Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes part 6 pot

51
PHỤ LỤC
1. Thành phần môi trƣờng
1.1. Môi trƣờng GYE agar (Glucose Yeast Extract)
Cao nấm men 5.0g
Peptone 5.0g
D-glucose 5.0g
K
2
HPO
4
0.5g
KH
2
PO
4
0.5g
MgSO
4
0.3g
Bromocresol purple 1ml
Khoáng vi lƣợng 1.0ml
Nƣớc vô trùng 1000ml
Agar 15g
pH 6.3 0,2
Thành phần khoáng vi lƣợng
NaCl 500mg
FeSO
4
.7H

2
O 900mg
MnSO
4
.5H
2
O 800mg
ZnSO
4
.7H
2
O 80mg
CuSO
4
.5H
2
O 80mg
CoSO
4
.7H
2
O 80mg
Nƣớc vô trùng 50ml
Đun sôi môi trƣờng cho hòa tan
Hấp khử trùng ở 115
0
C/30 phút
1.2. Môi trƣờng MRSA
Cao thịt 8g
Peptone 10g

Cao nấm men 4g
Glucose 10g
Acetate Na 5g

52
K
2
HPO
4
2g
Triamonium citrate 2g
MgSO
4
0,2g
MnSO
4
0,2g
Tween 80 1ml
Bromocresol purple 1ml
CaCO
3
2g
Agar 16g
Nƣớc cất 1000ml
Đun sôi môi trƣờng cho hòa tan
Hấp khử trùng ở 115
0
C/30 phút
1.3. Môi trƣờng Nutrient broth (NB)
Cao thịt 5g

Peptone 10g
NaCl 5g
Nƣớc cất 1000ml
pH 7,0 0,2
Hấp khử trùng ở 121
0
C/20 phút
1.4. Môi trƣờng lên men đƣờng
Cao thịt 5g
Peptone 10g
NaCl 5g
Đƣờng 10g
Phenol red 0,01g
Nƣớc cất 1000ml
1.5. Môi trƣờng thạch bán lỏng
Nutrient broth 13g
Agar 5g
Nƣớc cất 1000ml
pH 7,2 0,2

53
Đun sôi môi trƣờng cho hòa tan
Hấp khử trùng ở 121
0
C/20 phút
2. Hóa chất
2.1. Nƣớc muối sinh lý NaCl 9%
0

NaCl 9g

Nƣớc cất 1000ml
2.2. NaOH 0,1N
NaOH 40g
Nƣớc cất 1000ml
Cân 40g NaOH tinh thể hòa vào 50ml nƣớc cất lắc đều, để yên 24h, gạn lấy
nƣớc trong ở trên rồi bổ sung thêm nƣớc cất cho đủ 1000ml.
3. Thuốc nhuộm
3.1. Crystal violet
(a) Crystal violet 0.4g
cồn 96
0
10ml
(b) phenol 1g
nƣớc cất 100ml
Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc. Thuốc
nhuộm đƣợc bảo quản trong chai màu tối.
3.2. Fuchsine kiềm
(a) Fuchsine kiềm 0,3g
Ethanol 96
0
10ml
(b) Phenol 5g
Nƣớc cất 35ml
Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc. Thuốc
nhuộm phải đƣợc bảo quản trong chai màu tối.
Trƣớc khi dùng, pha loãng 5 lần (dịch pha loãng không giữ đƣợc lâu còn dịch
đậm đặc có thể giữ trong nhiều tháng).
3.3. Lugol
KI 2g

54
Iod tinh thể 1g
Nƣớc cất 300ml
Hòa tan 2g KI vào 5ml nƣớc cất. Sau đó thêm 1g iod và chờ cho iod tan hết
mới thêm nƣớc cho đủ 300ml.
3.4. Methylene blue
(a) Methylene blue 1,5g
Ethanol 96
0
10ml
(b) Acid phenic 1g
Nƣớc cất 100ml
Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan. Bảo quản trong chai
màu tối.
4. Thuốc thử và chỉ thị màu
4.1. Thuốc thử Ufellman
Phenol 1% 10ml
FeCl
3
1N 2 giọt
4.2. Thuốc chỉ thị Bromocresol purple (BCP)
(a) Bromocresol purple 16g
Ethanol 96
0
500ml
(b) Nƣớc cất 500ml
Pha dung dịch a trƣớc, sau đó trộn với b. Giữ hỗn hợp trong chai màu tối.
5. Phƣơng pháp nhuộm
5.1. Phƣơng pháp nhuộm Gram
Cố định tiêu bản

Đặt giấy lọc lên vết bôi
Nhuộm crystal violet 1-2 phút
Rửa nƣớc
Cố định lugol 1 phút
Rửa nƣớc
Tẩy ethanol 90
0
15 giây
Rửa nƣớc

55
Nhuộm fuchsine kiềm loãng 1phút
rửa nƣớc
Để khô
Xem kính hiển vi ở vật kính 100X
5.2. Phƣơng pháp nhuộm bào tử
Cố định tiêu bản
Nhuộm HCl 1%
Rửa nƣớc
Đặt giấy lọc lên vết bôi
Nhuộm fuchsine đậm đặc, hơ nhẹ trên đèn cồn trong 2-4 phút
Rửa nƣớc
Rửa cồn 90
0
15 giây
Rửa nƣớc
Nhuộm Methylene blue 1 phút
Rửa nƣớc
Để khô
Xem kính hiển vi ở vật kính 100X

6. Phƣơng pháp thực hiện các phản ứng sinh hóa
6.1. Khả năng lên men đƣờng
 Nguyên tắc
Một số vi sinh vật sử dụng và lên men một số lọai đƣờng làm pH môi trƣờng
giảm. Khi đó, chỉ thị màu phenol red từ màu đỏ chuyển sang màu vàng, có sinh hơi
hay không sinh hơi tùy vào từng lọai vi khuẩn.
 Chuẩn bị
Môi trƣờng đƣờng: glucose, sucrose, fructose, maltose, mannitol, lactose,
sorbitol, dextrin.
Giống vi khuẩn: L. sporogenes
Ống nghiệm, ống durham
 Tiến hành

56
Phân môi trƣờng vào các ống nghiệm có ống durham, đem hấp vô trùng
115
0
C/20 phút để nguội, cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh vào, ủ ở 37
0
C/24h,
đọc kết quả.
 Kết quả
Phản ứng (-): môi trƣờng đục và có màu đỏ cam
Phản ứng (+): môi trƣờng đục và có màu vàng
6.2. Khả năng di động
 Nguyên tắc
Một số vi khuẩn có tiêm mao nên có khả năng di động trong môi trƣờng bán
lỏng.
 Chuẩn bị
Môi trƣờng bán lỏng

Que cấy thẳng
Giống vi khuẩn L. sporogenes
 Tiến hành
Cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh sang môi trƣờng bán lỏng (cấy chích
thẳng từ trên xuống dƣới), ủ 37
0
C/24h. Đọc kết quả.
 Kết quả
Phản ứng (-): vi khuẩn mọc theo đƣờng cấy
Phản ứng (+): vi khuẩn mọc lan ra xung quanh
6.3. Phản ứng catalase
 Nguyên tắc
Một số vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme catalase phân giải H
2
O
2
thành
H
2
O
2
và O
2

 Chuẩn bị
Môi trƣờng GYE thạch nghiêng
Giống vi khuẩn L. sporogenes
 Tiến hành
Cấy ria vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh lên môi trƣờng GYE thạch nghiêng, ủ
37

0
C/24h, nhỏ H
2
O
2
lên sinh khối.

57
 Kết quả
Phản ứng (-): không có hiện tƣợng nào xảy ra
Phản ứng (+): có hiện tƣợng sủi bọt khi H
2
O
2
tiếp xúc sinh khối