Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes part 4 doc

31
3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào [9, 40]
 Hình thái khuẩn lạc

Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa [9, 40]
Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, màu vàng trùng với màu môi trƣờng xung quanh.
Đƣờng kính khuẩn lạc: 2,5 mm.
 Hình thái tế bào
Tế bào đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ
lục 5.1). Vi khuẩn L. sporogenes có hình que, bắt màu Gram (+), không tạo chuỗi. Bào tử
nằm ở một đầu tế bào. Kích thƣớc tế bào: 0,4 – 0,8 µm  2,5 – 4,5 µm.
 Hình thái bào tử
Bào tử đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ
lục 5.2). Bào tử L. sporogenes có hình bầu dục, bắt màu hồng, nằm ở một đầu tế bào.
Kích thƣớc bào tử: 0,9 – 1,2 µm  1 – 1,7 µm.


Mẫu chế phẩm
Pha loãng trong 9 ml NaCl 9%
0
đến nồng độ 10
-8

Giữ 3 ống nồng độ pha loãng 10
-6
,
10
-7
, 10
-8

ở 100
0
C/10 phút
Cấy trang trên đĩa GYE
Quan sát khuẩn lạc đặc trƣng
Giữ giống trên GYE thạch nghiêng
Ủ 37
0
C/48 giờ

32
3.4.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa [35]
Để định danh L. sporogenes, ngoài hình thái khuẩn lạc và tế bào, còn cần đến những
phản ứng sinh hóa đặc trƣng (xem phụ lục 6.1 – 6.3).

Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa [35]
3.4.3. Khả năng sinh acid lactic
3.4.3.1. Định tính
 Nguyên tắc
Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp phát hiện khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn L.
sporogenes bằng phản ứng với thuốc thử Uffelman
 Tiến hành
Cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh vào 10 ml canh GYE. Ủ 37
0
C/48 giờ. Ly tâm
ống canh khuẩn ở tốc độ 3000 vòng/10 phút. Thu dịch nổi vào bình chiết, thêm 2,5 ml
H
2
SO
4

10%, 25 ml diethyl ether và lắc đều. Thu lấy tầng ether và cho bốc hơi thật kỹ
trong bồn nƣớc nóng (trong khoảng 60 - 100
0
C)cho đến khi còn lại một thể tích dung dịch
ổn định. Hòa tan phần còn lại này trong 2,5 ml nƣớc cất. Thêm vào 2,5 ml thuốc thử
Uffelman màu tím xanh. Đọc kết quả.
Kết quả
Phản ứng (-): dung dịch không chuyển thành màu vàng
Phản ứng (+): dung dịch chuyển thành màu vàng
Giống
Cấy tăng sinh trong GYE lỏng
Ủ 37
0
C/24 giờ
Cấy sang các môi trƣờng thử
sinh hóa
Lên men đƣờng

Di động

Catalase


33


3.4.3.2. Định lƣợng
 Nguyên tắc
L. sporogenes lên men đƣờng tạo ra acid nên có cũng có khả năng làm đông vón sữa.
Dựa vào đặc điểm này, chúng tôi xác định và đánh giá lƣợng acid lactic (chiếm hơn 85%

tổng lƣợng acid đƣợc tạo ra) do các chủng L. sporogenes trong chế phẩm Lactospore
®

sản xuất thông qua giá trị độ chua Therner.


 Tiến hành
o Xác định độ chua

34

Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner

Công thức tính độ chua (T) trong 100 ml dịch sữa lên men

o Tính lƣợng acid lactic
Công thức tính lƣợng acid lactic trong 100 ml dịch lên men dựa vào giá trị độ chua
T = n.100/V
T: độ chua
n: V
NaOH
0,1N sử dụng (ml)
V: thể tích dịch sữa lên men chƣa pha loãng (ml)

4 ml GYE lỏng
Hấp vô trùng
Cấy vi khuẩn
Ủ 37
0
C/24 giờ

Sữa đặc có đƣờng
Pha loãng bằng nƣớc
cất với tỉ lệ 1:10
Chiết 40 ml vào bình
tam giác
Ủ 37
0
C/24 giờ
Hút 10 ml dịch lên men +
90 ml nƣớc cất + 2-3 giọt
phenolphtalein
Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N
cho đến khi dịch lên men
chuyển sang màu hồng nhạt
bền trong 5 phút
Ghi nhận V
NaOH
0,1N

Tính giá trị độ chua
(T) theo công thức

35

3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử
 Nguyên tắc
Sự hình thành và hồi sinh của bào tử L .sporogenes chịu ảnh hƣởng lớn bởi những điều
kiện môi trƣờng. Thí nghiệm sau đây đƣợc thực hiện nhằm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và
môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng tạo bào tử. Đối tƣợng đƣợc lựa chọn để thực hiện thí nghiệm
là 3 trong số các chủng giữ giống.

 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu 3 yếu tố
Yếu tố 1: nhiệt độ nuôi cấy
Yếu tố 2: môi trƣờng nuôi cấy
Yếu tố 3: 3 chủng vi khuẩn L. sporogenes
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử L. sporogenes
Yếu tố 3
Yếu tố 1

Yếu tố 2
37
0
C/6 ngày [9]
37
0
C/2 ngày  50
0
C/2 giờ
 70
0
C/2 giờ
MRSA
GYE
MRSA
GYE
Chủng
1
Nghiệm thức 1
Nghiệm thức 2
Nghiệm thức 3

Nghiệm thức 4
2
Nghiệm thức 5
Nghiệm thức 6
Nghiệm thức 7
Nghiệm thức 8
3
Nghiệm thức 9
Nghiệm thức 10
Nghiệm thức 11
Nghiệm thức 12

Chú ý: mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần






A = 0,009.n.100/V = 0,009.T
A: khối lƣợng acid lactic (g)
n : V
NaOH
0,1N chuẩn độ (ml)
0,009 : hệ số chuyển 1 ml NaOH 0,1N
sang số gam acid lactic
V : thể tích dịch sữa lên men chƣa lên
men (ml)

36
 Quy trình khảo sát

Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử
L. sporogenes [9, 40]

Chọn 3 chủng
Cấy tăng sinh trên GYE lỏng
Ủ 37
0
C/24 giờ
Hút 1ml sinh khối và cấy lên 2 môi
trƣờng thạch đĩa
MRSA
GYE
Ủ 37
0
C/6 ngày
Ủ 37
0
C/6 ngày
Ủ 37
0
C/2 ngày,
tiếp tục ủ ở
50
0
C/2 giờ và
70
0

C/2 giờ
Ủ 37
0
C/2 ngày,
tiếp tục ủ ở
50
0
C/2 giờ và
70
0
C/2 giờ
Thu sinh khối
(a)
Thu sinh khối
(a)
Thu sinh khối
(a)

Kiểm tra số
lƣợng bào tử
trong sinh
khối
(b)
So sánh số lƣợng bào tử và đánh
giá khả năng hình thành bào tử
trong mỗi thí nghiệm bố trí
Kiểm tra số
lƣợng bào tử
trong sinh
khối

(b)
Kiểm tra số
lƣợng bào tử
trong sinh
khối
(b)
Kiểm tra số
lƣợng bào tử
trong sinh
khối
(b)
Thu sinh khối
(a)


37

Ghi chú:
(a) xem phƣơng pháp thu sinh khối
(b) xem phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối
o Phƣơng pháp thu sinh khối
 Nguyên tắc
Nhằm đảm bảo thu một lƣợng sinh khối đồng đều giữa các đĩa, chúng tôi dùng
cùng một lƣợng thể tích dung dịch để đồng nhất sinh khối và thu nhận một thể tích
dịch sinh khối nhất định.
 Tiến hành
Hút 6 ml NaCl 9%
0
vào mỗi đĩa. Dùng que cấy trang trộn đều sinh khối trên
mặt thạch NaCl 9%

0
. Chuyển 4 ml dịch sinh khối vào ống nghiệm.
o Phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối [9,40]
 Nguyên tắc
Số lƣợng bào tử L. sporogenes trong sinh khối chỉ có thể đếm đƣợc sau khi đã
pha loãng nhiều lần và cấy trang trên đĩa. Ngoài ra, để đánh giá chính xác số lƣợng
bào tử trƣớc khi cấy trang, chúng tôi gia nhiệt những ống pha loãng ở nhiệt độ và
thời gian thích hợp để tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dƣỡng. Những bào tử còn sống
sau quá trình gia nhiệt sẽ hồi sinh trở lại khi cấy trang. Vì vậy, số khuẩn lạc đặc
trƣng thu nhận đƣợc cũng tƣơng ứng với số bào tử trong dịch pha loãng.
 Tiến hành
Từ sinh khối thu đƣợc, hút 1ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%
0
để có nồng
độ pha loãng 10
-1
. Hút tiếp 1 ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%
0
để có nồng độ
pha loãng 10
-2
. Tiếp tục nhƣ thế cho đến nồng độ pha loãng 10
-9
. Giữ 3 ống 10
-7

,10
-8
, 10
-9

bồn nƣớc 100
0
C/10 phút. Hút 0,1 ml dịch khuẩn ở 3 nồng độ trên và trang
trên 2 loại môi trƣờng thạch đĩa GYE và MRSA, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ
37
0
C/48 giờ. Đếm số lƣợng khuẩn lạc trong mỗi đĩa và tính số bào tử có trong sinh
khối ban đầu.
 Tính kết quả
Số khuẩn lạc trong 1 g hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi độ pha loãng

38


Công thức

Số khuẩn lạc trung bình trong 1 g hay 1 ml mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp
khác nhau

3.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics 7.0 để so sánh số lƣợng
bào tử khác nhau ở các điều kiện khảo sát

V
1
h
1
x
N
X

X: số lƣợng khuẩn lạc trong 1 g mẫu hay 1 ml
dịch mẫu
N: tổng số khuẩn lạc trong các đĩa cùng nồng
độ pha loãng
x: số đĩa cùng nồng độ pha loãng
h: nồng độ pha loãng (10
-7
, 10
-8
, 10
-9
)
V: thể tích dịch mẫu cấy trên 1 đĩa (ml)
3
XXX
Y
321

Y: số khuẩn lạc trung bình ở các nồng độ pha

loãng
X
1
, X
2
, X
3
: số lƣợng khuẩn lạc trung bình có
trong 1 g hay 1 ml mẫu ở các nồng độ pha
loãng

39

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.4. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes
4.4.1. Kết quả phân lập
Từ chế phẩm, chúng tôi phân lập đƣợc 20 chủng L. sporogenes (xem Bảng 4.1)
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L. sporogenes
Số khuẩn lạc nghi
ngờ đƣợc chọn
Khuẩn lạc có hình thái vi/đại
thể phù hợp với L. sporogenes
Khuẩn lạc có sinh hóa phù
hợp với L. sporogenes
20
Số lƣợng
Tỷ lệ (%)
Số lƣợng
Tỷ lệ (%)
20

100%
20
100%
Vì 100% khuẩn lạc nghi ngờ đƣợc chọn đều có hình thái vi thể và đặc điểm sinh hóa
phù hợp với L. sporogenes nên chúng tôi kết luận trong chế phẩm của Thorne Research
(USA) chỉ thuần một loại vi khuẩn L. sporogenes.
4.4.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes
4.4.2.1. Quan sát khuẩn lạc
Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng GYE ở 37
0
C/48 giờ. Chúng tôi quan sát
đƣợc hình dạng khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, lồi, đều, màu vàng, bề mặt mịn; đƣờng kính
khuẩn lạc trung bình 2 – 3 mm; vùng môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc chuyển từ màu
tím sang màu vàng.

4.4.2.2. Quan sát hình thái tế bào

Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L. sporogenes trên môi trƣờng GYE

40
Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram khuẩn lạc điển hình phân lập đƣợc trên môi
trƣờng thạch GYE sau 48 giờ ủ ở 37
0
C. Vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi ở độ
phóng đại 1000 lần (100X). Hình thái của tế bào vi khuẩn đƣợc chúng tôi ghi nhận nhƣ
sau: hình que, bắt màu Gram (+), 2 đầu hơi tròn, không tạo chuỗi; kích thƣớc tế bào 0,4 –
0,8 µm  2,1 – 4,5 µm; bào tử nằm về một đầu tế bào (xem Hình 4.2).

4.4.2.3. Quan sát hình thái bào tử
Chúng tôi tiến hành nhuộm bào tử từ mẫu khuẩn lạc điển hình trên môi trƣờng GYE

sau 72 giờ ủ ở 37
0
C. Bào tử quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần có những
đặc điểm sau: hình bầu dục; phình to ở một đầu tế bào; bắt màu hồng; kích thƣớc 1 – 1,2
µm  1,2 – 1,8 µm.
4.4.3. Đặc điểm sinh hóa của L. sporogenes
Từ 20 chủng L. sporogenes phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành thử phản ứng sinh
hóa. Kết quả ghi nhận đƣợc trình bày qua bảng 4.2







Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L. sporogenes đƣợc phóng đại 1000 lần
dƣới kính hiển vi