Luận văn : NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR part 6 pot

39

Những ô để trống
Nƣớc cất
Buffer
Đối chứng dƣơng
Đối chứng âm
Mẫu ly trích
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA
3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR
3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad
 Bƣớc 1: Cân khoảng 60 mg mẫu lá ớt đã qua chẩn đoán ELISA cho kết quả
dƣơng tính. Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA, rửa lại bằng nƣớc cất
siêu sạch, bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở 121
o
C trong 20 phút, sấy khô trong
một ngày đêm) nghiền thành bột mịn với nitơ lỏng. Thêm nitơ lỏng thƣờng xuyên,
không để cho mẫu bị nóng lên.
 Bƣớc 2: Lấy muỗng cho vào hết trong tube ly tâm 2ml có nắp đậy (không có
RNase). Hòa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) có bổ sung PVP 2% (hỗn
hợp này đã đƣợc trộn trƣớc: 14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu)
 Bƣớc 3: Cho 700µl dung dịch đã đƣợc trộn ở bƣớc trên vào tube chứa mẫu,
trộn thật kỹ bằng pipet khoảng 10 lần
 Bƣớc 4: Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Chuyển toàn bộ dịch nổi vào tube ly

tâm 2ml mới.
 Bƣớc 5: Thêm 700 µl ethanol 70%, hoà tan bằng pipet cho đến khi không còn
sự phân lớp
 Bƣớc 6: Ủ ấm dung dịch hoà tan (elution solution) trong bồn ủ ở 70
o
C (để
chuẩn bị cho bƣớc 15). Đặt RNA binding column (RNAbc) vào tube 2ml không nắp.
40

 Bƣớc 7: Cho 700µl dung dịch ở bƣớc 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong
60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tƣơng tự cho đến hết phần dịch còn lại.
 Bƣớc 8: Dịch rửa low stringency từ 5X pha loãng bằng ethanol 95 – 100%
xuống còn 1X
 Bƣớc 9: Cho 700µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng
trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc
 Bƣớc 10: Pha Dnase I với 250µl Tris 10mM pH 7.5. Hoà tan bằng pipet.
 Bƣớc 11: Trộn 5µl Dnase I với 75µl dung dịch Dnase dilution trong tube
1.5ml, cho vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 30 giây. Loại bỏ
dịch lọc.
 Bƣớc 12: Cho 700µl high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30
giây, loại bỏ dịch lọc.
 Bƣớc 13: Thực hiện tƣơng tự nhƣ bƣớc 12 nhƣng với dung dịch low
stringency.
 Bƣớc 14: Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.
 Bƣớc 15: Chuyển RNAbc vào tube 1.5ml có nắp đậy, cho vào 80µl dung dịch
hoà tan ở bƣớc 6. Để 1 phút, ly tâm 12000 vòng trong 2 phút để thu RNA tổng số. Bảo
quản ở 4
o
C.
3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di

 Bƣớc 1: Các mẫu sau khi ly trích xong, hút 2µl để chạy điện di, thấy xuất hiện
các vệt băng.
 Bƣớc 2: Xử lý với RNase: hút 1µl RNase cho vào tube chứa 2µl mẫu RNA
tổng số vừa ly trích
3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR
 Primers (mồi): Dƣới đây là một số cặp primer đƣợc sử dụng trong PCR để
khuếch đại một đoạn gen trong genome của virút TSWV
L1 TSWV R 5’-AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC-3’
L2 TSWV F 5’-ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA-3’
(J.Morris)

TSWV-CP–17F TSWV 5’ – CTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGA– 3’
TSWV-CP–100RTSWV5’–TCTCAAAGCTATCAACTGAAGCAATAA-3’
41

(J.Morris)

TSWV723 CAC AAG GCA AAG ACC TTG AG 2698-2717b 620
TSWV722 GCT GGA GCT AAG TAT AGC 2098-2118c

5’ATGTCTAAGGTTAAGCTC-3
5 TTAAGCAAGTTCTGTGAG-3 )(protein vỏ)(800bp)
(P. Sreerama Kumar, 2000)
 Tiến trình PCR là một tiến trình rất nhạy, nếu các primer không đƣợc kiểm tra
trƣớc về độ đặc hiệu (tức là ngoài sản phẩm chính theo mong đợi thì nó còn có thể
khuếch đại với các loài khác gây ức chế phản ứng PCR), ngoài ra còn phải kiểm tra có
bao nhiêu vị trí trên genome mà primer có thể bắt cặp đƣợc. Chính vì lý do này mà
chúng ta phải kiểm tra để chọn ra cặp primer thích hợp cho việc khuếch đại bằng PCR.
Công việc này đƣợc thực hiện bởi phần phần mềm Blast hiện có trên mạng Internet.
Các bƣớc thực hiện nhƣ sau:

 Bƣớc 1: Vào trang chủ NCBI
 Bƣớc 2: Vào Folder Blast
 Bƣớc 3: Nhập trình tự của cả hai primer vào
 Chú ý: Nhập nhƣ sau: Primer1 nnnnnnnnnnnnn Primer2 (lấy bổ sung và đảo đầu
đối với primer2 này vì genome của con virút TSWV là RNA sợi đơn)
3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR
RT – PCR hai bƣớc
Bƣớc 1: Reverse transcription
 Thành phần hoá chất







 Thể tích RNA tổng số chạy thí nghiệm: 2µl; 4µl; 6µl; 8µl; 10µl

 iScript Reaction Mix 4µ

 iScript Reverse Transcriptase 1µ

 Nuclease-free water 13µ

 RNA khuôn mẫu 2µ

Tổng thề tích 20µ

42

 Chu trình nhiệt
5 phút ở 25
o
C
30 phút ở 42
o
C
5 phút ở 85
o
C
Giữ ở 4
o
C
Bƣớc 2: Khuếch đại bằng PCR
 Thành phần hoá chất
Nồng độ đầu Nồng độ cuối
iTaq buffer 10X 5µl 1X
MgCl
2
50mM 1.5µl 1.5mM
dNTP mix 10mM 1µl 200µM
iTaq DNA polymerase 0,25µl 1,25units
primer 1 2µl 0,1pmol
primer 2 2µl 0,1pmol
Nuclease-free-water 33,25µl
DNA đã qua Reverse 2µl
Tổng thể tích 50µl

 Chu trình nhiệt cho phản ứng
1 chu kỳ 5 phút ở 94
o
C
30 chu kỳ 1 phút ở 94
o
C
1 phút ở 55
o
C
1 phút ở 72
o
C
1 chu kỳ 10 phút ở 72
o
C
Giữ ở 4
o
C trong 15 phút
 Chú thích: Trên đây là protocol chuẩn (J.Morris), nhƣng trong quá trình
tiến hành chúng tôi thấy không cho kết quả nên đã có một số thay đổi mang tính chất
thí nghiệm để tìm ra qui trình phù hợp, một số thay đổi nhƣ sau:
 Hạ nhiệt độ bắt cặp từ 55
o
C xuống 50
o
C; 48
o
C; 46
o

C
 Hạ nhiệt độ bắt cặp kết hợp với tăng chu kỳ từ 30 chu kỳ lên 35 chu
kỳ; 45 chu kỳ
43

 Hạ nhiệt độ bắt cặp, tăng chu kỳ kết hợp với tăng nồng độ primers từ
5pmol lên 50pmol (đã qua tham khảo thầy cô và bạn bè)
 Tăng nồng độ MgCl
2
từ 1,5µl lên 2µl; 2,5µl
 Ly tâm nhẹ RNA tổng số để mong thu đƣợc nồng độ cao hơn
 Tăng nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25U lên 2,5U
RT – PCR hai bƣớc
 Thành phần hoá chất
Dung dịch đ ệm AMV/Tfl 5X 10µl 1X
dNTP mix (10mM m ỗi lo ại dNTP) 1µl 0,2mM
MgSO
4
25mM 2µl 1mM
Primer xuôi 50pmol 1µM
Primer ngƣợc 50pmol 1µM
AMV Reverse Transcriptase (5u/µ) 1µl 0,1u/µl
Tfl DNA polymerase (5u/µl) 1µl 0,1u/µl
RNA tổng số 5µl
Nuclease-free Water 28µl
Tổng thể tích 50µl
 Chú thích: có chạy kèm đối chứng dƣơng của công ty Promega để
kiểm tra thao tác và hoạt động của máy.
 Chu trình nhiệt
1 chu kỳ 45

o
C trong 45 phút
1 chu kỳ 94
o
C trong 2 phút
45 chu kỳ 94
o
C trong 30 giây
50
o
C trong 1 phút
72
o
C trong 1 phút
1 chu kỳ ở 72
o
C trong 10 phút
1 chu kỳ ở 4
o
C trong 15 phút
3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di
 Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2%
 Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50-60
o
C, sau đó đổ vào
khuôn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc
44

 Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào 1×TBE.
 Bƣớc 4: Hút 2µl loading dye trộn với 4µl mẫu

 Bƣớc 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4µl mẫu + dung dịch đệm.
 Bƣớc 6: Chạy điện di ở 100V/40mA, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận
cùng của gel là 1cm.
 Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5Ug/ml)
trong 20 phút.
 Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel với nƣớc đã qua chƣng cất.
 Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker.
 Bƣớc 10: Chụp bản gel để lƣu lại kết quả

45

Phần IV
Kết quả Thảo luận
4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đốn ELISA
4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra
Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng






12,1
12,5
0
0
2
4
6
8

10
12
14
Tỉ lệ (%)
Xã
Nhuận Đức
Phước Thạnh
Lộc Hưng

Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.

 Qua kết quả trên chúng tơi thấy rằng tỉ lệ nhiễm TSWV trên các địa bàn xã tại
hai huyện Củ Chi (12,1%) và Châu Thành (12,5%) còn ở mức thấp, trái lại trên địa
bàn xã Lộc Hƣng huyện Trảng Bàng tỉnh Tây Ninh chƣa thấy mầm mống của virút
TSWV (0%).
Địa bàn Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm TSWV % mẫu nhiễm TSWV

Nhuận Đức 91 11 12,1

Phƣớc Thạnh 32 4 12,5

Lộc Hƣng 12 0 0
46

4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt
 Hiện tại theo nghiên cứu này chúng tôi chƣa xác định đƣợc tỷ lệ bệnh nhiễm
vào từng giống ớt là do yếu tố khách quan vì rất ít hộ nông dân nắm vững tên của
giống ớt mà họ đang trồng. Đa số ngƣời dân chỉ biết là mua ớt tại công ty nào thôi, chứ
ớt giống gì thì bà con hầu nhƣ chƣa quan tâm lắm. Dƣới đây là một số giống ớt theo
chẩn đoán là đã bị nhiễm virút TSWV

Hình 4.1: Ớt Ba tri (tên ngƣời dân thƣờng gọi) bị nhiễm TSWV


Hình 4.2: Ớt hiểm Bungari (tên ngƣời dân thƣờng gọi) bị nhiễm TSWV


47

4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng
Triệu chứng bệnh trên cây ớt là rất nhiều nhƣng qua quá trình tham khảo tài liệu
cùng với phán đoán chủ quan thì chúng tôi ghi nhận lại các triệu chứng nhƣ sau:
 Lá khảm vàng xanh, cong.

Hình 4.3: Ớt có triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong (hình chụp tại vƣờn của chủ hộ
Nguyễn Văn Bảnh, ấp Bầu Tròn - Nhuận Đức - Củ Chi ngày 21 tháng 3
năm 2005)
 Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo,co lại, dày, giòn

Hình 4.4: Ớt có triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn (hình
chụp tại vƣờn ông Cần, ấp Phƣớc Thuận - Phƣớc Thạnh – Châu Thành -
Tiền Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005)




48

 Khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ

Hình 4.5: Ớt có triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ (hình chụp tại vƣờn ông
Huỳnh Ngọc Đạt, ấp Phƣớc Thuận – Phƣớc Thạnh – Châu Thành – Tiền
Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005)

 Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ

Hình 4.6: Ớt có triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ (hình chụp tại vƣờn bà
Nguyễn Thị Liễu, ấp Bầu Tròn - Nhuận Đức ngày 15 tháng 3 năm 2005)