Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP part 7 ppsx

49


 gi|12744677|gb|AF319491.1|AF319491 Papaya ringspot virus isolate QrFC-1
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744675|gb|AF319490.1|AF319490 Papaya ringspot virus isolate OxT-80
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744673|gb|AF319489.1|AF319489 Papaya ringspot virus isolate OxT-66
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744671|gb|AF319488.1|AF319488 Papaya ringspot virus isolate OxT-27
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744667|gb|AF319486.1|AF319486 Papaya ringspot virus isolate McFJ-57
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744665|gb|AF319485.1|AF319485 Papaya ringspot virus isolate McFJ-18
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744659|gb|AF319482.1|AF319482 Papaya ringspot virus isolate JlPV-13
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12584306|gb|AY017190.1| Papaya ringspot virus clone CpT-30 polyprotein
gene, partial cds
 gi|12584304|gb|AY017189.1| Papaya ringspot virus clone GrCy-9 polyprotein
gene, partial cds
 gi|11141739|gb|AF309968.1|AF309968 Papaya ringspot virus isolate Colima
coat protein (CP) mRNA, partial cds
 gi|63034424|gb|DQ008449.1| Papaya ringspot virus P isolate VER75-pr.8-5
coat protein gene, partial cds
 gi|63034422|gb|DQ008448.1| Papaya ringspot virus P isolate VER74-pr.8-12
coat protein gene, partial cds
 gi|63034420|gb|DQ008447.1| Papaya ringspot virus P isolate VER73-pr.8-8
coat protein gene, partial cds

 gi|63034418|gb|DQ008446.1| Papaya ringspot virus P isolate VER72-pr.8-25
coat protein gene, partial cds
 gi|58531193|dbj|AP008212.1| Oryza sativa (japonica cultivar-group)
genomic DNA, chromosome 6, complete sequence
 gi|58197799|gb|AC154401.2| Mus musculus BAC clone RP23-166O7 from
13, complete sequence


50


429 bp
 gi|4582483|gb|AC006312.8|AC006312 Homo sapiens chromosome 9,
clone hRPK.401_G_18, complete sequence
 gi|21202838|dbj|AP003489.2| Oryza sativa (japonica cultivar-group)
genomic DNA, chromosome 6, PAC clone:P0568D10
 gi|40539136|gb|AC126426.3| Mus musculus BAC clone RP24-291G13
from chromosome 13, complete sequence
Sau khi tra cứu độ đặc hiệu của cặp mồi 1, nhận thấy có một nghi vấn đặt ra đó là
sản phẩm kích thƣớc 900 bp thu đƣợc này có phải đã đƣợc khuếch đại từ trình tự của
gene CP trên PRSV hay không? Hay đó chỉ là sự bắt cặp không đặc hiệu của mồi với
một đoạn gene lạ, tạp nhiễm cũng có kích thƣớc 900 bp.
Để khẳng định độ đặc hiệu của cặp mồi 1 cũng nhƣ khẳng định sản phẩm kích
thƣớc 900 bp trên là đƣợc khuếch đại từ gene CP của PRSV, với sự giúp đỡ của thầy
Đinh Duy Kháng- Viện Công Nghệ Sinh Học Hà Nội, chúng tôi đã thiết kế hai cặp
mồi đặc hiệu hơn cho đoạn gene CP của PRSV, gồm P7-M30 và P14-M31 (với trình
tự đƣợc nêu ở phần Vật liệu và phƣơng pháp). Với hai cặp mồi này, chúng tôi tiến
hành thí nghiệm nested- PCR, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Từ sản phẩm khuếch đại của cặp mồi 1, sử dụng 1μl sản phẩm này làm khuôn cho
phản ứng PCR tiếp theo với cặp mồi P7-M30 (mọi thông số để thực hiện phản ứng

đƣợc giữ nguyên nhƣ cũ).

Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên
sản phẩm thu đƣợc từ cặp mồi 1


51


Nhận xét:
Kết quả phản ứng PCR trên cặp mồi P7-M30 chỉ cho 1 band duy nhất với kích
thƣớc 429 bp, điều này đã giải tỏa đƣợc nghi ngờ về sản phẩm 900 bp thu đƣợc từ cặp
mồi 1. Chứng tỏ sản phẩm 900 bp này đúng là đã đƣợc khếch đại từ trình tự gene CP
của PRSV.
- Để kiểm chứng lại độ tin cậy của thí nghiệm Nested-PCR trên hai cặp mồi 1 và
P7-M30, chúng tôi tiến hành thí nghiệm Nested-PCR một lần nữa trên hai cặp mồi P7-
M30 và P14-M31 (trình bày ở phần Vật liệu và phƣơng pháp).
Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi P14-M31 trên khuôn mẫu là sản phẩm cDNA
thu đƣợc từ phản ứng sao chép ngƣợc RNA tổng số từ kit ly trích (với quy trình và hóa
chất PCR đƣợc giữ nguyên nhƣ chuẩn ban đầu).


Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31
Nhận xét:
Sản phẩm khuếch đại chỉ gồm một band duy nhất với kích thƣớc 658 bp, chứng tỏ
cặp mồi P14-M31 là đặc hiệu.
Từ sản phẩm 658 bp này, ta lấy 1μl sản phẩm để sử dụng làm khuôn cho phản ứng
PCR tiếp theo với cặp mồi trong là P7-M30 (với quy trình chuẩn ban đầu).
658 bp

52



Hình 4.7 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30
Nhận xét:
Từ hai thí nghiệm Nested-PCR trên đã khẳng định chắc chắn về độ đặc hiệu của các
cặp mồi 1, P7-M30, P14-M31 và sự hiện diện của trình tự CP gene của PRSV trong
mẫu bệnh thu đƣợc.
Nhƣ đã nêu ở phần Vật liệu và Phƣơng pháp, các mẫu sử dụng trong thí nghiệm
RT-PCR là các mẫu dƣơng tính chọn lọc từ kết quả của test kit ELISA. Với kết quả
dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp RT-PCR đã củng cố và bổ sung cho kết quả thu
đƣợc từ phƣơng pháp ELISA. Nhận thấy, dù chẩn đoán bệnh bằng phƣơng pháp nào đi
nữa thì độ tin cậy đều nhƣ nhau. Tuy nhiên, mỗi phƣơng pháp có những ƣu nhƣợc
điểm riêng và do đó tùy thuộc điều kiện, yêu cầu cụ thể mà ta chọn phƣơng pháp ứng
dụng cho phù hợp.
Những ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp ELISA và RT-PCR
Ƣu điểm
- Phƣơng pháp ELISA cho phép phát hiện đồng thời một lƣợng mẫu lớn hơn rất
nhiều so với phƣơng pháp RT-PCR (thƣờng một kit PLANTEST ELISA
®
chuẩn có thể
chẩn đoán cùng một lúc 135 mẫu).
- Phƣơng pháp RT-PCR lại có độ nhạy cao hơn.
429 bp


53

Nhƣợc điểm
- Phƣơng pháp RT-PCR do cần phải có giai đoạn tách chiết RNA nên tốn nhiều thời
gian hơn; mẫu RNA sau đó phải đƣợc bảo quản ở điều kiện lạnh, sạch, an toàn. Nếu
không, mẫu để lâu sẽ không đảm bảo, dễ nhiễm RNase từ môi trƣờng làm phân hủy
RNA mẫu, gây hiện tƣợng âm tính giả; hoặc dễ nhiễm RNA lạ từ môi trƣờng làm
nhiễu kết quả thí nghiệm, đôi khi còn gây hiện tƣợng dƣơng tính giả.
- So với ELISA, RT-PCR đòi hỏi điều kiện thực hiện thí nghiệm nghiêm ngặt hơn,
phải có hóa chất và dụng cụ chuyên dùng khi thao tác với RNA. Điều kiện thí ngiệm
phải luôn đảm bảo ở nhiệt độ lạnh hoặc mát; luôn đeo găng tay để tránh Rnase trên
đầu ngón tay dính vào mẫu, eppendoff…
- Hóa chất sử dụng cho tách chiết và thực hiện RT-PCR phải có độ tinh khiết cao,
do đó giá thành cũng cao hơn so với ELISA. Vì vậy, việc chẩn đoán bệnh bằng kĩ
thuật RT-PCR khó thực hiện và phổ biến rộng rãi đối với các nƣớc có nền kinh tế còn
khó khăn, đang phát triển. Từ đó nó cản trở khả năng phổ biến, ứng dụng vào thực tiễn
của phƣơng pháp RT-PCR.
Nhìn chung ELISA có độ nhạy thấp hơn song xét về mặt kinh tế và tính dễ thực
hiện nó có nhiều ƣu điểm hơn so với kĩ thuật RT-PCR.
4.4. Kết quả giải trình tự một số mẫu
Các mẫu đƣợc chọn giải trình tự bao gồm:
- Mẫu thu tại xã Mỹ Hiệp (khuếch đại với cặp mồi P14-M31, có kích thƣớc sản phẩm
là 658 bp)
- Mẫu thu tại xã Mỹ Hiệp (khuếch đại với cặp mồi P7-M30, có kích thƣớc sản phẩm
là 429 bp)
- Mẫu thu tại huyện Định Quán (khuếch đại với cặp mồi P7-M30, có kích thƣớc sản
phẩm là 429 bp)
Kết quả giải trình tự cho thấy
Mỹ Hiệp (658 bp)
Chỉ giải trình tự đƣợc với mồi P14, mồi M31 bị nhiễu nhiều. Song kết quả đọc của
mồi P14 khá tốt, đoạn thu nhận có kích thƣớc 619 bp (xem phần Phụ lục 8).

54


Định Quán (429 bp)
Giải trình tự đƣợc với cả hai mồi P7 và M30. Sau khi sử dụng phần mềm
CLUSTALX để thu nhận trình tự bắt cặp của hai mồi (sản phẩm PCR mong muốn),
thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 412 bp (xem phần Phụ lục 9).
Mỹ Hiệp (429 bp)
Giải trình tự đƣợc với cả hai mồi P7 và M30. Sau khi xử lý với phần mềm
CLUSTALX, thu đƣợc đoạn sản phẩm PCR có kích thƣớc 410 bp (xem phần Phụ lục
10).
Cuối cùng, lấy cả 3 trình tự đã đƣợc chọn lọc ở trên đem so sánh sự tƣơng đồng một
lần nữa với phần mềm CLUSTALX. Thu đƣợc đoạn tƣơng đồng chung cho cả 3 mẫu,
đoạn này có kích thƣớc 393 bp (xem phần Phụ lục 11).
Từ trình tự trên, sử dụng phần mềm CLUSTALX để so sánh nó với trình tự của CP-
PRSV và genome của PRSV trên Genebank.
Kết quả so với trình tự của CP-PRSV trên Genebank

CLUSTAL X (1.83) multiple sequence alignment

3
AJ012649 TCCAAGAATGAAGCTGTGGATGCTGGTTTGGATGAAAAACTCAAAGAAAAAGAAAAACAG 60

3
AJ012649 AAAGAAAAAGAAAAACAAAAAGAAAAAGAAAAAGACAATGCTAGTGACGGAAATGATGTG 120

3
AJ012649 TCGACTAGCACAAGAACTGGAGAGAAAGATAGAGATGTCAATGTCGGGACCAGTGGAACT 180

3 1 CCGAGAATAAAATCATTTACTGACAAGATGATTTTACCGAAAATTAAAGGA 51
AJ012649 181 TTCACGGTTCCGAGAATTAAATCATTCACTGATAAGATGATTCTACCAAGAATTAAGGGA 240
190******** ******** ***** ********* **** * ****** ***

3 AAAACTGTCCTTAATTTTAAATCATCTTCTTCAGTATAATCCGCAACAAATTGATATCTC 111
AJ012649 AAGACTGTCCTTAATTT-AAATCATCTTCTTCAGTATAATCCGCAACAAATTGACATTTC 299
** ************** ************************************ ** **

3 AAACACTCGTGCCACTCAAACTCAATTCGAAAAGTGGTATGAGGGAGTGAGGAATGATTA 171
AJ012649 TAACACTCGTGCCACTCAGTCACAATTTGAGAAATGGTATGAGGGAGTGAGGAATGATTA 359
***************** * ***** ** ** **************************

3 CGGTCTCAACGATAACGAAATGCAAGTG-ATGTTAAACGGTTTGATGGTTTGGTGTATTG 230
AJ012649 TGGTCTGAATGATAATGAAATGCAAGTG-ATGCTGAATGGCTTGATGGTTTGGTGTATCG 418
***** ** ***** ************ *** * ** ** ***************** *

3 AAAATGGTACATCTCCAGACTTATCTGGTGTTTGGGTAATGATGGATGGGGAAACACAAG 290
AJ012649 AGAATGGTACATCTCCAGACATATCTGGTGTTTGGGTTATGATGGATGGGGAAATTCAAG 478
* ****************** **************** **************** ****

3 TTGATTATCCCATTAAGCCTTTAATTGAACATGCAACTCCTTCGTTTAGGCAAATCATGG 350
AJ012649 TTGACTATCCAATCAAGCCTTTAATTGAGCATGCTACCCCGTCATTTAGGCAGATTATGG 538
**** ***** ** ************** ***** ** ** ** ******** ** ****

3 351 CTCACTTCAGTAACGCGGCAGAGGCATACATCGCAAAGAGGAATG 396
AJ012649 CTCACTTTAGTAACGCGGCAGAAGCATATATTGCAAAGAGAAATGCCACTGAGAGGTACA 598
******* ************** ***** ** ******** ****

55


Kết quả so với genome của PRSV trên Genebank


CLUSTAL X (1.83) multiple sequence alignment

3 1 CCGAGAATAAAATCATTTACTGACAAGATGATTTT 35
AY231130 CGGGACCAGTGGAACTTTCACGGTTCCGAGAATTAAATCATTCACTGATAAGATGATTCT 9480
******** ******** ***** ********* *
9444
3 ACCGAAAATTAAAGGAAAAACTGTCCTTAATTTTAAATCATCTTCTTCAGTATAATCCGC 95
AY231130 ACCAAGAATTAAGGGAAAGACTGTCCTTAATTT-AAATCATCTTCTTCAGTATAATCCGC 9539
*** * ****** ***** ************** **************************

3 AACAAATTGATATCTCAAACACTCGTGCCACTCAAACTCAATTCGAAAAGTGGTATGAGG 155
AY231130 AACAAATTGACATTTCTAACACTCGTGCCACTCAGTCACAATTTGAGAAATGGTATGAGG 9599
********** ** ** ***************** * ***** ** ** **********

3 GAGTGAGGAATGATTACGGTCTCAACGATAACGAAATGCAAGTG-ATGTTAAACGGTTTG 214
AY231130 GAGTGAGGAATGATTATGGTCTGAATGATAATGAAATGCAAGTG-ATGCTGAATGGCTTG 9658
**************** ***** ** ***** ************ *** * ** ** ***

3 ATGGTTTGGTGTATTGAAAATGGTACATCTCCAGACTTATCTGGTGTTTGGGTAATGATG 274
AY231130 ATGGTTTGGTGTATCGAGAATGGTACATCTCCAGACATATCTGGTGTTTGGGTTATGATG 9718
************** ** ****************** **************** ******
3 GATGGGGAAACACAAGTTGATTATCCCATTAAGCCTTTAATTGAACATGCAACTCCTTCG 334

AY231130 GATGGGGAAATTCAAGTTGACTATCCAATCAAGCCTTTAATTGAGCATGCTACCCCGTCA 9778
********** ******** ***** ** ************** ***** ** ** **

3 TTTAGGCAAATCATGGCTCACTTCAGTAACGCGGCAGAGGCATACATCGCAAAGAGGAAT 394
AY231130 TTTAGGCAGATTATGGCTCACTTTAGTAACGCGGCAGAAGCATATATTGCAAAGAGAAAT 9838
******** ** *********** ************** ***** ** ******** ***
3 395 G
AY2311309839 GCCACTGAGAGGTACATGCCGCGGTATGGAATCAAGAGAAATTTGACTGACATTAGCCTC 9898
583
Nhận xét
Khi đem so sánh đoạn chung nhất của cả 3 mẫu đƣợc giải trình tự, nhận thấy sự
tƣơng đồng của nó với genome cũng nhƣ trình tự gene CP của PRSV là tƣơng đối cao
(chi tiết xem Phụ lục 12 và 13). Chứng tỏ mẫu bệnh dƣơng tính từ phản ứng PCR
chính là gene CP của PRSV. Vậy kết quả PCR thu đƣợc là đúng với sản phẩm lý
thuyết của cặp mồi tƣơng ứng. Điều này khẳng định quy trình RT-PCR đã thiết lập với
các cặp mồi P7-M30, P14-M31 là hoàn toàn đáng tin cậy.


56


PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Dựa trên các kết quả thu đƣợc, chúng tôi đi đến kết luận nhƣ sau:
Kết quả từ thí nghiệm với bộ kit DAS ELISA:
- Tỉ lệ nhiễm bệnh ở các địa điểm: Xã Mỹ Hiệp: 92,68 %
Xã Bình Thạnh: 77,42 %
Xã Phú Tân: 47,37 %
Xã Phú Lộc: 47,37 %

Xã Phú An: 16 %
- Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây: Giống Da bông: 86,54 %
Giống Mã Lai: 80 %
Giống Địa phƣơng: 34,92 %
- Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây: 4 – 5 tháng: 70 %
6 – 8 tháng: 85,71 %
8 – 11 tháng: 12,5 %
Trên 1 năm: 36,11 %
Kết quả với thí nghiệm RT-PCR
- Cặp mồi 1: là một cặp mồi không đặc hiệu, có thể nhân bản nhiều trình tự cDNA
thu đƣợc từ kit ly trích RNA tổng số của mẫu bệnh. Tuy nhiên, vẫn nhân bản đƣợc
trình tự mong muốn.
- Cặp mồi P14-M31: là một cặp mồi đặc hiệu cho trình tự CP gene của PRSV. Cặp
mồi này chỉ nhân bản trình tự gene CP và cho duy nhất một sản phẩm với kích thƣớc
mong muốn.
- Cặp mồi P7-M30: cũng có độ đặc hiệu cao cho trình tự gene CP của PRSV. Nó chỉ
nhân bản một trình tự gene duy nhất từ sản phẩm thu đƣợc từ PCR với cặp mồi P14-
M31, cho sản phẩm là một band duy nhất với kích thƣớc mong muốn.
Từ kết quả thí nghiệm với kĩ thuật Nested-PCR trên hai cặp mồi P14-M31 và P7-
M30 đã khẳng định sản phẩm thu đƣợc chính là trình tự CP gene của PRSV. Chứng tỏ
mẫu dƣơng tính từ ELISA cũng cho kết quả dƣơng tính ở phƣơng pháp RT-PCR.



57


- Giải đƣợc trình tự một số mẫu bệnh thuộc hai xã Mỹ Hiệp và Định Quán. So sánh
kết quả trình tự vừa đƣợc giải mã và các trình tự CP gene, genome trên Genebank,
nhận thấy có sự tƣơng đồng cao, chứng tỏ sản phẩm PCR thu nhận đƣợc đúng là đoạn

mong muốn.
- Quy trình RT-PCR để chẩn đoán PRSV là hoàn toàn đáng tin cậy mặc dù vẫn cần
phải tiếp tục hoàn thiện một số thông số.
5.2. Đề nghị
Một số việc chúng tôi vẫn chƣa thực hiện đƣợc do điều kiện thời gian và hóa chất
không cho phép, chúng tôi đề nghị:
- Với mỗi bộ kit PLANTEST
®
ELISA (gồm 5 dĩa ELISA), chỉ nên thực hiện với
một chỉ tiêu cần đánh giá (chỉ xem xét về địa điểm hoặc giống hoặc độ tuổi). Mỗi chỉ
tiêu sẽ đƣợc thống kê trên số lƣợng 135 mẫu/kit, nhƣ vậy mới đảm bảo độ tin cậy của
những thống kê trên chỉ tiêu mong muốn.
- Quy trình phản ứng Nested-PCR vẫn chƣa thật hoàn chỉnh, kết quả thu nhận qua
điện di còn nhiều khuyết điểm (band điện di bị smear nhiều). Do đó chúng tôi đề nghị
cần có thêm thời gian và hóa chất để cải thiện quy trình nhƣ: thay đổi các thông số về
nhiệt độ, thời gian, số chu kì, hóa chất (Taq polymerase, MgCl
2
, lƣợng khuôn mẫu….).
- Tăng số lƣợng mẫu đƣợc giải trình tự để có thể so sánh đƣợc mối quan hệ dòng,
giống giữa các mẫu thu thập ở các địa bàn khác nhau.


58


TÀI LIỆU THAM KHẢO


TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử- Những nguyên tắc cơ
bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp. Trang 195 – 216.

2. Nguyễn Mạnh Chinh, 2002. Rệp hại cây trồng và biện pháp phòng trừ. Nhà xuất
bản Nông nghiệp, TP. HCM. 106 tr.

3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử (Khái niệm- Phương pháp- Ứng
dụng). Tái bản lần thứ nhất. Nhà xuất bản Giáo dục, TP. HCM. 301 trang.

4. Nguyễn Thành Hối, Dƣơng Minh và Võ Thanh Hoàng, Khoa Trồng trọt, Đại học
Cần Thơ, 1996. Cây đu đủ. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 20 trang.

5. Nguyễn Văn Huỳnh và Võ Thanh Hoàng, 1997. Sâu, bệnh hại cây ăn trái. Nhà xuất
bản Nông nghiệp, Hà Nội. 76 trang.

6. Z. Kiraly, Z. Klement, F. Solymosy và J. Voros, 1983. Những phương pháp nghiên
cứu bệnh cây (Vũ Khắc Nhƣợng và Hà Minh Trung dịch). Nhà xuất bản Nông
nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 145 trang.

7. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông
nghiệp, Hà Nội. 103 trang.

8. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh cây nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông
nghiệp, Hà Nội. Trang 7 – 31; 220 – 232; 251 – 252.

9. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà
xuất bản Giáo dục, Hà Nội. Trang 121 – 201.

10. Võ Hữu Thành và Trần Thanh Phong, 2003. Kĩ thuật trồng Đu đủ. Sở Nông
nghiệp và PTNT Tiền Giang, Trung tâm Khuyến nông. 16 trang.

11. Nguyễn Xuân Thành, 1996. Sâu hại Bông, Đay và thiên địch của chúng ở Việt
Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 159 trang.

12. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, Hà Nội.
Trang 23 – 47; 149 – 166.

13. Cục Bảo vệ Thực vật, 2003. Phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây
trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 45 trang.