 6 ppt

52

52

- Kết quả thí nghiệm được hiển thị ở mục Data Analysis. Trong trường hợp
phân tích một kết quả thí nghiệm cũ, chọn mục Library và chọn chương
trình chạy trong mục View Post-Run Data.


Hình 3.5: Màn hình View Post-Run Data
- Phân tích kết quả trên màn hình DNA Quantification (chế độ Normal View).
Các thao tác phân tích được tiến hành như sau:
Loại trừ tín hiệu nền trên đồ thị bằng cách chọn Background
Subtracted ở mục Select analysis mode.
Phân tích đường đồ thị bằng cách chọn mục PCR Base line
Subtracted.
Xác định chu kỳ ngưỡng (Threshold Cycle Calculation): Tính toán
giá trị chu kỳ ngưỡng, bao gồm hai mục nhỏ: Baseline Cycles (xác
định chu kỳ thu nhận tín hiệu huỳnh quang làm tín hiệu nền),
Threhold Position (xác định vị trí chu kỳ ngưỡng). Cả hai mục này
đều cho phép 2 chế độ: Auto Calculated (máy tự động thiết lập), User
Defined (người dùng tự thiết lập).
- Xây dựng đường chuẩn ở mục PCR Standard Curve dựa trên các mẫu chuẩn
với các thông số đã biết. Ta cần xác định các thông số tốt nhất cho đường
chuẩn bao gồm:
Thông số giá trị tương quan r
2
(Correlation Coefficient): thông
thường phải đạt trên 0,98.
Hiệu quả PCR (PCR efficiency) phải trong mức 80%-120%.
53

53


Hình 3.6: Màn hình PCR Quantification
- Xác định các kết quả tính toán: Dựa trên đường chuẩn đã xây dựng, ta xác
định các giá trị của mẫu chưa biết như: số lượng copy ban đầu, độ lệch
chuẩn


Hình 3.7: Màn hình PCR Standard Curve

- Phân tích Melt Curve: Phân tích nhiệt độ nóng chảy, dùng trong trường hợp
Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I. Chúng tôi tiến hành như
mục 5.5.3.
54

54

Như vậy, các kết quả thí nghiệm 3 cho phép chúng tôi so sánh hai phương pháp
định lượng bằng kỹ thuật Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I hay mẫu dò
Taqman. Phương pháp đề nghị sẽ được ứng dụng cho các thí nghiệm về sau.

8. Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time
PCR.
Mục tiêu
Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR được đề nghị
ở thí nghiệm 3 qua các chỉ tiêu: độ nhạy, độ chính xác.

Nguyên tắc

- Độ nhạy của phƣơng pháp: Được xác định qua số lượng bản copy
promoter 35S hiện diện thấp nhất trong mẫu thí nghiệm mà phương pháp đề
nghị có thể phát hiện và định lượng.
- Độ chính xác: được thể hiện qua khả năng định lượng chính xác một mẫu
thực vật biến đổi gen đã biết trước tỷ lệ % chuyển gen (Bắp Bt 176 1%).
Vật liệu thí nghiệm
- Chuẩn 35S của công ty GeneScan.
- Bắp chuyển gen Bt 176 với tỷ lệ phần trăm chuyển gen là 1% (GeneScan).

Trang thiết bị
Tương tự thí nghiệm 3.

Hóa chất
- GMO Quant 35S Screen Corn Kit Cat. No. 512 12006 10 (GeneScan). Gồm
có:
35S master mix (2 x 50 phản ứng)
Gen tham chiếu (Corn-reference) master mix (2 x 50 phản ứng)
Chuẩn 35S
Chuẩn gen tham chiếu (corn-reference)
DNA bắp chuyển gen Bt176 1%
55

55

- Nước siêu sạch.

Đặc điểm 35S và corn-reference master mix
Các master mix này được dùng cho các phản ứng định lượng bắp chuyển gen có
chứa promoter 35S trong thực phẩm.
35S master mix chứa các thành phần cần thiết cho việc phát hiện đặc hiệu trình

tự promoter CaMV 35S hiện diện trong một số giống bắp chuyển gen phổ biến hiện
nay.
Gen tham chiếu (Corn-reference) master mix có chứa tất cả các thành phần cần
thiết cho việc phát hiện gen tham chiếu trong cả bắp chuyển gen và không chuyển gen.
Cả hai hệ thống đều sử dụng mẫu dò (probe) có gắn chất phát quang FAM 490.

Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference
calibration DNA standards)
Bảng 3.12: Lƣợng lý thuyết (Số lƣợng phân tử) của hai chuẩn
Chuẩn
Lƣợng lý thuyết (Số lƣợng phân tử)
(copy)
35S
Gen tham chiếu
Chuẩn 1
Chuẩn 2
Chuẩn 3
Chuẩn 4
40960
5120
640
80
5120
640
80
10

Các chuẩn này giúp cho việc xác định đường chuẩn phục vụ cho việc định
lượng DNA.

Phƣơng pháp thực hiện
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng định lượng của
phương pháp Real-Time PCR được đề nghị ở thí nghiệm 3.
56

56

Bố trí thí nghiệm
Độ nhạy phản ứng
Thể hiện thông qua khả năng phát hiện và định lượng promoter 35S hiện diện
trong mẫu ở số lượng thấp nhất có thể. Để thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi định
lượng mẫu có số lượng 1 copy gen đích.

Bảng 3.13: Xác định độ nhạy phƣơng pháp Real-Time PCR
Thành phần
Số lƣợng lý thuyết

Mẫu 1
1 copy

Độ chính xác:
Thể hiện thông qua khả năng định lượng chính xác mẫu có tỷ lệ phần trăm
chuyển gen được xác định trước. Mẫu được lặp lại nhiều lần nhằm đánh giá độ chính
xác của phương pháp. Các mẫu được sử dụng là bắp chuyển gen Bt 176 1% (biết trước
tỷ lệ).
- Mẫu bắp Bt 176 được định lượng để xác định lại tỷ lệ phần trăm chuyển
gen. Mẫu được lặp lại 2 lần

Thiết kế phản ứng định lƣợng
Thí nghiệm Real-time PCR được thiết kế như sau:

- 1 phản ứng PCR dùng phát hiện promoter 35S (trình tự DNA đặc trưng cho
GMO). Bao gồm:
4 phản ứng cho 4 chuẩn 35S, dùng để dựng đường chuẩn định lượng
p35S.
1 phản ứng cho đối chứng dương.
1 phản ứng cho đối chứng âm.
Các phản ứng cho mẫu thí nghiệm chưa biết.
- Phản ứng PCR thứ hai được thiết kế để xác định trình tự một gen đối chiếu,
đặc trưng cho loài và thường sử dụng cho định lượng GMO. Bao gồm:
57

57

4 phản ứng cho 4 chuẩn gen tham chiếu, dùng để dựng đường chuẩn
định lượng gen tham chiếu.
1 phản ứng cho đối chứng dương.
1 phản ứng cho đối chứng âm.
Các phản ứng cho mẫu thí nghiệm chưa biết.

Thành phần phản ứng Real-Time PCR

Bảng 3.14: Thành phần phản ứng Real-Time PCR trong thí nghiệm 4
35S
Gen tham chiếu
35S Master mix

Mẫu DNA
20 μl

5 μl

Corn-reference
Master mix
Mẫu DNA
20 μl

5 μl
Tổng cộng
25 μl
Tổng cộng
25 μl

Chƣơng trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR

Bảng 3.15: Chƣơng trình nhiệt của phản ứng Real-time PCR (mẫu dò Taqman)


Nhiệt độ
Thời gian
Đọc tín hiệu
huỳnh
quang
Giai đoạn 1
95
o
C
10 phút

Giai đoạn 2
- Bƣớc 1
- Bƣớc 2

Số chu kỳ

95
o
C
60
o
C
45

15 giây
1 phút


x
58

58

Phân tích kết quả
Các kết quả được phân tích tương tự như thí nghiệm 3. Chúng sẽ được so sánh
với các số lượng lý thuyết biết trước nhằm đánh giá khả năng của phương pháp.
Các kết quả thu nhận được sẽ được tính toán thành tỷ lệ phần trăm chuyển gen
trong mẫu, theo công thức:
% GMO= (số lượng promoter 35S/số lượng gen tham chiếu) x 100
Như vậy, kết quả của thí nghiệm này cho phép ta đánh giá được khả năng định
lượng của phương pháp. Các kết quả thu được giúp chúng tôi tiến hành ứng dụng
phương pháp này trên các mẫu sản phẩm trên thị trường.

9. Ứng dụng phƣơng pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trƣờng

Mục tiêu
Bằng phương pháp Real-Time PCR đề nghị, chúng tôi khảo sát tỷ lệ phần trăm
chuyển gen một số mẫu sản phẩm bắp có mặt trên thị trường. Các kết quả này cho ta
một cái nhìn tương đối về tình hình sản phẩm biến đổi gen tại Tp Hồ Chí Minh và
vùng phụ cận nơi thu nhận mẫu


Nguyên tắc
Các mẫu thu thập được định lượng gen tham chiếu của bắp và promoter 35S
bằng phương pháp Real-Time PCR. Các kết quả thu nhận được tính toán thành tỷ lệ
phần trăm chuyển gen của các mẫu trên.

Vật liệu thí nghiệm
- Đối chứng dương: Bắp chuyển gen Bt 176 1% (GeneScan).
- Đối chứng âm: Nước siêu sạch
- Các mẫu có kết quả sàng lọc dương tính bằng phương pháp đề nghị ở thí
nghiệm 2

Trang thiết bị và hóa chất
Tương tự thí nghiệm 4

59

59

Phƣơng pháp thực hiện
Bố trí thí nghiệm
Các mẫu thí nghiệm được lặp lại 2 lần trong cùng 1 thí nghiệm và lặp lại thí
nghiệm nhiều lần để đạt kết quả tốt nhất.

Thiết kế phản ứng định lƣợng
Tương tự thí nghiệm 4.

Thành phần phản ứng và chƣơng trình nhiệt thiết lập
Tương tự thí nghiệm 4.

Phân tích kết quả
Các kết quả thu nhận được tính toán theo công thức:
% GMO=(số lượng promoter 35S/số lượng gen tham chiếu)x100
Các kết quả này cung cấp cho ta tỷ lệ phần trăm chuyển gen của một số mẫu
bắp hiện diện trên thị trường. Các kết quả này có thể phục vụ cho các mục tiêu khảo
sát về sau.
60

60

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Khảo sát các quy trình ly trích DNA
Chúng tôi tiến hành khảo sát 3 quy trình ly trích DNA. Mỗi quy trình được lặp
lại 3 lần, mỗi lần 4 eppendorf. Các kết quả ly trích được đo OD ở các bước sóng 260
nm và 280 nm và được điện di trên gel agarose 2% nhằm đánh giá chất lượng và hàm
lượng DNA ly trích. Các kết quả thu nhận được như sau:





Hình 4.1: Kết quả điện di của 3 quy trình ly trích
Sau khi ly trích, chúng tôi đo OD các mẫu ở bước sóng 260 nm và 280 nm, tính

tỷ lệ OD
260nm
/OD
280nm
, xác định độ tinh sạch của mẫu DNA, và xác định lượng DNA
thu được từ 0,1 g mẫu. Các kết quả thu nhận được như sau:
Bảng 4.1: Kết quả đo OD 3 quy trình ly trích DNA
Quy trình
Số mẫu có tỷ lệ
OD
260/280
ngoài
khoảng 1,8-2
Số mẫu có tỷ lệ
OD
260/280
trong
khoảng 1,8-2
Phần trăm
mẫu tinh sạch
Lƣợng DNA
thu đƣợc từ 0,1
g mẫu (μg)
1
2
3
8
8
5
4

4
7
33.33
33.33
58,33
1.75 ± 0,45
5,04 ± 1,44
11,33 ± 1,58

Quy
trình 3
Quy
trình 2
Quy
trình 1
61

61

Chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:
- Quy trình 3 cho kết quả ly trích tốt nhất, số lượng mẫu tinh sạch cao, lượng
DNA thu được từ mẫu là cao nhất.
- Tác nhân phá màng: Không có sự khác biệt đáng kể giữa CTAB và SDS.
- Tác nhân thu tủa: Isopropanol cho kết quả thu tủa DNA tốt hơn ethanol
tuyệt đối.
- Điều kiện tủa DNA: Ly tâm ở nhiệt độ thấp cho kết quả thu tủa DNA tốt
hơn nhiệt độ bình thường.
- Số lần biến tính protein nhiều (quy trình 1 và 2) làm DNA bị mất và gãy
nhiều.
- Quy trình 3: Số lần biến tính thấp (2 lần) với tác nhân biến tính mạnh, đồng

thời giai đoạn thu tủa DNA được tiến hành trong nhiệt độ thấp nên lượng
DNA thu được là cao nhất so với 2 quy trình còn lại.
- Vì vậy, chúng tôi quyết định sử dụng quy trình 3 để ly trích DNA các mẫu
sản phẩm phục vụ cho các thí nghiệm sau.
Dựa trên quy trình ly trích đề nghị, chúng tôi tiến hành ly trích các mẫu sản
phẩm có được. Kết quả điện di 12 mẫu sản phẩm như sau:


Hình 4.2: Kết quả điện di các mẫu sản phẩm



62

62

Ghi chú:



Bảng 4.2: Kết quả tách chiết DNA các mẫu

STT
Kí hiệu mẫu
Lƣợng mẫu trích
một lần (mg)
Lƣợng DNA thu
đƣợc (µg) ± SD
1
2

3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
100 mg
100 mg
100 mg
100 mg
100 mg
100 mg
100 mg
100 mg

100 mg
100 mg
100 mg
100 mg
11,051 ± 0,25
11.08 ± 0.31
12,296 ± 1,61
11,4 ± 0,91
12,121 ± 1,76
12,01 ± 1,78
11,183 ± 0,281
0,829 ± 0,05
2,65 ± 0,17
2.68 ± 0,11
1,98 ± 0,18
0,845 ± 0,051


Chúng tôi nhận thấy, kết quả ly trích các mẫu có sự chênh lệch lớn, các mẫu thô
hoặc chưa qua chế biến có lượng DNA ly trích thu được nhiều hơn các mẫu đã qua chế
biến. Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu các quy trình ly trích thích hợp cho từng loại
sản phẩm.
Từ kết quả ly trích các mẫu sản phẩm chúng tôi quyết định chọn ra 10 mẫu để
thực hiện thí nghiệm sàng lọc mẫu sản phẩm chuyển gen.
1: mẫu B1 2: mẫu B2
3: mẫu B3 4: mẫu B4
5: mẫu B5 6: mẫu B6
7: mẫu B7 8: mẫu B8
9: mẫu B9 10: mẫu B10
11: mẫu B11 12: mẫu B12

63

63

Bảng 4.3: Các mẫu ly trích đạt kết quả tốt

STT
Tên và đặc điểm của mẫu
Kí hiệu
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Bắp giống 1
Bắp giống 2
Bắp giống 3
Bắp giống 4
Bắp giống 5
Bắp trái ăn tươi
Bột bắp nguyên liệu làm thức ăn gia súc
Thức ăn gia súc 1
Thức ăn gia súc 2
Bột ngũ cốc dinh dưỡng 1

B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B9
B10
B11

2. Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành sàng lọc các mẫu sản phẩm có DNA
ly trích đạt chất lượng tốt từ quy trình 2. Mẫu thí nghiệm là 10 mẫu có DNA ly trích
đạt chất lượng tốt ở bảng 3.1. Các mẫu sản phẩm được thử nghiệm bằng 2 phương
pháp:
- Phương pháp 1: PCR truyền thống (phương pháp đang được ứng dụng rộng
rãi trên thế giới).
- Phương pháp 2: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I (phương
pháp đề nghị).

Phƣơng pháp 1: PCR truyền thống
Các kết quả thí nghiệm được thể hiện trên bảng điện di như sau:
Qua kết quả điện di, chúng tôi xác định được có 7 mẫu dương tính với promoter
35S (xuất hiện vạch điện di có kích thước 123 bp).
64

64

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B9 B10 B11

Hình 4.3: Kết quả điện di thí nghiệm 2 phƣơng pháp 1

Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm sàng lọc bằng phƣơng pháp 1
STT
Mẫu dƣơng tính
Kí hiệu
1
2
3
4
5
6
7
Bắp giống 1
Bắp giống 2
Bắp giống 4
Bắp trái ăn tươi
Bột bắp nguyên liệu làm thức ăn gia súc
Thức ăn gia súc 2
Bột ngũ cốc dinh dưỡng 1
B1
B2
B4
B6
B7
B10
B11

Nhận xét
- Các kết quả điện di cho thấy quy trình PCR được thiết kế tốt, mồi có độ đặc
hiệu cao được thể hiện qua bảng điện di không có sản phẩm phụ. Về phương
pháp PCR, chúng tôi có nhận xét như sau :
Sản phẩm khuếch đại DNA được đánh giá bằng kĩ thuật điện di và
đọc kết quả trên đèn UV. Quá trình này đòi hỏi sản phẩm DNA phải
được lấy ra khỏi eppendorf và chịu tác động của các yếu tố cơ học,
Mẫu: