Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ part 6 doc

46
Bảng 4.4 Kết quả phát hiện các gen độc lực cho một số khuẩn lạc E. coli riêng lẻ
phân lập được từ phân heo tiêu chảy
Mẫu Gen độc lực
Loại khuẩn lạc
khuẩn lạc được
chọn
stx1 stx2 eae hly lt sta stb vt2e
1HS
(Eae, hly)
1 - - - - - - - -
2 - - + - - - - -
3 - - - - - - - -
1TS
(Eae, hly)
2 - - - - - - - -
3 - - - - - - - -
4 - - - - - - - -
2HS
(stx1, hly)
4 - - - - - - - -
5 - - - - - - - -
6 - - - - - - - -
3HS
2 - - - - - - - -
(stb)
5 - - - - - - - -
3TS
(stb)
3 - - - - - - - -

4 - - - - - - - -
4HM
(stb)
1 - - - - - - + -
3 - - - - - - - -
4HS
(stb)
5 - - - - + - + +
6 - - - - - - + -
4TS
(lt, stb)
1 - - - - + - + +
2 - - - - - - + -
6TS
(lt, stb)
3 - - - - + - + -
4 - - - - + - + -
6HS
(stb, vt2e, lt)
1 - - - - - - - +
6 - - - - + - + -
5HS
(lt, stb, vt2e)
2 - - - - + - - +
6 - - - - + - - +
8HM
(lt, stb)
1 - - - - - - - -
6 - - - - - - - -

47
4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy
Bảng 4.5 Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại diện
cho E. coli trong phân bê tiêu chảy
Mẫu Gen độc lực
Thứ tự
Loại khuẩn lạc
stx1 stx2 eae

hly lt sta stb vt2e
HM

TS HS
1
x - - - - - - - -
x - - - - - - - -
2
x - - - - - - - -
x - - - - - - -
3
x - - - - - - - -
x - - - - - - - -
4
x + - - - - - - -
x + - - - - - - -
5
x - - - - - - - -
x - - - - - - - -

6
x + - + + - - - -
x + - + + - - - -
7
x + + - - - - -
x + + - - - - - -
8
x - - - - - - - -
x - - - - - - - -
9
x - - - - - - - -
10
x - - - - - - - -
Tổng 8 3 7 3 1 1 1 0 0 0 0
Tỉ lệ(%) 80 30 70 30 10 10 10 0 0 0 0

Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ 10 mẫu phân bê
tiêu chảy được trình bày ở bảng 4.5.
- Trong tổng số 10 mẫu phân có 3/10 (30%) mẫu phát hiện được E. coli mang
gen độc lực, trong đó:

48
 3/10 (30%) mẫu phân phát hiện được E. coli mang gen stx (stx1
hoặc/và stx2).
 1/10 (10%) mẫu phân phát hiện được E. coli mang gen eae.
 1/10(10%) mẫu phân phát hiện được E. coli mang gen hly.
- Trong 10 mẫu phân bê tiêu chảy, không phát hiện được E. coli mang gen độc
lực của nhóm ETEC, chỉ phát hiện được E. coli mang gen của nhóm STEC. Theo
Beutin và ctv (1993), Chapman và ctv (1997), STEC được tìm thấy nhiều trong phân
của bò, bê. Một vài dòng STEC có khả năng gây tiêu chảy cho bò, đặc biệt là bê

(Smith và Scoland, 1998; Gyles, 1992).
- Các gen stx1, stx2, eae, hly được phát hiện, trong khi gen vt2e thì không được
phát hiện ở bất kì nhóm khuẩn lạc E. coli phân lập từ 10 mẫu phân bê tiêu chảy. Kết
quả này là hoàn toàn hợp lý vì gen vt2e chỉ được tìm thấy trong nhóm STEC ở heo
(Beutin và ctv, 1995). Theo Blanco và ctv (1997), gen vt2e là một biến chủng của gen
stx2, biến chủng này chỉ được phát hiện ở những dòng E. coli gây phù thủng trên heo.
Có 3 mẫu phát hiện được E. coli mang gen độc lực là mẫu 4, 6, 7.
 Ở mẫu phân 4 có 2 loại khuẩn lạc HS và HM. Cả hai loại khuẩn lạc này
đều mang gen stx1.
 Ở mẫu phân 6 có hai loại khuẩn lạc HS và HM. Cả hai loại khuẩn lạc
này đều mang gen stx1, eae, hly. Việc phát hiện nhiều gen độc lực trên
cùng một mẫu sẽ tăng nguy cơ gây bệnh. Độc tố Hly gây xuất huyết ruột
(Botteldoorn và ctv, 2003), gen hly có thể phát hiện cùng với gen stx1,
stx2, eae trong phân của những bệnh nhân HUS (Paton và Paton, 1998
a
).
 Ở mẫu phân 7 có 2 loại khuẩn lạc HS và HM. Cả hai loại khuẩn lạc này
đều mang gen stx1, stx2.
- Như vậy, trên cùng một mẫu phân bê tiêu chảy được phân lập trên 2 loại môi
trường SMAC, MAC đều cho kết quả phát hiện gen độc lực giống nhau. Điều này
chứng tỏ không có sự khác biệt về khả năng phát hiện gen độc lực giữa các loại khuẩn
lạc (Hồng trên MAC hoặc hồng trên SMAC).




49
* Tổng kết việc phát hiện gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy
trên, ta có những nhận xét sau:
- Khả năng phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy

lần lượt là 25% trên phân bò tiêu chảy, 30% trên phân bê tiêu chảy, 88,89% trên phân
heo tiêu chảy.
4.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò
Như đã trình bày ở phần 4.1.1, chúng tôi chỉ thu được nhóm khuẩn lạc trắng
trên môi trường CT-SMAC (kí hiệu TC).
Bảng 4.6 Kết quả phát hiện các gen độc lực của nhóm khuẩn lạc đại diện
cho E. coli trong mẫu bề mặt thịt bò
Mẫu
Gen độc lực
stx1

stx2 eae hly lt sta stb vt2e
1
- - - - - - - -
2
- - - - - - - -
3
- - - - - - - -
4 - - - - - - - -
5
- - - - - - - -
6
- - - - - - - -
7
- - - - - - - -
8
- - - - - - - -
9
- - - - - - - -
Tổng 0 0 0 0 0 0 0 0

Tỷ lệ (%)

0 0 0 0 0 0 0 0

Qua bảng 4.6, kết quả phát hiện các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt, sta, stb,
vt2e từ nhóm khuẩn lạc TC phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò là âm tính. Kết quả này có
thể giải thích như sau:
- Có thể do số mẫu xét nghiệm ít.
- Do quy trình giết mổ đảm bảo vệ sinh.
- Do mẫu xét nghiệm âm tính thật sự vì bò lấy mẫu không mang dòng E. coli
gây độc.

50
4.6. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát
Với 36 mẫu khảo sát gồm 8 mẫu phân bò tiêu chảy, 9 mẫu phân heo tiêu chảy,
10 mẫu phân bê tiêu chảy, và 9 mẫu bề mặt thịt bò, tổng kết kết quả phát hiện các gen
độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát được trình bày ở bảng 4.7 và biểu đồ 4.1
Bảng 4.7 Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các mẫu
khảo sát
Mẫu N n
Gen độc lực
stx1 stx2

eae hly lt-I sta stb vt2e
Phân bò
tiêu chảy

8
(%)

2
25
0
0
2
25
0
0
1
12,5
0
0
0
0
0
0
0
0
Phân heo
tiêu chảy

9
(%)

8
88,89

1
11,11

0
0
1
11,11

2
22,22

5
55,56

0
0
6
66,67

3
33,33

Phân bê
tiêu chảy

10
(%)

3
30
3
30
1

10
1
10
1
10
0
0
0
0
0
0
0
0
Bề mặt
thịt bò
9
(%)

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0
Tổng
36 13 4 3 2 4 5 0 6 3
% 36,1 11,11

8,33

5,56 11,11

13,89

0 16,67

8,33

N: Số lượng mẫu khảo sát
n: Số lượng mẫu phát hiện E. coli có mang gen độc lực

51

Như vậy, qua bảng 4.7 và biểu đồ 4.1, trong 36 mẫu khảo sát gồm 27 mẫu có
nguồn gốc từ bò (8 mẫu phân bò tiêu chảy, 10 mẫu phân bê tiêu chảy, và 9 mẫu bề mặt
thịt bò), và 9 mẫu phân heo tiêu chảy.
Ở phân bò tiêu chảy phát hiện được E. coli mang gen stx2 (25%) và hly
(12,5%). Ở phân bê tiêu chảy, phát hiện được E. coli mang gen stx1 (30%), stx2
(10%), eae (10%), hly (10%). Như vậy ở các mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bò chỉ phát
hiện được nhóm STEC. Điều này hợp lí so với kết quả nghiên cứu của Beutin và ctv
(1993). Ông cho rằng phân bò là nguồn lưu cữu chủ yếu của nhóm STEC.
Ở phân heo tiêu chảy, phát hiện được E. coli mang gen stb (66,67%), lt-I
(55,56%), vt2e (33,33%), hly (22,22%), stx1 (11,11%), eae (11,11%). Như vậy, ở phân
heo tiêu chảy phát hiện được E. coli nhóm STEC và ETEC.




Biểu đồ 4.1 Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các
mẫu khảo sát

52

Phần 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận
Từ những kết quả thu nhận được trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi rút
ra những kết luận sau:
(5) E. coli trên môi trường thạch MAC chỉ xuất hiện 1 loại khuẩn lạc hồng (HM),
trên môi trường thạch SMAC xuất hiện 2 loại khuẩn lạc trắng (TS) và hồng
(HS), trên môi trường thạch CT-SMAC xuất hiện 1 loại khuẩn lạc trắng.
(6) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có
mang gen độc lực đó.
(7) Tần số phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần
lượt là: 25% trên phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% trên phân bê tiêu chảy
(stx1, stx2, hly, eae), 88,89% trên phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1,
eae).
(8) Điều này chứng tỏ rằng trên cả 3 nhóm đối tượng trên, E. coli mang các gen
độc lực có thể là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy.
(9) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được vi khuẩn E. coli mang gen độc lực
(10) Chưa phát hiện được gen sta trong E. coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy
của bò, bê và heo.
5.2. Đề nghị
(1) Có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện gen độc lực của những
dòng E. coli gây bệnh, góp phần chẩn đoán bệnh cho gia súc và người, kiểm tra
vệ sinh an toàn thực phẩm.
(2) Tăng số lượng mẫu khảo sát, định serotype bằng kháng huyết thanh chuẩn
(antisera).

53
TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục
Thành phố Hồ Chí Minh.

2. Lê Thị Mai Khanh, 2004. Phát hiện một số gen độc lực của Escherichia coli
phân lâp được từ phân và thịt của bò, heo bằng kỹ thuật multiplex – PCR.
Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Trường đại học Nông Lâm TP.
HCM.

3. Trần Thanh Phong, 1996. Bệnh truyền nhiễm do vi trùng trên heo. Tủ sách
Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.

TIẾNG NƯỚC NGOÀI.
4. Barrett T. J., Kaper L. B., Jerse A. E., and Wachsmuth I. K., 1992. Virulence
factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli isolated from humans
and cattle. J. Infect. Dis. 165: 970-980.

5. Bertschinger H. U. and Fairbrother J. M.,1999. Escherichia coli infections. In
Diseases of swine (Eds. B. E. Straw, S. D’ Allaire, W. L. Mengeling, and D.
J. Taylor). Iowa State University Press, Iowa, USA.

6. Beutin L., Montenegro M. A., Orskov I., Orskov F., Prada J., Zimmermann
S., and Stephan R., 1989. Close association of verotoxin (shiga-like toxin)

producing Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 27:2559-2564.

7. Beutin L., Geier D., Steinruck S., Zimmermann S., and Scheutz F., 1993.
Prevalence and some properties of verotoxin (Shiga-like-toxin)-producing
Escherichia coli in seven different species of healthy domestic animals. J.
Clin. Microbiol. 31:2483-2488.

8. Beutin L., Aleksic S., Zimmermann S., and Scheutz F., 1994. Virulence
factors and phenotypic traits of verotoxigenic Escherichia coli isolated from
human patients in Germany. Med. Microbiol. Immunol. (Berlin) 183:13-21.

9. Beutin L., Geier D., Zimmermann S., and Karch H., 1995. Virulence markers
of Shiga like toxin producing Escherichia coli strains originating from
healthy domestic animals of different species. J. Clin. Microbiol. 33:631-635.

10. Black R. E., Merson H. M., Huq I., Aleim A. R. M., and Yunus N., 1981.
Incidence and severity of rotavius and Echerichia coli in rural Banglades.
Lancet I:141-143.


54
11. Blanco M., Blanco J. E., Gonzalez E. A., Mora A., Jansen W., Gomes T. A.
T., Zerbini L. F., Yano T., de Castro A. F. P., and Blanco J., 1997. Gene
coding for enterotoxins and Verotoxins in Porcine Escherichia coli strains
belonging to different O:K:H serotype: relationship with phenotype. J. Clin.
Microbiol. 35:2958-2963.

12. Botteldoorn N., Heydrick M., Rijpens N., Herman L., 2003. Detection and
characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC
multiplex – PCR in porcine faeces in pig carcass swabs. Res. Microbiol.

154:97-104.

13. Brown T. A., 1994. Gene cloning and introduction. 3
rd
edition. UMIST,
Manchester, UK

14. Butler D., 1996. Novel pathogens beat food safety check. Nature 384:397.

15. Calderwood S. B., Acheson D. W. K., Keuch G. T., Barrett T. J., Griffin P.
M., Strockbine N. A., 1997. Proposed new nomenclature for SLT (VT)
family. ASM News 1997:118-119.

16. Cebula T. A., Payne W. L., and Fegn P., 1995. Simultaneous identification of
strains of Escherichia coli serotype 0157:H7 and their Shiga-like toxin type
by Mismatch amplification mutation assay multiplex – PCR. J. Clin.
Microbiol. 33:28-250.

17. Cerna J. F., Nataro J. P, and Garcia T. E., 2003. Multiplex – PCR for
detection of three plasmid borne genes of enteroaggregative Escherichia coli
strains. J. Clin. Microbiol. 42:2138-2140.

18. Chalmers R. M., Salmon R. L., Willshaw G. A., Cheasty T., Looker N.,
Davies I., and Wray C., 1997. Verocytotoxin-producing Escherichia coli
O157 in a famer handling horses. Lancet 349:1816.

19. Chapman P. A., and Siddons C. A., Cerdan Malo A. T., and Harkin M. A.,
1997. A 1 – year study of Escherichia coli in cattle, sheep, pigs and poultry.
Epidemiol. Infect. 119:245-250.

20. Cocolin L., Manzano M., Cantoni C., Comi G., 2000. A multiplex-PCR
method to detect enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC)
Escherichia coli in arttificially contaminated foods. Int. J. Hyg. Environ.
Health. 203:159-164.

21. DesRosiers A., Fairbrother J. M., Johnson R. P., Desautels C., Letellier A.
Qeessy S., 2001. Phenotypic and genotypic characterization of Escherichia
coli verotoxin-producing isolates from humans and pigs. J. Food Protect.
64:1904-1911