Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes part 5 doc

41
Bảng 4.2: Đặc điểm sinh hóa của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc từ chế phẩm

Glucose
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Sucrose
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Fructose
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
Mannito
l
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Maltose
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lactose
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Sorbitol
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
Dextrin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Catalase
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Di động
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
Sinh hóa
Chủng
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20


42
Qua Bảng 4.2, chúng tôi nhận thấy đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập phù

hợp với tính chất sinh hóa của vi khuẩn L. sporogenes.

4.5. Khả năng sinh acid lactic
4.5.1. Định tính
Từ 20 chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa, chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định
khả năng sinh acid lactic của chúng. Kết quả ghi nhận đƣợc trình bày ở Bảng 4.3.
Bảng 4.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa
Số chủng thử
nghiệm
Số chủng có khả năng sinh acid lactic
20
Số lƣợng
Tỷ lệ (%)
20
100

Dựa vào Bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy 20 chủng phân lập đƣợc đều có khả năng
sinh acid lactic. Để đánh giá thêm về lƣợng acid lactic do L. sporogenes sản xuất, chúng
tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm đo độ chua Therner và định lƣợng acid lactic.


Hình 4.3: Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn L. sporogenes

43


4.5.2. Định lƣợng
Sau khi thực hiện nuôi cấy các chủng L. sporogenes phânlập đƣợc trong môi trƣờng
sữa đặc có đƣờng, chúng tôi nhận thấy: tất cả 20 chủng đều có khả năng làm đông vón
sữa. Từ giá trị độ chua thu nhận đƣợc, chúng tôi tính đƣợc lƣợng acid lactic do các chủng

L. sporogenes sản xuất. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 4.4.

Bảng 4.4: Giá trị độ Therner và lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sản xuất
Chủng
Thể tích NaOH 0.1N
cần dùng (ml)
Độ Therner (T)
Số gam acid lactic trong 100ml
dịch lên men (g/100ml)


Hình 4.4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes
Ghi chú:
ĐC (-): 2,5ml nƣớc cất + 2,5 ml thuốc thử Uffelman
ĐC (+): 2,5ml acid lactic 96% + 2,5 ml thuốc thử Uffelman
Mẫu: 2,5ml dịch lên men (đã qua chiết tách) + 2,5 ml thuốc thử Uffelman

44
1
2,4
24
0,216
2
2
20
0,18
3
2,9
29
0,261

4
2
20
0,18
5
1,9
19
0,171
6
2
20
0,18
7
2
20
0,18
8
2,2
22
0,198
9
1,9
19
0,171
10
2,5
25
0,225
11
2

20
0,18
12
1,9
19
0,171
13
2,1
21
0,189
14
2
20
0,18
15
1,6
16
0,144
16
3
30
0,27
17
1,7
17
0,153
18
1,8
18
0,162

19
3,8
38
0,342
20
3,2
32
0,288

Qua bảng 4.4, chúng tôi nhận thấy độ Therner biến động từ 1,6 - 3,8 tƣơng ứng với
lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sinh ra là 0,144 - 0,342 g/100ml. Loài
Lactobacillus khác nhƣ L. bulgaricus sản xuất đƣợc 0,684 g acid lactic/100 ml dịch sữa
10% đƣợc lên men ở 37
0
C/5 giờ [1]. Nhƣ vậy, 20 chủng vi khuẩn L. sporogenes chúng tôi
đang khảo sát có khả năng sinh acid lactic nhƣng yếu hơn những loài Lactobacillus khác.
Nguyên nhân của điều này có thể vì điều kiện nuôi cấy hay lên men chƣa phù hợp hay vì
đặc tính di truyền của các chủng L. sporogenes đang khảo sát. Ngoài ra, chúng tôi không
tìm thấy một tài liệu nào ghi nhận rõ ràng về lƣợng acid lactic mà vi khuẩn L. sporogenes
sinh ra.

45
Trong 20 chủng khảo sát, chúng tôi nhận thấy 3 chủng 16, 19, 20 có khả năng sản
xuất acid lactic mạnh nhất. Khả năng tạo acid lactic có ý nghĩa nhất định trong việc ứng
dụng vi khuẩn L. sporogenes làm chế phẩm. Acid lactic giúp vi khuẩn L. sporogenes ức
chế những vi khuẩn gây bệnh trong đƣờng ruột vật chủ và mang những lợi ích về mặt sinh
lý cho vật chủ (xem mục 2.2.5.1. phần 2). Vì vậy, chúng tôi chọn 3 chủng 16, 19, 20 để
tiếp tục khảo sát khả năng tạo bào tử, từ đó có thể khảo sát tiếp sự tồn tại của bào tử khi
trộn vào chế phẩm.
4.6. Khảo sát khả năng hình thành bào tử

Sau khi khảo sát trên 2 loại môi trƣờng, 2 điều kiện nhiệt độ - thời gian hình thành bào tử
với 3 chủng khác nhau, chúng tôi thu nhận đƣợc số liệu về lƣợng bào tử trong mỗi nghiệm thức
(xem Bảng 4.5)
Bảng 4.5 Số lƣợng bào tử L. sporogenes thu đƣợc trong 12 nghiệm thức đƣợc khảo sát
Điều kiện nhiệt độ -
thời gian
37
0
C/6 ngày
50
0
C/2 giờ  70
0
C/2 giờ
Môi trƣờng
Chủng
MRSA
GYE
MRSA
GYE
Bào tử /ml
(N)
LogN
Bào tử /ml
(N)
LogN
Bào tử /ml
(N)
LogN
Bào tử /ml

(N)
LogN
16
X

1,43.10
11
11,14
1,48.10
11

11,16
1,6.10
11

11,20
1,82.10
11

11,23
SD

0,09

0,09

0,05

0,18
CV%

0,83

0,84

0,51

1,64
19
X

2,43.10
11

11,34
1,95.10
11

11,25
2,35.10
11

11,34
2,32.10
11

11,35
SD

0,23

0,21

0,18

0,10
CV%

0,28

1,89

1,58

0,92
20
X

1,74.10
11
11,22
1,99.10
11

11,28
1,93.10
11

11,27
2,13.10

11

11,31
SD

0,13

0,10

0,12

0,12
CV%

1,16

0,95

1,09

1,09
Chú ý: mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần
Chúng tôi xử lý thống kê trên số liệu logarit (LogN) đƣợc chuyển đổi từ số bào tử
thu đƣợc ở dạng số liệu nguyên (Bào tử/ml). Dựa vào bảng ANOVA (xem phụ lục 7.1),
chúng tôi nhận thấy: mức độ ý nghĩa sự khác biệt giữa các chủng là 0,07; giữa các môi
trƣờng nuôi cấy là 0,81; giữa các điều kiện nhiệt độ - thời gian là 0,32. Vậy, không có sự
khác biệt về ảnh hƣởng của các chủng, các môi trƣờng nuôi cấy và những điều kiện thời

46
gian – nhiệt độ khác nhau lên khả năng hình thành bào tử vi khuẩn L. sporogenes

(P>0,05). Tuy nhiên, trong bảng ghi nhận sự khác biệt giữa các chủng (xem phụ lục 7.2),
chúng tôi nhận thấy chủng 19 có khả năng tạo bào tử nhiều hơn chủng 16. Sự khác biệt
không đáng kể nên có thể quy cho sai số trong lƣợng sinh khối thu đƣợc lúc đầu. Ngoài
ra, mức độ ý nghĩa về sự tƣơng tác giữa các yếu tố khảo sát đều lớn hơn 0,05 (xem phụ
lục 7.1) nên có thể kết luận rằng không có sự tƣơng tác giữa các yếu tố này lên khả năng
hình thành của bào tử.
Từ kết quả trên, chúng nhận thấy rằng để sản xuất bào tử vi khuẩn L. sporogenes
nhằm trộn vào chế phẩm, có thể sử dụng môi trƣờng GYE hay MRSA đều đƣợc. Tuy
nhiên, môi trƣờng GYE có thành phần đơn giản và ít tốn chi phí hơn môi trƣờng MRSA.
Ngoài ra, để tiết kiệm thời gian, ta nên sử dụng điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào tử là
50
0
C/2 giờ rồi chuyển qua 70
0
C/2 giờ sau khi đã nuôi sinh khối ở 37
0
C/2 ngày thay vì
nuôi cấy tạo bào tử ở 37
0
C/6 ngày.

47
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Chúng tôi phân lập đƣợc 20 chủng với những đặc điểm hình thái vi/đại thể và sinh
hóa đặc trƣng của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes.
Khả năng sinh acid lactic của 20 chủng đều thấp hơn những loài Lactobacillus khác.
Môi trƣờng nuôi cấy (MRSA và GYE) và điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào tử
(37
0
C/6 ngày và 37
0
C/2 ngày → 50
0
C/2 giờ → 70
0
C/2 giờ) ảnh hƣởng không có ý nghĩa
lên sự hình thành bào tử của các chủng L. sporogenes khảo sát.
5.2. Đề nghị
Khảo sát thêm các loại môi trƣờng nuôi cấy, các mức nhiệt độ, pH, thời gian thích
hợp cho L. sporogenes sinh acid lactic và tạo sinh khối tối ƣu.
Khảo sát thêm môi trƣờng và thời gian bảo quản bào tử trong chế phẩm.

48
PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Lý Thành Kiệt, 2002. Bước đầu nghiên cứu phân lập và nhân giống 2 chủng vi
khuẩn Lactic Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus để cung cấp
giống cho chế biến yogurt ở quy mô nhỏ. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ
thực phẩm, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam.

2. Lã Văn Kính, 1998. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công nghệ sản xuất
thức ăn gia súc và vai trò của probiotic đối với động vật. Báo cáo khoa học, Trung
tâm Thông tin khoa học và công nghệ, Sở khoa học công nghệ và môi trƣờng

TPHCM, trang 1 – 9.

3. Lê Thị Tài, 1996. Kết quả thử nghiệm Biosubtyl trong điều trị loạn khuẩn đường
ruột gia sức non. Tạp chí Nông nghiệp, Công nghệ thực phẩm. Trang 263 – 264.

4. Trần Thị Thu Thủy, 2003. Khảo sát tác dụng thay thế kháng sinh của Probiotics
trong phòng ngừa tiêu chảy do E. coli trên heo con. Luận văn thạc sĩ, khoa Chăn
nuôi – Thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 85 trang.

TIẾNG NƢỚC NGOÀI

5. Amer, M.A. and Lammending, A.M., 1983. Health Maintenance benefits of
cultured dairy products. Cultured Dairy Products J. 18 : 6-19.

6. Barefoot and Klaehammer, 1984. Purification and characterisation of
Lactobacillus acidophillus bacteriocin lactacin B. Antimicrobiological agents
chemotheraphy, 26 (3): 324 – 328.

7. Bernet et al., 1994. Lactobacillus acidophillus LA 1 binds to cultured human
intestinal cells and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent
bacteria, 35: 483 – 489.

8. Buchnan, R.E. & Gibbons, N.E. ed., 1974. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, 577.

9. B. P. Dey and C. P. Lattuada, 1998. USDA/FSIS Microbiology Laboratory
Guidebook. 3rd Edition. Volume 2. Pages 33 – 5 and 33 – 6.

10. Friend, B.A. and Shahani, K.M., 1984. Nutritional and therapeutic aspects of
lactobacilli. J. Appl. Nutr. 36: 125-33.

49
11. Gandhi, A.B. and Nagarathnam, T., 1990. Probiotics for veterinary use. Poultry
Guide, 27(3) : 43-47.

12. Gandhi, A.B., 1995. Personal communication.

13. Gandhi, A.B., 1998. Lactobacillus sporogenes, an advancement in Lactobacillus
therapy. The Eastern Pharmacist, 41-43.

14. Gilliland, S.E. and Speck, M.L., 1977. Deconjugation of bile acids by intestinal
lactobacilli. Appl. Environ. Microbiol. 33 :15.

15. Gould, G.W. and Hurst, A., 1969. The bacterial spore. Academic Press.

16. Gorbach, S.L., l990. Lactic acid bacteria and human health. Annals of Medicine
22:37-41.

17. Hepner et al., 1979. Hypercholesterolemic effect of yogurt and milk. Am.J. Clin.
Nutr. 32:19-24.

18. Hosono et al., 1987. Antimutagenic activity of cellular component of Streptococcus
faecalis IFO 12965. Netherlands Milk and Dairy Journal, 41: 239-45.

19. Johansson et al., 1993. Administration of different Lactobacillus strains in
fermented oatmeal soup: in vivo colonisation of human intestinal mucosa and
effect on the indigenous flora. Applied and Environmental Microbiology, 59: 15 –
20.

20. Kim Tae Han et al, 1989. development of L. sporogenes resistent to Rifampicin, an
antituberculosis agent. Kor. Jour. Microbiol, p. 155 – 161.

21. Kim Y.M. et al., 1985. Studies on the production of beta - galactosidase by
Lactobacillus sporogenes. Properties and applications of beta - galactosidase.
Korean J. Applied Microbiol. Bioeng. 13(4) 355-360.

22. Kishida, T. Interferon and immune function. New Editions Health World.

23. Klaenhammer, T.R., 1988. Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie 70 : 337-349.

24. Macbeth,W.A.A.G. et al., 1965. Treatment of hepatic encephalopathy by alteration
of intestinal flora with L. acidophilus, Lancet, i : 399-403.

25. Mohan, J.C et al., 1990. Preliminary observations on effect of L. sporogenes on
serum lipid levels in hypercholesterolemic patients. Indian J. Med. Res. [B] 92,
431-432.


50
26. Mohan, J.C. et al., 1990. Short term hypolipedemic effects of oral L. sporogenes
therapy in patients with primary dyslipidemias. Indian Heart J. 42(5) : 361-4.

27. Rani and Khetarpaul, 1998. Probiotic fermented food mixture: possible
applications in clinial anti – diarrhoea usage. Nutrition Health, 12: 97 – 105.

28. Saarela et al, 2000. Probiotic bacteria: safety, functional and technology properties.
Journal of Biotechnology, 84: 197 – 215.

29. Saxelim, 1997. Lactobacillus GG – a human probiotic strain with thorough clinical

documentation. Food Review International 13 (2): 293 – 313.

30. Scott et al., 1990. Lactobacillus . The Pharmaceutical Journal Nov. 24 608-610.

31. Shahani, K.M. and Ayebo, A.D., 1980. Role of dietary lactobacilli in
gastrointestinal microecology. Am. J. Clin. Nutr. 33,2448-2457.

32. Tannock, 1997. Probiotic properties of lactic acid bacteria: plenty of scope for
fundamental R&D. Trends in Biotechnology 15 (7): 270 – 274.

33. Wood, B.J.B, 1992. The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease, Vol. 1, p
394., Elsevier Applied Science.

34. Zamfir et al, 1999. Purification and charaterization of a bacteriocin produced by
Lactobacillus acidophillus IBB. Journal of Applied Microbiology, 87 (6): 923 –
931.

35. www.lactospore.com/back2.htm

36. www.microbax.com/lactobacillus.htm

37. www.natura.org.uk/naturaflora.htm

38. www.pharmedmedicare.com/lactopure.html

39. static.highbeam.com/a/alternativemedicinereview/august012002/lactobacillussporo
genesmonograph/index.html

40. Analysis of Lactospore®
:

Report from Sami Chemicals and Extracts, Bangalore,
India, (1995).