Luận văn : BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR part 5 pdf

39

39

- Qui trình 3: Phương pháp biến đổi.
Bảng 3.2: Các quy trình ly trích
Quy
trình
Bƣớc
1
2
3
1. Phá
vỡ
màng
tế bào,
màng
nhân.
- Đồng nhất mẫu.
- Bổ sung 1,2 ml đệm
trích 1.

- Ủ 45 phút ở 65
o
C.
- Ly tâm 5000 vòng/phút
trong 30 phút, thu dịch
nổi.
- Đồng nhất mẫu.
- Bổ sung 300 µl nước
cất và 500 µl đệm trích

CTAB 2%.
- Ủ 45 phút ở 65
o
C.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
- Đồng nhất mẫu.
- Bổ sung 1,2 ml đệm
trích CTAB 2%.

- Ủ 45 phút ở 65
o
C.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
2. Loại
bỏ
thành
phần
không
mong
muốn.
- Bổ sung 1 lần thể tích
phenol, đảo nhẹ.
- Ly tâm 5000 vòng/phút
trong 15 phút, thu dịch
nổi.
- Bổ sung 1 lần thể tích

phenol/chloroform, đảo
nhẹ.
- Ly tâm 5000 vòng/phút
trong 15 phút, thu dịch
nổi.
- Bổ sung 500 µl
chloroform, đảo nhẹ.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 500 µl
chloroform, đảo nhẹ.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 1 lần thể tích
phenol/chloroform, đảo
nhẹ.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
3.Tủa
DNA
- Bổ sung 0,1 lần thể tích
dung dịch potassium
acetate 3M và 2,5 lần
thể tích ethanol tuyệt
đối.
- Bổ sung 2 lần dung
dịch CTAB tủa.

- Ủ 60 phút ở nhiệt độ
phòng.
- Ly tâm16000
- Bổ sung 2 lần dung
dịch CTAB tủa.
- Ủ 60 phút ở nhiệt độ
phòng.
- Ly tâm 16000
40

40

- Ủ qua đêm ở nhiệt độ
-20
o
C.
- Ly tâm 10000
vòng/phút trong 15
phút ở nhiệt độ 4
o
C,
thu tủa.
vòng/phút trong 10
phút, thu tủa.
- Hòa tủa trong 350 µl
NaCl 1,2M.
- Bổ sung 350 µl
chloroform, đảo nhẹ.

- Ly tâm 16000

vòng/phút trong 10
phút, thu tủa.
- Bổ sung 0,6 lần thể
tích isopropanol.
- Ủ 30 phút hay qua đêm
ở - 20
o
C.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu tủa.
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
- Hòa tan tủa trong 350
µl NaCl 1,2M.
- Bổ sung 350 µl
phenol/chloroform, đảo
nhẹ.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 0,6 lần thể
tích isopropanol.
- Ủ 30 phút hay qua đêm
ở - 20
o
C.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút ở 4

o
C, thu tủa.
4.Rửa
DNA
- Bổ sung 500 µl dung
dịch ethanol 70%.
- Ly tâm 10000
vòng/phút trong 15
phút ở nhiệt độ 4
o
C,
thu tủa.
- Để khô DNA.
- Hòa tan tủa bằng 100
µl nước cất siêu sạch.
- Bổ sung 2 µl RNase, ủ
1 giờ ở 37
o
C.
- Bảo quản DNA ở
-20
o
C
- Bổ sung 500 µl dung
dịch ethanol 70%.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 15
phút ở nhiệt độ 4
o
C,

thu tủa.
- Để khô DNA.
- Hòa tan tủa bằng 30 µl
nước cất siêu sạch.
- Bổ sung 2 µl RNase, ủ
1 giờ ở 37
o
C
- Bảo quản DNA ở
-20
o
C
- Bổ sung 500 µl dung
dịch ethanol 70%.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 15
phút ở nhiệt độ 4
o
C,
thu tủa.
- Để khô DNA.
- Hòa tan bằng 30 µl
nước cất siêu sạch.
- Bổ sung 2 µl RNase, ủ
1 giờ ở 37
o
C
- Bảo quản DNA ở
-20
o

C


41

41

Phƣơng pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích
DNA thu được từ quy trình ly trích được phân tích dựa trên các chỉ tiêu:
- Độ tinh sạch của DNA: Đo độ hấp thu ánh sáng của mẫu ở bước sóng 260
nm (OD
260nm
) và 280 nm (OD
280nm
). Tính tỷ lệ OD
260nm
/OD
280nm
để xác định
độ tinh sạch của mẫu. DNA thu được tinh sạch khi tỷ lệ này nằm trong
khoảng 1,8 – 2,0.
- Lượng DNA: Từ chỉ số OD
260nm
của các mẫu tinh sạch có thể suy ra nồng
độ DNA trong mẫu theo tương quan:
1 đơn vị OD
260nm
tƣơng ứng với nồng độ 50 ng/µl DNA mạch đôi trong dung dịch
- Độ nguyên vẹn của mẫu DNA: Điện di sản phẩm ly trích trên gel agarose và
so sánh các kết quả trên bảng điện di. Mẫu DNA có độ nguyên vẹn cao khi

bảng điện di xuất hiện một vạch sáng rõ với kích thước lớn.
Kết quả thí nghiệm là chúng tôi xác định được một quy trình ly trích tốt nhất
phục vụ cho ly trích DNA các mẫu thí nghiệm.

6. Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen
Mục tiêu
Phát hiện được mẫu sản phẩm biến đổi gen thông qua promoter 35S (123 bp)
bằng 2 phương pháp: PCR thông thường (đang được sử dụng) và phương pháp Real-
Time PCR (đề nghị). Đánh giá khả năng sử dụng phương pháp Real-Time PCR ở giai
đoạn sàng lọc mẫu so với phương pháp thông thường.

Nguyên tắc
Vùng promoter 35S được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu p35S-cf3/cr4 [33] .
Sau đó, sản phẩm khuếch đại sẽ được phát hiện và phân tích.
Sản phẩm khuếch đại vùng promoter 35S sẽ có đặc điểm như sau [33]:
- Kích thước: 123 bp
- Nhiệt độ nóng chảy: 86,5
o
C
Thí nghiệm được tiến hành theo 2 phương pháp:
- Phương pháp 1: PCR truyền thống (đang được sử dụng rộng rãi). Sản phẩm
được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
42

42

- Phương pháp 2: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I (đề nghị).
Sản phẩm được kiểm tra bằng phân tích Melt curve.

Bảng 3.3: Đặc điểm cặp mồi p35S-cf3/cr4 (Công ty Proligo) [31]

p35S-cf3
p35S-cr4
Trình tự
3‟ - CCACGTCTTCAAAGCA
AGTGG - 5‟
3‟ - TCCTCTCCAAATGAAAT
GAACTTCC - 5‟
Chiều dài
21
25
Trọng lượng phân tử
(g/mol)
6414,5
7544,2
Nhiệt độ nóng chảy
(G/C)
57,4
56,3

Vật liệu thí nghiệm
- Đối chứng dương: Bắp chuyển gen Bt 176 1% cấp bởi GeneScan (Đức)
- Đối chứng âm: Nước cất siêu sạch
- Các mẫu có kết quả ly trích DNA đạt chất lượng tốt bằng quy trình ly trích
đề nghị ở thí nghiệm 1.

Trang thiết bị
Bảng 3.4: Trang thiết bị thí nghiệm 2
Phƣơng pháp 1
Phƣơng pháp 2

- Máy luân nhiệt TECHNE
TC-312.
- Bộ điện di
- Máy chiếu tia UV
- Hệ thống Real-Time PCR iCycler MyiQ
TM

(Bio-Rad)
- Máy vi tính
- Phần mềm điều khiển MyiQ (Bio-Rad)



43

43

Phƣơng pháp thực hiện
Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR
Thành phần một phản ứng PCR trong ống eppendorf 0,2 ml như sau

Bảng 3.5: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 2
Phƣơng pháp 1
Phƣơng pháp 2
Thành phần
Nồng độ
cuối
Thành phần
Nồng độ
cuối

- PCR buffer 10X
- MgCl
2
50 mM
- dNTPs 2mM
- Mồi xuôi
- Mồi ngược
- Taq polymerase
5U/µl
- DNA mẫu
- Nước cất siêu sạch
1X
2 mM
0,2 mM
0,5 µM
0,5 µM
1,0 U

10 - 50 ng

- SYBR Green
Supermix Sample 2X

- Mồi xuôi
- Mồi ngược


- DNA mẫu
- Nước cất siêu sạch
1X

0,5 µM
0,5 µM


10 - 50 ng

Tổng thể tích
25 μl
Tổng thể tích
25 μl

Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại

Bảng 3.6: Chƣơng trình nhiệt khuếch đại của thí nghiệm 2
Giai đoạn
Nhiệt độ
Thời gian
Biến tính ban đầu
95
o
C
3 phút
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
Số chu kỳ
95
o

C
62
o
C
72
o
C
50
25 giây
30 giây
45 giây

Kéo dài cuối cùng

72
o
C
4
o
C
7 phút
44

44

Phát hiện sản phẩm khuếch đại

Bảng 3.7: Phƣơng pháp phân tích kết quả của thí nghiệm 2
Phƣơng pháp 1
Phƣơng pháp 2

Điện di trên gel agarose 2% với thang
100 bp Molecular Ruler (Bio-Rad)
Nguyên tắc: Khác biệt kích thước sản
phẩm khuếch đại
Phân tích Melt curve

Nguyên tắc: Khác biệt nhiệt độ nóng
chảy sản phẩm khuếch đại

Phương pháp 1: Điện di trên gel agarose
- Chuẩn bị gel agarose 2%.
- Bơm sản phẩm PCR vào giếng với đối chứng dương, âm và thang 100 bp
Molecular Ruler.
- Điện di 100V trong 25 phút.
- Ngâm bản gel trong dung dịch TAE 1X có chứa ethidium bromide (nồng độ
0,01 mg/ml) trong 15 phút.
- Soi dưới đèn UV và đọc kết quả bằng mắt thường.
Phương pháp 2: Phân tích Melt curve
Bước này được thiết lập trên máy vi tính cùng với chương trình chạy PCR và tự
động thực hiện ngay sau khi phản ứng khuếch đại DNA hoàn tất. Sản phẩm khuếch đại
được nung biến tính từ từ. Tín hiệu huỳnh quang thu nhận sẽ được máy tính phân tích.
Chương trình nhiệt được thiết lập như sau:

Bảng 3.8: Chƣơng trình nhiệt phân tích Melt curve
Nhiệt độ
ban đầu
Nhiệt độ
cuối
Nhiệt độ tăng
mỗi chu kỳ

Thời gian
mỗi chu kỳ
Số chu kỳ
55
o
C
95
o
C
0,5
o
C
10 giây
80


45

45

Phân tích kết quả
Phương pháp 1 : Điện di trên gel agarose
Sản phẩm được so sánh với thang chuẩn và các mẫu đối chứng dương, đối
chứng âm nhằm xác định chính xác vạch khuếch đại đặc hiệu của vùng promoter 35S
(123bp).
Phương pháp 2: Phân tích Melt curve
- Kết quả thí nghiệm được hiển thị ở mục Data Analysis.
- Phân tích kết quả trên màn hình DNA Quantification (2 chế độ Normal
View, Log View).
- Mục Melt Curve: Phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR , các chỉ

tiêu phân tích gồm có:
Phân tích các đỉnh nhiệt độ nóng chảy trên biểu đồ –dF/dT so với
nhiệt độ (-dF/dT vs Temperature)
Xác định sự hiện diện của đỉnh nhiệt độ nóng chảy ở 86,5
o
C tương
ứng với đoạn khuếch đại đặc hiệu vùng promoter 35S.


Hình 3.1: Màn hình Melt Curve

Kết quả thí nghiệm 2 giúp chúng tôi so sánh hiệu quả của 2 phương pháp sáng
lọc sản phẩm biến đổi gen hiện nay, đó là phương pháp PCR truyền thống và phương
pháp Real-Time PCR và đề nghị một phương pháp cho quy trình sàng lọc các sản
phẩm biến đổi gen
46

46

7. Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen
Mục tiêu
So sánh phương pháp định lượng promoter 35S bằng kỹ thuật Real-time PCR
với thuốc nhuộm SYBR Green I và với mẫu dò Taqman. Xác định độ chính xác của 2
phương pháp ở các lần lặp lại và nồng độ pha loãng khác nhau. Xác định khả năng ứng
dụng của 2 phương pháp này.

Nguyên tắc
Vùng promoter 35S của mẫu thí nghiệm được khuếch đại đặc hiệu. Tín hiệu
huỳnh quang của mẫu (từ thuốc nhuộm SYBR Green I hay mẫu dò Taqman) sẽ được
máy thu nhận và phân tích.

Thí nghiệm được tiến hành theo 2 phương pháp:
- Phương pháp 1: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I và mồi
đặc hiệu được sử dụng từ thí nghiệm 2 [31].
- Phương pháp 2: Real-Time PCR với mẫu dò Taqman và mồi đặc hiệu được
tổng hợp thành bộ kit của công ty GeneScan.

Vật liệu thí nghiệm
- Đối chứng dương: bắp chuyển gen Bt 176 1% (GeneScan, Đức).
- Đối chứng âm: Nước cất siêu sạch.
- Chuẩn 35S của công ty GeneScan. Số lượng các chuẩn này đã được biết
trước. Đơn vị tính là số lượng copy (copy number). 1 copy number tương
đương với số lượng một gen đích trong mẫu thí nghiệm.

Trang thiết bị
- Máy My iQ
TM
Single Color Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)
- Máy vi tính
- Phần mềm điều khiển MyiQ (Bio-Rad).

Phƣơng pháp thực hiện
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thiết kế như sau:
47

47

- 3 thí nghiệm với mẫu là 3 chuẩn 35S. Mục đích là dựng đường chuẩn định
lượng promoter 35S.
- 1 thí nghiệm với đối chứng âm: nước siêu sạch.

- Các thí nghiệm với mẫu.
Nhằm so sánh 2 phương pháp định lượng, chúng tôi quyết định thí nghiệm các
vấn đề sau:

Xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng p35S
Đường chuẩn định lượng có vai trò quuyết định trong việc định lượng DNA.
Nó được xây dựng dựa trên các mẫu chuẩn đã biết trước. Từ kết quả thí nghiệm nhận
được, các mẫu chưa biết sẽ được so với đường chuẩn để tính toán ra kết quả định
lượng. Vì vậy trong thí nghiệm này, chúng tôi thử nghiệm khả năng xây dựng đường
chuẩn của phương pháp Real-Time PCR với 2 loại hóa chất định lượng khác nhau
(SYBR Green I và mẫu dò đặc hiệu Taqman). Các chuẩn là chuẩn 35S của công ty
GeneScan. Do điều kiện thí nghiệm, chúng tôi sử dụng 3 chuẩn của công ty GeneScan
như sau

Bảng 3.9: Chuẩn 35S [29]
Chuẩn
Lƣợng lý thuyết
(số lƣợng phân tử) (copy)
Chuẩn 1
Chuẩn 2
Chuẩn 3
5120
640
80

Kết quả thí nghiệm sẽ được so sánh trên hệ số tương quan (Correlation
coefficient), hiệu quả PCR (PCR Efficiency), chu kỳ phát hiện các mẫu chuẩn, sự xuất
hiện các sản phẩm không đặc hiệu. Phương pháp tốt sẽ phải có hệ số tương quan
(Correlation coefficient) >0,98 , hiệu quả PCR (PCR Efficiency) từ 90-120 %, chu kỳ
phát hiện các mẫu chuẩn phải tỷ lệ với nhau và không xuất hiện các sản phẩm không

đặc hiệu.
48

48

Đánh giá kết quả định lƣợng
Do 2 phương pháp sử dụng hóa chất định lượng khác nhau nên phương pháp
thu nhận tín hiệu huỳnh quang sẽ khác nhau. Nếu SYBR Green I định lượng bằng cách
thu nhận tín hiệu huỳnh quang từ tất cả DNA mạch đôi hiện diện trong sản phẩm, thì
Taqman chỉ thu nhận thu nhận tín hiệu huỳnh quang từ những mẫu bắt cặp đặc hiệu
với mồi. Điều này có thể dẫn đến kết quả định lượng từ 2 phương pháp sẽ có sai lệch
nhất định. Như vậy, nhằm đánh giá kết quả định lượng của 2 phương pháp, sự sai lệch
có thể có trong kết quả, chúng tôi quyết định định lượng mẫu có số lượng lý thuyết là
1 copy gen đích trong mẫu.
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với các mẫu trên. Kết quả sẽ được so sánh dựa
trên chu kỳ phát hiện, kết quả định lượng thực tế so với số lượng lý thuyết. Phương
pháp tốt hơn sẽ phải có kết quả định lượng gần với số lượng lý thuyết nhất và có độ
lệch qua các lần lặp lại thấp.
Kết quả của thí nghiệm này giúp chúng tôi so sánh được hiệu quả của phương
pháp Real-Time PCR với 2 hóa chất định lượng khác nhau. Phương pháp này với hóa
chất định lượng đề nghị sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm về sau.

Thành phần phản ứng PCR
Thành phần một phản ứng PCR trong ống eppendorf 0,2 ml như sau:
Bảng 3.10: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 3
Phƣơng pháp 1
Phƣơng pháp 2
Thành phần
Nồng độ
cuối

Thành phần
Nồng độ
cuối
- SYBR Green
Supermix Sample 2X
(Bio-rad)
- Mồi xuôi
- Mồi ngược
- DNA mẫu
- Nước cất siêu sạch
1X



0,5 µM
0,5 µM
50 ng
- 35S master mix (GMO
Quant 35S Screen
Corn Kit) (GeneScan)


- DNA mẫu
- Nước cất siêu sạch
1X




50 ng

Tổng thể tích
25 μl
Tổng thể tích
25 μl


49

49

Đặc điểm 35S master mix
Các master mix này được dùng cho các phản ứng định lượng bắp chuyển gen có
chứa promoter 35S trong thực phẩm.
35S master mix chứa các thành phần cần thiết cho việc phát hiện đặc hiệu trình
tự promoter CaMV 35S hiện diện trong một số giống bắp chuyển gen phổ biến hiện
nay.
Hệ thống này sử dụng mẫu dò (probe) có gắn chất phát quang FAM 490.

Đặc điểm SYBR Green I Supermix
SYBR Green I Supermix có chứa tất cả các thành phần cần thiết cho phản ứng
phát hiện và định lượng DNA.

Chƣơng trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR
Bảng 3.11: Chƣơng trình nhiệt của 2 phƣơng pháp
Phƣơng
pháp
Giai
đoạn
Phƣơng pháp 1
Phƣơng pháp 2

Nhiệt độ
Thời
gian
Đọc tín
hiệu
huỳnh
quang
Nhiệt độ
Thời
gian
Đọc tín
hiệu
huỳnh
quang
Giai đoạn 1
95
o
C
3 phút

95
o
C
10 phút

Giai đoạn 2
- Bƣớc 1
- Bƣớc 2
- Bƣớc 3
Số chu kỳ

95
o
C
62
o
C
72
o
C
50

25 giây
30 giây
45 giây




x

95
o
C
60
o
C

45

15 giây
1 phút



x
Giai đoạn 3
72
o
C
4
o
C
7 phút

4
o
C



50

50

Cài đặt phần mềm điều khiển
Phần mềm điều khiển được cung cấp bởi công ty Bio-Rad. Sau khi cài đặt, ta có
thể khởi động chương trình và điều khiển sự hoạt động của máy từ máy vi tính. Các
bước tiến hành thiết lập một chương trình hoạt động như sau:
- Khởi động máy và đèn đọc tín hiệu. Máy cần được làm nóng khoảng 30

phút trước khi bắt đầu thí nghiệm.
- Khởi động phần mềm MyiQ trên máy vi tính.
- Chọn mục Edit protocol: Thiết lập các thông số của chương trình nhiệt. Ta
cũng có thể gọi một chương trình nhiệt cũ đã chạy từ mục Library.
- Chọn mục Edit Plate Setup: Cài đặt các thông số của mẫu thí nghiệm.
- Kiểm tra tên và thông số của mẫu. Đặt các eppendorf vào đúng vị trí đã
thiết lập.
- Nhấn “Run with selected protocol” để khởi động chương trình. Xác định thể
tích mẫu thí nghiệm.
- Đọc và phân tích kết quả thí nghiệm bằng cách nhấn mục Data Analysis ở
phía trái màn hình.


Hình 3.2: Màn hình Edit Protocol
51

51


Hình 3.3: Màn hình Edit Plate Setup


Hình 3.4: Màn hình View Quantities/Identifiers
Phân tích kết quả thí nghiệm
Các kết quả thí nghiệm được phân tích trên màn hình phần mềm MyiQ. Các
bước phân tích được tiến hành như sau: