Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes part 3 ppsx

21

D(-) acid lactic L(+) acid lactic
Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic.
L (+) acid lactic: đƣợc chuyển hóa hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng
hợp glycogen.
D (-) acid lactic: đƣợc chuyển hóa ít hơn và phần không chuyển hóa sẽ đƣợc bài tiết
dƣới dạng urine. Sự hiện diện của acid không đƣợc chuyển hóa trong ống tiêu hóa sẽ
gây tình trạng nhiễm acid trong trao đổi chất (metabolic acidosis) ở trẻ sơ sinh. Một số
loài Lactobacillus, tiêu biểu là L. acidophilus có sản xuất D (-) acid lactic nên lợi ích về
mặt lâm sàng là không chắc chắn mặc dù đã sớm đƣợc sử dụng trong nhiều liệu pháp.
Vì vậy, xu hƣớng mới trong sản xuất probiotic là tìm những nguồn vi sinh vật có khả
năng tạo ra L (+) acid lactic sẽ an toàn hơn cho sức khỏe. Đại diện tiêu biểu thỏa mãn
yêu cầu này là Lactobacillus sporogenes.
Ngoài ra, acid lactic còn làm hạ pH đƣờng ruột còn 4 – 5. Do đó, sự phát triển của
vi sinh vật gây thối và E. coli (thích nghi ở pH 6 – 7) bị ức chế.
Sản xuất bacteriocin và các cơ chất kháng khuẩn
Bacteriocin là protein hay hợp chất protein do vi khuẩn sản xuất có hoạt tính diệt
khuẩn trực tiếp [23, 31]. Cơ chất này giúp vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hoạt tính ức
chế đối với các vi sinh vật gây thối trong hệ tiêu hóa.


Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus
Tên bacteriocin
Loài sản xuất
Acidolin
L. acidophilus
Acidophilin
L. acidophilus
Lactacin B

L. acidophilus

22
Lactacin F
L. acidophilus
Bulgarin
L. bulgaricus
Plantaricin SIK-83
L. plantarum
Plantaricin A
L. plantarum
Lactolin
L. plantarum
Plantaricin B
L. plantarum
Lactolin 27
L. helveticus
Helveticin J
L. helveticus
Reuterin
L. reuteri
Lactobrevin
L. brevis
Lactobacillin
L. brevis

Vi khuẩn Lactobacillus còn có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây thối
nhờ vào những sản phẩm trao đổi chất khác nhƣ: H
2
O

2
, CO
2
và diacetyl.
Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus [33]
Sản phẩm trao đổi chất
Tác dụng
1.Carbon dioxide
Ức chế sự khử nhóm carboxyl?
Làm giảm tính thấm của màng tế
bào?
2. Diacetyl
Tƣơng tác với các protein gắn kết
arginine
3. Hydrogen peroxide /
Lactoperoxidase
Oxi hóa những protein cơ bản

2.4.5.2. Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu
Các sản phẩm lên men từ sữa đã đƣợc dùng để chữa bệnh trong nhiều nền y học thời
xa xƣa ở Trung Cận Đông. Tuy nhiên giá trị về mặt dinh dƣỡng và trị liệu của các vi
khuẩn lactic vẫn còn đang đƣợc tranh cãi. Mặc dù vậy, một số nghiên cứu lâm sàng và
tiền lâm sàng đã cho thấy ích lợi của Lactobacillus (xem Sơ đồ 2.1).

23

Các lợi ích về mặt dinh dƣỡng
Nghiên cứu trên chuột cho thấy tốc độ phát triển và lƣợng ăn vào tăng lên khi cho
ăn sữa chua chứa Lactobacillus [10]. Vài loài Lactobacillus có khả năng tự tổng hợp
vitamin B. Hàm lƣợng các loại vitamin nhóm B và K trong sữa chua thƣờng cao hơn

trong sữa tƣơi. Ngoài ra, tính chất sinh học tự nhiên của Cu, Fe, Ca, Zn, Mg và P cũng
tăng lên khi dùng sữa chua làm thức ăn cho chuột [16].
Các lợi ích về mặt trị liệu
Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị vô số những
rối loạn và viêm nhiễm bao gồm: viêm ruột kết, táo bón, tiêu chảy, đầy hơi, bệnh
hepatic encephalopathy, ung bƣớu, lƣợng cholesterol trong máu cao, đau đầu và viêm
Lactobacillus
Trị liệu
Dinh dƣỡng
Phục hồi cân
bằng hệ vi sinh
vật đƣờng ruột
Giải độc tố
Cải thiện tình
trạng không dùng
đƣợc lactose
Tăng cƣờng
miễn dịch
Loại bỏ carcinogen
trong sản phẩm
cuối
Ngăn chặn sự
phát triển của
mầm bệnh trong
thực phẩm
Sản xuất
vitamin nhóm
B, K.
Tăng cƣờng
khả năng tiêu

hóa các chất
trong thực
phẩm và tăng
cƣờng những
hoạt tính sinh
học tự nhiên
của chất dinh
dƣỡng
Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dƣỡng và trị liệu [35]

24
âm đạo không điển hình, cải thiện tình trạng không sử dụng đƣợc lactose (lactose
intolerance).
Khẩu phần chứa Lactobacillus có tác dụng làm hạ cholesterol trong máu. Cơ chế tác
động của Lactobacillus lên quá trình hình thành cholesterol có thể đƣợc biểu diễn nhƣ
Hình 2.5.

Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol [35]
Ngoài ra, có nghiên cứu còn cho rằng Lactobacillus làm giảm lƣợng cholesterol gắn
cholesterol vào khoang ruột [17].
Lactobacillus tạo ra enzyme beta – galactosidase (lactase), có tác dụng thủy phân
lactose thành acid lactic [21]. Vì vậy, Lactobacillus giúp cải thiện tình trạng không sử
dụng đƣợc lactose ở những ngƣời thiếu enzyme lactase.
Vi khuẩn Lactobacillus sản xuất acid lactic và các cơ chất khác tạo một môi trƣờng
bất lợi cho sinh vật gây thối phát triển trong đƣờng tiêu hóa. Do đó, lƣợng urase trong
ruột giảm và kéo theo lƣợng NH
3
trong máu. Hơn nữa, pH thấp do acid lactic tạo ra gây
trở ngại cho NH
3

hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH
3
từ máu vào ruột
[24].
Những vi khuẩn gây thối rữa ở ruột kết tạo các enzyme beta-glucuronidase,
azoreductase và nitroreductase chuyển hóa procarcinogen thành carcinogen, chất có vai
trò trong việc hình thành và phát triển khối u. Bằng cách ức chế cạnh tranh và tạo môi
Chất béo trong khẩu phần
Nhũ hóa
Hấp thụ
Tổng hợp cholesterol
Muối mật
Lactobacillus ức
chế enzyme khử
hydroxymethyl
glutarate CoA,
enzyme này hạn
chế tốc độ tổng
hợp cholesterol
Lactobacillus
kết hợp với
muối mật để
ngăn cản
muối mật đi
vào vòng tuần
hoàn máu.

25
trƣờng acid không thuận lợi, Lactobacillus đã kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn
trong ruột kết. Có lẽ điều này làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già [18].

Nhờ vào khả năng sản xuất acid lactic và bacteriocin trong đƣờng ruột,
Lactobacillus cải thiện tình trạng tiêu chảy. Acid lactic cũng giúp tăng cƣờng nhu động
ruột nên chữa đƣợc chứng táo bón.
Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy các loài Lactobacillus có thể thúc đẩy khả
năng sản xuất anfa-interferon, tính tự vệ của tế bào và hoạt tính của enzyme 2 – 5 A -
synthase. Viện Pasteur ở Tokyo đã ghi nhận đƣợc lƣợng interferon tăng 65% ở những
ngƣời tham gia thí nghiệm sau 2 tuần tiêu thụ chế phẩm chứa Lactobacillus [22].
Lactobacillus duy trì pH âm đạo ở khoảng 4 – 4,5 nhờ vào hoạt động lên men
glycogen thành acid lactic. Đây là môi trƣờng không thích hợp cho mầm bệnh phát
triển nhƣ Trichomonas vaginalis (protozoa kí sinh) và Candida albicans (nấm men),…
[30]
Khi dùng Lactobacillus kèm theo kháng sinh sẽ giúp ngăn ngừa các triệu chứng
trên. Lactobacillus thông qua các hoạt động trao đổi chất của mình: tạo acid lactic,
bacteriocin để cố định trong đƣờng ruột, âm đạo hay miệng và tạo môi trƣờng không
phù hợp cho mầm bệnh phát triển.
Lactobacillus có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột và
giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ. Nhờ vào sự giảm nồng độ NH
3
và hạn chế vi sinh
vật gây thối nhiễm vào đƣờng ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng trƣởng ở
thú nuôi [11].
2.4.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vƣợt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus
khác trong ứng dụng làm probiotic
Ngoài những chức năng sinh học kể trên, L. sporogenes còn vƣợt trội hơn các vi khuẩn
khác làm probiotic nhờ đáp ứng những yêu cầu của một loại probiotic lý tƣởng nhƣ:
Có nguồn gốc tự nhiên và thích hợp với cơ thể ngƣời và vật nuôi
Không mang độc tính hay bất kỳ một tác dụng phụ nào cho ngƣời và vật nuôi
Có khả năng gắn vào tế bào biểu mô ruột và cố định trên trên đƣờng tiêu hóa để
ngăn ngừa và chống mầm bệnh xâm nhập

26
Kháng đƣợc acid và mật, vẫn sống sau khi di chuyển từ dạ dày xuống ruột non
Lên men và tạo ra L (+) acid lactic, đƣợc chuyển hóa hoàn toàn trong quá trình
trao đổi chất nên không gây tình trạng nhiễm acid nhƣ D (-) acid lactic.
Tỉ lệ sống cao sau khi trải qua quy trình sản xuất (thu hoạch, sấy khô,…)
Tính ổn định cao ở nhiệt độ phòng khi trộn hay không trộn với những thành phần khác
Có tác dụng cải thiện sức khỏe vật chủ
Ngoài ra, L. sporogenes còn là loài Bacillus duy nhất dùng làm probiotic mang
chứng nhận an toàn cho sức khỏe GRAS (Generally Recognise As Safe) do FDA (Food
& Drug Administration) cấp. Vì những lý do kể trên giúp L. sporogenes ngày càng
đƣợc ƣa chuộng hơn Lactobacillus quen thuộc khác. Điển hình nhất trong số này là L.
acidophillus. Đây là loài vi khuẩn rất thông dụng và phổ biến có mặt trong sữa chua,
các loại thực phẩm lên men khác và thuốc trị rối loạn tiêu hóa,… và đƣợc con ngƣời tin
dùng từ rất lâu.
Những đặc điểm vƣợt trội của L. sporogenes so với L. acidophilus đƣợc thể hiện qua Bảng 2.7.









Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ƣu điểm của L. sporogenes so với L. acidophillus
Lactobacillus sporogenes

Lactobacillus acidophilus
Bào tử vẫn sống sau khi đã xử lý
100

o
C/20 phút trong môi trƣờng đệm

Tất cả tế bào sinh dƣỡng đều bị tiêu diệt
sau khi thanh trùng Pasteur.

27
phosphate.
Không yêu cầu phải có vitamin để
sinh trƣởng và phát triển.

Yêu cầu phải có vitamin cho sự sinh
trƣởng.
Khi gặp điều kiện bất lợi, tế bào sinh
dƣỡng tạo thành bào tử chống chịu tốt
với những điều kiện bất lợi: nhiệt độ,
pH thấp trong đƣờng tiêu hóa, dịch
mật, sấy khô, đông lạnh, bức xạ, hóa
chất diệt khuẩn và kháng sinh.

Vi khuẩn không tạo bào tử.
Tế bào sinh dƣỡng rất nhạy cảm với
nhiệt độ.
Lên men đồng hình tạo ra L (+) acid
lactic dễ dàng chuyển hóa trong cơ thể
[13].

Sản xuất D (-) acid lactic có thể gây
chứng nhiễm acid vào quá trình trao đổi
chất (tài liệu 159, International Dairy

Federeration, 1983)
Khả năng tái sinh tốt và tính ổn định
của bào tử nên vẫn đạt đƣợc hiệu quả
chữa trị dù chỉ dùng một liều nhỏ.


Khả năng tái sinh và tính ổn định của tế
bào kém nên phải uống một lƣợng lớn.
Có hạn dùng đến 3 năm khi trữ ở nhiệt
độ phòng

Bảo quản ở nhiệt độ 4-10
o
C để giữ hoạt
tính tế bào
Tuy nhiên, L. sporogenes có một khuyết điểm duy nhất đó là thời gian tồn tại trong
ống tiêu hóa chỉ trong 6 – 7 ngày. Cuối cùng, bào tử theo phân thải ra ngoài. Hiện nay,
cơ chế và nguyên nhân của vấn đề này còn đang đƣợc nghiên cứu.
2.4.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L. sporogenes

28
Từ khi đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1933 đến nay, L. sporogenes đã trải qua
nhiều nghiên cứu. Những khảo sát về độc tính, khả năng làm giảm cholesterol, trị viêm
âm đạo không điển hình, trị rối loạn tiêu hóa,… đã chứng minh dần những đặc tính có
lợi và vƣợt trội của vi khuẩn này. Các sản phẩm probiotic chứa L. sporogenes đƣợc sản
xuất ngày một nhiều hơn nhƣ: Lactospore®, Sporlac®, SANVITA,…của Sabinsa
Corporation, Lactopure của Pharmed Medicare, NaturaFlora® & NaturaFlora Kids
Formula-Chewable® của Natura Health,… [35, 36, 37, 38]
Một nghiên cứu của Tae-Han Kim và ctv (đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã
thành công khi dùng N – methyl – N’ – nitro – N – nitrosoguanidine (NTG) gây đột

biến kháng rifampicin cho L. sporogenes [20]. Điều mở ra hƣớng kết hợp L.
sporogenes với loại kháng sinh này dùng làm thuốc mà không gây bất hoạt sự phát triển
của L. sporogenes.



















29
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
3.1.1. Thời gian
Đề tài đƣợc thực hiện từ 2/2005 đến 8/2005
3.1.2. Địa điểm
Tại phòng vi sinh khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm, TPHCM
3.2. Vật liệu nghiên cứu

3.2.1. Mẫu khảo sát
Chế phẩm sinh học (Thorne Research, USA)

3.2.2 Môi trƣờng
Môi trƣờng phân lập và giữ giống: GYE (Glucose Yeast Extract) thạch đĩa và thạch
nghiêng
Môi trƣờng thử sinh hóa: GYE thạch nghiêng và lỏng, NB (Nutrient broth) bán lỏng,
các môi trƣờng đƣờng
Môi trƣờng khảo sát bào tử: GYE và MRSA thạch đĩa.
Môi trƣờng bảo quản: bột đậu nành sấy khô và glycerol
3.2.3. Hóa chất
Thuốc nhuộm Gram
NaCl 9%
0
; NaOH 0,1N; H
2
O
2
30%; FeCl
3
1N; phenol 1%
3.2.4. Thiết bị – dụng cụ
Thiết bị: tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp autoclave, bếp nấu, giá đỡ ống nghiệm
Dụng cụ: kính hiển vi, ống nghiệm, đĩa petri
3.3. Nội dung đề tài
Phân lập các chủng L. sporogenes từ các chế phẩm có sẵn
Khảo sát khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc
Khảo sát các điều kiện hình thành bào tử ở vi khuẩn L. sporogenes

30


3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của
L. sporogenes
3.4.2. Phân lập vi khuẩn

Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes

Lấy mẫu
Phân lập
Khảo sát
Đặc điểm hình thái
tế bào vi khuẩn
Đặc điểm sinh hóa
Xác định khả năng tạo
acid lactic
Khảo sát hình thái
khuẩn lạc
Khả năng tạo bào tử
Nhuộm Gram (trực
khuẩ n, Gram (+) ), sinh
bào tử ở mộ t đầ u.
Kiểm tra phản ứng sinh hóa
Đánh

giá
Môi trƣờng GYE, 37
o
C/48 giờ
Môi trƣờng GYE để giữ giống
ở nhiệt độ phòng
Mẫu