Tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein (NIb) của một số dòng virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya Ringspot virus-PRSV) ở Việt Nam

MỞ ĐẦU
Đu đủ (Carica papaya L.) là cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, quả đu đủ rất giàu
dinh dưỡng. Ngoài ra, nhựa đu đủ còn là nguồn nguyên liệu để tách papain, một loại
enzym đã được thương mại hoá sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và
thuộc da. Ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ khoảng 2500 ha, với sản lượng hàng năm
khoảng 100 nghìn tấn, có giá trị tương đương 4,5 triệu USD [6,34].
Đu đủ là cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới mắc rất nhiều bệnh, trong đó bệnh
đốm vòng do papaya ringspot virus (PRSV) gây ra là một trong những nguyên nhân chính
làm giảm năng suất và chất lượng quả đu đủ. Bệnh được truyền do các loài rệp cây nên lan
rộng rất nhanh chóng. Đến nay, toàn bộ diện tích trồng đu đủ ở nước ta cũng như các vùng
khác trên thế giới như Australia [39], Thái Lan [46]. Hawaii [37,45]… đều bị nhiễm bệnh
virus đốm vòng. Những biện pháp truyền thống sử dụng để ngăn cản sự lan truyền của
PRSV chỉ mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này, hơn nữa lại đòi hỏi
nhiều thời gian và công sức. Gần đây, với việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của sinh
học phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, đặc biệt là sử dụng các vật liệu di
truyền từ các virus gây bệnh chuyển vào cây để tạo ra các cây trồng chuyển gen kháng
bệnh virus đã thu được các kết quả đáng khích lệ, như đu đủ chuyển gen CP (coat protein)
kháng PRSV đã được thương mại hoá trên thế giới [25], cây khoai tây chuyển gen NIb
kháng PVY (potato virus Y) [18]...
Một trong những thách thức vẫn còn tồn tại là phổ kháng bệnh của những cây
chuyển gen này phụ thuộc vào độ tương đồng về mặt di truyền của chủng virus có gen được
sử dụng để tạo cây chuyển gen và các dòng virus gây bệnh trong tự nhiên. Chẳng hạn các
giống đu đủ chuyển gen CP của Hawaii hoàn toàn không có khả năng kháng lại các dòng
PRSV của Việt Nam. Vì vậy, việc khảo sát tính đa dạng di truyền của gen chuyển có ý nghĩa
rất quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. Nghiên cứu về đánh giá
tính đa dạng của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam, Chu Hoàng Hà và
cộng sự (2004) cho biết 16 dòng PRSV phân lập từ các khu vực khác nhau của Việt Nam có
mức độ giống nhau về trình tự gen CP từ 89,7% đến 99,8%. Trong đó 4 dòng virus Tuyên
Quang, Kon Tum, Sài Gòn và Cần Thơ có tính đại diện cao nhất [4].
Trên cơ sở đó, 4 chủng PRSV trên đã được lựa chọn cho nghiên cứu “Tách
dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein

(NIb) của một số dòng virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya Ringspot
virus-PRSV) ở Việt Nam” nhằm tìm hiểu sự đa dạng ở mức độ phân tử ở gen NIb của
1
cỏc dũng virus ny v to nguyờn liu cho nghiờn cu to cõy u chuyn gen khỏng
PRSV Vit Nam.
Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Giới thiệu chung về cây đu đủ
1.1.1. Phân loại
Cây đu đủ (Carica papaya L.) thuộc ngành Mộc lan (hạt kín,
Magnoliophyta), lớp Mộc lan (hai lá mầm, Magnoliopsida), phân lớp Sổ
(Dilleniidae), liên bộ Hoa tím (Violananae), bộ Hoa tím (Violales), họ Đu đủ
(Caricaceae) [11]. Carica l chi lớn nhất trong họ với 23 loài.
1.1.2. Nguồn gốc
Mặc dù có ý kiến cho rằng nguồn gốc của C. papaya ở châu Mỹ nhiệt đới [32],
nhng nó có thể bắt nguồn từ vùng đất thấp thuộc phía đông của Trung Mỹ, từ
Mexico tới Panama [38]. Hạt của nó đợc phát tán tới Carribean và Đông Nam á nhờ
những ngời thám hiểm Tây Ban Nha vào thế kỷ 16, từ đó nó đợc lan đi nhanh chóng
tới ấn Độ, Thái Bình Dơng và châu Phi [44].
Đu đủ đã đợc trồng ở Việt Nam cách đây vài trăm năm và hiện nay đang đợc
trồng phổ biến trong các vờn cây từ Bắc chí Nam [10].
Theo các nhà khoa học, những giống đu đủ đầu tiên nhập vào nớc ta bằng hạt vì hạt
đu đủ vừa nhiều, vừa nhỏ, lại có thể bảo quản lâu. Bắt đầu từ khi những cha cố ngời
Pháp, Tây Ban Nha khoảng thế kỷ 17, rồi sau này các chuyên gia nông nghiệp Pháp,
Mỹ và nhiều quốc tịch khác, không ai biết bao nhiêu giống đu đủ đã vào Việt Nam.
Đu đủ lại là giống cây ăn quả ngắn ngày thụ phấn ngoại hoa, nhiều biến dị. Nhiều
giống đã hình thành từ địa phơng với các tên gọi không thống nhất [10].
1.1.3. Giá trị sử dụng
Trớc hết đu đủ là một loại thực phẩm thông dụng giàu dinh dỡng. Quả chín là
một món ăn bổ dỡng có vị thơm ngon, chứa nhiều vitamin và muối khoáng (Bảng 1).
Quả đu đủ có thể dùng làm rợu, mứt đờng, sấy khô và sắc đờng kính [44]. Quả

xanh, lá và hoa có thể đợc sử dụng nh một loại rau ăn và chế biến một số món ăn
truyền thống (nh hầm thịt vì trong quả và lá xanh có chứa nhiều enzym có tác dụng
giống nh pepsin của dạ dày, nhất là giống trypsin của tụy trong việc tiêu hoá chất
thịt, hay nấu cháo cùng thông thảo, ý dĩ và móng dò cho các phụ nữ đang cho con
bú, hay chế biến món bún chả Hà Nội rất nổi tiếng ).
Hơn nữa, đu đủ còn đợc sử dụng trong công nghiệp. Lá và quả xanh có chứa
một số protein và alkaloid ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và dợc phẩm.
2
Trong đó papain là enzym thuỷ phân quan trọng nhất đợc sản xuất từ nhựa của quả
non, xanh và đã đợc thơng mại hoá, sử dụng trong công nghiệp đồ uống, thức ăn, và
dợc phẩm, bao gồm các sản phẩm keo dính, chỉ thị bia lạnh, làm mềm thịt, thuốc chữa
bệnh tiêu hoá và chứng hoại th. Papain còn đợc sử dụng trong công nghiệp dệt để kéo
tơ, làm mềm len và trong công nghiệp mỹ phẩm, xà phòng, dầu gội đầu [39,44].
Bảng 1. Thành phần dinh dỡng của quả đu đủ chín (trên 100g) [43]
STT Thành phần 100g quả chín
1 Năng lợng 35 59 cal
2 Nớc 88,40 90,70 g
3 Protein 1,00 1,50 g
4 Chất béo 0,10 g
5 Carbonhydrat 7,10 13,50 g
6 Canxi 11 31 mg
7 Photpho 7 17 mg
8 Sắt 0,60 0,70 mg
9 Natri 2 3 mg
10 Kali 39 337 mg
11 Caroten 1,16 2,43 mg
12 Vitamin B1 0,03 0,08 mg
13 Vitamin B2 0,70 0,15 mg
14 Vitamin B5 0,10 mg
15 Vitamin C 69,30 71,00 mg

Đặc biệt đu đủ còn có tác dụng nh một vị thuốc. Papain có tính chất làm dễ
tiêu hoá và giải độc. Nó làm triệt tiêu progesteron, một hormon sử dụng cần thiết
chuẩn bị cho tử cung thụ thai và duy trì sự sống cho bào thai sau đó. Hạt đu đủ chứa
myrosin và kali myronat khi kết hợp với nhau tạo thành tinh dầu mùi diêm sinh hắc.
Quả xanh chỉ đợc chỉ định dùng trong chứng thiểu năng tiêu hoá, dạ dày và tụy,
trong sự giảm dịch vị hay sự lên men dạ dày, trong viêm dạ dày mãn tính, lên men
ruột và viêm dạ dày ruột non của trẻ em. Hạt thờng dùng làm thuốc trị giun. Rễ
dùng trị sốt rét và làm thuốc lợi tiểu. Lá dùng tiêu mụn nhọt, lá nấu nớc dùng tẩy
sạch vết máu ở vải và rửa vết loét, vết thơng, sát trùng. Nhựa bôi mặt nạ bị tàn nhang
và các vết nhơ khác ở da, hắc lào mới phát, các loại lở sần da ngoan cố. Hoa đực
dùng trị ho gà [2].
Nh vậy đu đủ rất có ích cho con ngời, có thể sử dụng ở tất cả các phần, từ
hoa, quả, lá, rễ cho đến nhựa cây.
3
1.1.4. Năng suất, chất lợng
Sản lợng quả đu đủ chín ở nớc ta ớc tính đạt 100.000 tấn/năm. Mỗi kilôgam
quả chín trị giá khoảng 2500đ đến 3500đ thì tổng giá trị đạt từ 250 - 350 tỉ đồng
(khoảng 15 -20 triệu đôla Mỹ) [34].
Tổng sản lợng quả đu đủ tơi trên thế giới năm 1995 ớc tính đạt 5 triệu tấn, đạt
giá trị khoảng 1,5 đến 2 tỉ đôla Mỹ [34].
Bảng 2. Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớc [12]
Nớc sản xuất
Tổng sản lợng các năm ( x1000 tấn)
1989-1991 1995 1996 1997
Thế giới 3625 5091 5011 5024
+ châu Phi 786 780 786 780
+ Bắc Mỹ 404 591 599 599
+ Nam Mỹ 1263 2029 2090 2105
+ châu á
1156 1610 1518 1520

- Indonexia 342 597 500 500
- ấn Độ
399 490 500 500
- Trung Quốc 94 142 143 143
- Thái Lan 100 120 115 115
- Việt Nam 54 57 58 61
1.1.5. Phân bố
Bảng 3. Vùng phân bố tập trung của cây đu đủ ở Việt Nam
STT Vùng phân bố Diện tích (ha)
1 Vùng núi và Trung du phía Bắc (Sơn La, Lạng Sơn) 500
2
Đồng bằng sông Hồng (Hà Nội, Hng Yên, Nam Hà,
Ninh Bình)
250
3 Ven biển miền Trung (Nghệ An, Thanh Hoá) 100
4
Đồng bằng sông Mê Kông (Ninh Thuận, Nha Trang,
Tây Ninh, Tiền Giang)
500-550
Đu đủ đợc trồng ở tất cả các nớc nhiệt đới và nhiều vùng cận nhiệt đới trên
thế giới [39]. ở nớc ta đu đủ đợc trồng trong vờn nhà (từ 5 đến 10 cây) của gần 50%
hộ nông dân. Đu đủ cũng đợc trồng tập trung trong các nông trờng hoặc trang trại
4
vùng đồng bằng sông Hồng, ven biển miền Trung, đồng bằng sông Mê Kông và sờn
núi đá vôi. Tổng diện tích vào khoảng 2500 ha gồm khoảng 1250 ha trồng tập trung
(Bảng 3) và 1250 ha trồng trong vờn nhà [34].
1.1.6. Bệnh ở cây đu đủ
- Bệnh đốm vòng: Còn gọi là bệnh đốm hình nhẫn là một bệnh rất phổ biến
trên cây đu đủ ở nớc ta và nhiều nớc khác trên thế giới, đợc coi là một trở ngại lớn
nhất cho nghề trồng đu đủ. Có thể nói ở đâu có trồng đu đủ là ở đó có bệnh này.

Bệnh do papaya ringspot virus gây ra. Đặc điểm chính của bệnh là làm lùn cây, sản
lợng quả bị giảm, lá bị khảm và biến dạng, tạo đốm có dạng nh một cái vòng màu
xanh mờ trên quả, cuống lá hay tạo các sọc xanh trên ngọn thân và cuống lá. ở quả
khi chín, các vòng lộ rõ có màu vàng, quả bị nhạt, do virut đã làm giảm lợng đờng
trong quả. ở mặt trên của các lá gần đỉnh sinh trởng, vùng mô lá ở giữa gân phụ và
gân nhánh bị nhăn phồng. Bìa lá non bị cuốn vòng vào theo mặt dới lá. Bìa lá già thì
cuốn lên [5].
- Bệnh khảm: do papaya mosaic virus gây ra. Giống nh bệnh đốm vòng, bệnh
khảm cũng là một bệnh rất phổ biến trên cây đu đủ. Cây bệnh có lá bị khảm gồm
nhiều vết xanh vàng lẫn lộn, khảm càng nặng, lá càng biến sang màu vàng. Lá bệnh
bị nhỏ lại, biến dạng, số thuỳ lá gia tăng, nhăn phồng. Lá bị rụng nhiều, chỉ trừ lại
chùm lá bị khảm vàng ở ngọn. Quả nhỏ biến dạng, chai sợng [5].
- Bệnh thối gốc: do nấm Pythium spp gây ra, làm cho lá vàng và quả bị rụng,
gốc thân nơi tiếp giáp mặt đất bị úng rồi thối, cây sẽ bị đổ và chết.
5
Hình 1. A: Hình ảnh cây đu đủ không nhiễm bệnh.
B,C,D: Hình ảnh vườn, cây, lá đu đủ bị nhiễm PRSV.
- Bệnh cháy lá: do nấm Helminthosporium gây ra, làm chóp lá bị đốm úng n-
ớc, rồi lan dần vào bên trong lá, làm lá bị nâu và khô. Nếu nhiễm nặng, cuống lá bị
héo, mềm và lá bị rụng [5].
- Bệnh đốm lá: do nấm Phyllosticta sulata gây ra. Trên lá đốm bệnh có hình
tròn, hình trứng hoặc thon dài hay bất dạng. Vùng giữa vết bệnh có màu bạc trắng,
viền có màu vàng hay nâu, vùng bệnh khô và mỏng dần rồi bị tách [5].
- Bệnh phấn trắng: do nấm Odium caricae gây hại. Lá bệnh bị đóng phấn
màu trắng ở mặt dới, nếu nặng lá sẽ phát triển kém, biến dạng ít. Quả cũng bị các
đốm phấn trắng tròn hoặc bầu dục và phát triển kém.
- Bệnh thối quả: do nhiều loại nấm (Rhizopus, Colletotrichum, Ascochyta,
Botryodiplodia, Phomopsis, Macrophoma, Fusarium, Alternaria) gây các triệu chứng
khác nhau [5].
- Bệnh do tuyến trùng (Meloidogyne incognita và Rotylenchulus reniformis):

phá hại rễ. Cây con nhiễm nặng có thể bị chết và cây lớn có thể giảm sức tăng trởng,
có thể dùng các thuốc trị tuyến trùng nh Mocap tới xung quanh vùng rễ [5].
1.2. Giới thiệu về virut gây bệnh đốm vòng ở đu đủ (PRSV)
1.2.1. Phân loại
PRSV là virut thực vật, thuộc chi potyvirus, họ potyviridae [29]. PRSV đợc
chia thành hai chủng dựa trên khả năng lây nhiễm của chúng là: PRSV-w và PRSV-
p. PRSV-p là virut phổ biến và gây thiệt hại lớn nhất tới đu đủ và bầu bí khắp thế
giới, còn PRSV-w chỉ ảnh hởng tới họ bầu bí, nhng trên thực tế không tìm thấy
PRSV-P trên cây bầu bí, mà chỉ tìm thấy qua các thí nghiệm [18]. PRSV đợc tìm
thấy lần đầu tiên vào năm 1949 khi phân lập virut từ đu đủ Hawaii và sau đó đợc tìm
thấy ở nhiều nớc khác trên thế giới [30]. Hai chủng này có quan hệ rất gần gũi với
nhau, có thể PRSV-p tiến hoá từ PRSV-w do đột biến [16].
1.2.2. Cấu trúc
PRSV không có vỏ bọc, nucleocapsid có dạng hình sợi, xoắn, với chiều
dài trọn vẹn 760-800nm, đờng kính 12nm (Hình 2). Virion chứa 5,5% axit
nucleic là một sợi ARN đơn dơng liên kết với protein (VPg) ở đầu 5 và có
đuôi poly(A) đầu 3 [19,29].
6
Hình 2. Cấu trúc của PRSV
A: PRSV dưới kính hiển vi điện tử, B: Cấu trúc bên ngoài
Hệ gen của PRSV dài khoảng 10326 nucleotit, ngoại trừ đầu poly(A), và
chứa một khung đọc mở lớn bắt đầu từ vị trí nucleotit 86-88 và kết thúc ở vị trí
10118-10120, mã hoá cho một polyprotein với 3344 axit amin [24]. Polyprotein
này đợc tự thuỷ phân tạo 12 protein trong đó có protein NIb, là enzym
polymerase cần thiết cho sự tái bản của ARN virut. Trình tự bảo thủ cao
AAAUAAAANANCUCAACACAUA ở đầu 5 của PRSV cũng đóng vai trò quan
trọng cho sự tái bản của potyvirus. Tổ chức gen của PRSV đợc đa ra tạm thời là
VPg-5 leader-63K NT-52K HC-Pro-46K-72K CI-6K-48K NIa-59K NIb-35K
coat protein- không mã hóa 3- vùng poly(A) (Hình 3) [48].
Hình 3. Bản đồ tổ chức genom của PRSV

1.2.3. Đặc tính gây bệnh
PRSV gây bệnh không truyền qua hạt giống, chúng lây bằng hai cách: Một là
do tiếp xúc cơ giới (thông qua các vết thơng cơ giới do trong quá trình canh tác con
ngời vô ý tạo ra, do ma gió gây xây sát hay do côn trùng hay động vật khác). Hai là
do côn trùng môi giới chủ yếu là các loài rệp thuộc họ Aphididae nh Aphis gosipii,
Aphis crasivora, đặc biệt loài rệp Myzus persicae, loài rệp này cũng thờng gây hại
nhiều cho các loại rau cải, bầu bí, mớp, da... Bệnh lây lan rất nhanh, nhất là những
cây đợc 5-6 tháng tuổi trở lên [13].
1.3. Gen NIb của PRSV
1.3.1. Cấu trúc của gen NIb
Gen NIb (nuclear inclusion body) nằm giữa gen NIa và gen CP, có kích thớc
khoảng 1554 bp, nằm từ vị trí nucleotit 7646 đến 9199.
7
1.3.2. Vai trò của protein NIb
Protein NIb là ARN polymerase phụ thuộc ARN (RNA-dependent RNA polymerase,
RdRp) của virut, chịu trách nhiệm tái bản phân tử ARN dơng và âm của virut [20]. Có
một vài dẫn chứng thực nghiệm trực tiếp về protein NIb potyvirus: Thứ nhất, đặc điểm
trình tự nổi bật nhất của protein NIb là một motif glycine-aspartate-aspartate (GDD)
đặc trng cho phần lớn virut ARN ở vi khuẩn, động vật và thực vật [32]. Khi so sánh
trình tự RdRp của virut ARN dơng và phân tích sự tiến hoá của nó có thể phân loại tất
cả các virut thành lớp, bộ, họ và chi [32,33,17]. Thứ hai, gần đây ngời ta đã chứng
minh đợc protein NIb có hoạt động RdRp [36]. Họ cũng đã tìm thấy protein NIb có t-
ơng tác với cả protein NIa và CP trong tế bào nấm men. Protein NIb tơng tác với vùng
VPg của protein NIa và tơng tác này đòi hỏi một vị trí gắn ARN chức năng. Tơng tác
này có thể quan trọng cho việc kích thích tổng hợp ARN virut trong các tế bào nhiễm.
Hoạt động polymerase của protein NIb có thể đợc kích thích bởi protein NIa và VPg. T-
ơng tác protein CP với NIb có khả năng thay đổi motif GDD. Vai trò của tơng tác này tới
hoạt động enzym của protein NIb hoặc chức năng của CP cha rõ ràng, nhng có thể cần
thiết cho việc tổng hợp ARN trong tế bào nhiễm virut [22,27].
Ngoài chức năng RdRp, protein NIb của TEV (tobacco etch virus) còn có

những chức năng khác, bao gồm những hoạt động dịch chuyển nhân [35]. NIb chứa
hai dấu hiệu định vị nhân độc lập (NLS I và NLS II). NLS I nằm ở vị trí axit amin 1
tới 17, và NLS II nằm giữa axit amin 292 và 316. Đột biến điểm cộng gộp dẫn đến
thay thế những gốc cơ bản trong các NLS, làm mất hoạt động dịch chuyển nhân.
Những đột biến này cũng làm mất sự khuếch đại ARN TEV khi đợc đa vào genom
của virut. Việc mất khả năng khuếch đại là do mỗi đột biến NLS đợc bổ sung vào sự
dịch chuyển (in trans) các tế bào truyền tin biểu hiện protein NIb chức năng. Điều
này chứng tỏ các NLS chồng lớp cần thiết cho chức năng dịch chuyển-hoạt động của
NIb. Thực tế chức năng in trans của NIb có nghĩa là nó phải tơng tác với một hoặc
nhiều thành phần khác của bộ máy sao chép của genom. Đột biến điểm cộng gộp ảnh
hởng motif GDD hoặc NLS II trong vùng trung tâm của protein NIb, nhng không phải
đột biến nào cũng ảnh hởng tới NLS I gần đầu N, làm giảm hoặc mất tơng tác. Vùng
C-terminal proteinase (Pro) của NIa, chứ không phải vùng N-terminal VPg, tơng tác
với NIb. Tác động của những đột biến NIb trong vùng NLS I, NLS II, và motif GDD
tới tơng tác giữa NIb và Pro-domain giống với ảnh hởng của những đột biến này tới t-
ơng tác giữa chiều dài đầy đủ của NIb và NIa [36]. NIb điều khiển quá trình tái bản
phức tạp thông qua một tơng tác với Pro-domain của NIa.
RdRp cần thiết cho sự sao chép genom của virut. RdRp cùng các thành phần
khác của virut và tế bào chủ, tạo thành một phức hợp sao chép thực hiện quá trình tái
8
bản genom virut. RdRp đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn sớm của sự tái bản
virut và làm tăng khả năng ức chế của enzym này, đợc xem nh chìa khoá tổng hợp
một phân tử đặc biệt, ví dụ scFv ức chế hoạt động enzym RdRp. Nói cách khác, việc
ngăn hay ức chế hoạt động RdRp có thể phá vỡ sự tái bản của virut ở giai đoạn sớm
hiệu quả hơn [26].
1.4. Các nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virut
PRSV là một trong những nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn tới năng suất và
chất lợng cây đu đủ và nhiều loại cây trồng khác có giá trị ở Việt Nam cũng nh thế
giới. Vì vậy, trên thế giới đã có rất nhiều nơi nghiên cứu về PRSV. Một số gen của
PRSV nh gen CP đã đợc nghiên cứu rất kỹ và đã chuyển vào cây để tạo cây đu đủ

chuyển gen. Nổi bật là phòng thí nghiệm tại trờng đại học Hawaii và đại học Cornell,
Mỹ. Hai nơi này đã đi tiên phong trong việc chuyển gen CP vào đu đủ để kháng bệnh
đốm vòng và đã mở ra một phơng pháp mới cho việc tạo các giống cây trồng kháng
bệnh virut. Các nhà khoa học ở đây đã đa gen CP của dòng virut PRSV HA 5-1 vào
vectơ pGA482 và chuyển thành công vào giống đu đủ "Sunset" bằng súng bắn gen,
tạo ra hai dòng đu đủ mang tên 55-1 và 63-1 có mang gen CP trong genom và đã
kiểm tra bằng lai Southern và ELISA. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng bệnh của thế
hệ R1 từ dòng 55-1 cho thấy chúng có tính kháng bệnh rất cao (chỉ có 5% của 128 cây đ-
ợc thử nhiễm bệnh) đối với các dòng virut phân lập ở Hawaii, nhng không kháng đợc
các dòng phân lập từ nơi khác. Dòng 55-1 này đã đợc lai với giống Kapoho tạo ra giống
đu đủ "Rainbow" đã đợc đăng ký bản quyền và trở thành giống đu đủ chuyển gen thơng
mại hoá đầu tiên trên thế giới có khả năng kháng lại PRSV [9].
Ngoài ra, gen NIb của PRSV cũng đợc quan tâm nghiên cứu. Đã có nhiều nớc phân
lập và xác định trình tự gen NIb nh ở Thái Lan, Poonpipit và cộng sự (2001) đã
phân lập đợc gen NIb của PRSV có kích thớc 1596bp [40]; ở Trung Quốc, Ye và cộng
sự (2002) phân lập đợc gen NIb của PRSV có kích thớc 1600bp [47]... Nhng hiện
nay việc nghiên cứu chuyển gen NIb vào cây đu đủ để tạo cây kháng bệnh vẫn
còn đang đợc tiếp tục tiến hành, cha có giống thơng phẩm nào đợc đa ra thị trờng.
Tuy nhiên, đã có nhiều cây trồng chuyển gen NIb kháng virut gây bệnh khác
nhau trên thế giới đợc tạo ra nh cây đậu, cây thuốc lá, cây khoai tây... Năm 1998,
Jones và cộng sự đã tạo ra đợc ba dòng đậu chuyển gen NIb kháng PSbMV (pea
seed-borne mosaic potyvirus), trong đó dòng PSbMV-DPD1 biểu hiện tính kháng
cao ngay lần nhiễm đầu tiên. Theo ông, tính kháng của cây đậu phụ thuộc vào mật
độ của virut nhiễm trên cây và số bản copy của gen NIb [31]. Khoai tây cũng là đối
tợng cây trồng đợc nghiên cứu nhiều về chuyển gen NIb kháng các loại virut khác
nhau nh PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus)... Năm 2004, Schubert
và cộng sự đã tạo ra đợc cây khoai tây chuyển gen NIb kháng PVY trong nhà kính
9
[18,21]. ở cây thuốc lá, Suzuki và cộng sự cũng đã chuyển gen sao chép ARNs 1 và
2 của CMV (cucumber mosaic virus) thành công tạo ra những dòng thuốc lá V1 và

V2, sau đó đem lai hai dòng này với nhau tạo ra dòng V1V2. Kết quả là dòng V1V2
có tính kháng cao hơn so với dòng V1 và V2 [41].
1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu
bệnh virut
1.5.1. Kỹ thuật RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) là sự kết hợp của hai phản
ứng sao mã ngợc (reverse transcription) và PCR để nhân lên một đoạn gen quan tâm
từ ARN (Hình 4). Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:
- Tổng hợp sợi cADN thứ nhất:
Nguyên lý của phơng pháp này là sử dụng enzym sao mã ngợc (reverse
transcriptase) để tổng hợp nên sợi cADN thứ nhất từ ARN. Tùy theo mục đích của
thí nghiệm mà các loại ARN đợc sử dụng khác nhau. Nếu muốn nhân một đoạn gen
của sinh vật bậc cao mà không có intron thì ngời ta thờng tổng hợp cADN từ mARN
với mồi oligo(dT)s. Nếu là sinh vật bậc thấp nh vi khuẩn, virut... ngời ta có thể tổng
hợp cADN từ ARN tổng số với mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhân
lên. Khi mồi gắn bổ sung với sợi ARN khuôn enzym sao mã ngợc sẽ xúc tác cho
quá trình tổng hợp cADN từ các nucleotit tự do có trong thành phần phản ứng ở một
nhiệt độ thích hợp. Phản ứng tổng hợp cADN chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý
thuyết sau khi kết thúc phản ứng ta sẽ thu đợc lợng cADN tơng ứng với lợng ARN
khuôn ban đầu. Để tăng hiệu quả của quá trình tổng hợp, lợng mồi đợc cho vào lớn
hơn rất nhiều lợng ARN khuôn và chất kìm hãm RNase cũng đợc đa vào để bảo vệ
cho ARN khỏi bị cắt bởi RNase.
- Khuếch đại gen bằng PCR:
10
Sử dụng cADN làm khuôn để khuếch đại gen quan tâm bằng phản ứng PCR
với cặp mồi đặc hiệu (Primer-F và Primer-R). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR đợc
trình bày ở mục 1.5.2.
1.5.2. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction chuỗi phản ứng trùng hợp) đợc
Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên năm 1985. Đây là kỹ thuật in vitro, tơng đối đơn giản

cho phép nhân nhanh một số lợng không hạn chế nguyên bản một đoạn ADN nhất định
trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của ADN polymerase. Tất cả các
ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự
hiện diện của những mồi đặc hiệu. Mồi là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp
bổ sung với một đầu của mạch khuôn và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành
mạch mới. Quá trình nhân bản bằng enzym này bao gồm 3 bớc đợc lặp lại nhiều lần:
- Biến tính ADN từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng cao
nhiệt độ lên 94-95
0
C trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút.
- Gắn mồi (primer) với đoạn ADN cần nhân thông qua hạ nhiệt độ xuống
40-60
0
C, trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút, phụ thuộc vào độ dài và tỉ lệ
G+C của đoạn mồi.
- Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử ADN kéo dài từ đoạn mồi. Hai phân
tử ADN mới đợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử khuôn ban
11
dNTPs
1. Reverse Transcription
2. PCR
ARN tổng số
cADN
(mẫu PCR)
Reverse transcriptase
dNTPs
Mồi nhẫu nhiên
Sản phẩm PCR
Primer-F
Primer-R

Taq polymerase
Hình 4. Sơ đồ minh họa kỹ thuật RT-PCR
đầu. Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Để tránh hiện tợng bắt cặp không đặc
thù, phản ứng tổng hợp nên đợc thực hiện ở 72
0
C. Loại polymerase dùng trong PCR
là loại chịu nhiệt (Taq polymerase) đợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus,
một loại vi khuẩn đợc phân lập từ suối nớc nóng. Hiện nay, enzym này chủ yếu đợc
sản xuất theo con đờng tái tổ hợp.
Nh vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lợng ADN cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi, với
N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có Nx2
n
sợi ADN đợc nhân lên. Ví dụ, sau khoảng
20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản đợc nhân lên từ một sợi khuôn ban đầu [1,3].
1.5.3. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E. coli
Biến nạp theo nghĩa rộng là: đa bất kỳ ADN nào vào bất kỳ tế bào nào. Trong
trờng hợp các tế bào E. coli thì biến nạp có nghĩa là đa ADN plasmit vào trong tế
bào.
Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928
trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là nguyên lý biến nạp. Trên thực tế,
phát minh này về sau đã chứng minh rằng các gen đợc cấu thành từ ADN. Tuy nhiên,
không phải tất cả các vi khuẩn đều có thể đợc biến nạp một cách dễ dàng. Để cho
biến nạp ở E. coli có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Để đạt đ-
ợc điều này, ngời ta ngâm các tế bào trong dung dịch CaCl
2
lạnh trong đá, khi đó các
tế bào trở nên khả biến theo một cách mà cho đến nay vẫn cha rõ nguyên nhân. Việc
biến nạp các tế bào khả biến đợc thực hiện bằng cách trộn ADN plasmit với các tế
bào, rồi ủ trong đá 20-30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (khoảng 1 phút ở 42
0

C),
làm nh vậy ADN sẽ chui vào tế bào. Sau khi biến nạp, vi khuẩn đợc nuôi phục hồi
trong môi trờng LB ở 37
0
C trong vòng 60 đến 90 phút. Sau đó, các tế bào đợc đa lên
môi trờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmit.
Trong quá trình biến nạp, chỉ có một phần rất nhỏ các tế bào khả biến đợc
biến nạp. Mặc dù có nhợc điểm rất lớn này, biến nạp vẫn là một kỹ thuật quan
trọng, nó có thể tạo ra tới 10
9
các tế bào biến nạp (tức các thể biến nạp) khi đa 1
microgam ADN vào thí nghiệm. Thờng trên thực tế với 1 microgam ADN ngời ta
tạo ra đợc 10
6
đến 10
7
tế bào biến nạp [8].
1.5.4. Kỹ thuật tách dòng
Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu đợc sử dụng trong kỹ thuật di truyền
và là bớc khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này [7]. Mục đích của việc tách dòng là
nhằm thu đợc một lợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Đầu tiên, ADN ngoại
lai đợc nối vào một vectơ nhằm tạo ra ADN tái tổ hợp. Vectơ sử dụng là plasmit
thích ứng của vi khuẩn E. coli. Sau đó vectơ tái tổ hợp đợc biến nạp vào tế bào chủ
12
và tế bào chủ đợc nuôi cấy trong môi trờng thích hợp để nhân vi khuẩn lên nhiều
lần. Tế bào chủ ở đây là vi khuẩn E. coli. Cuối cùng qua các bớc tách chiết ADN,
ngời ta sẽ thu đợc một lợng lớn plasmit tái tổ hợp [3].
Các nhân tố nh vectơ, tế bào chủ có thể thay đổi nhng tiến trình tách dòng nói
chung đợc thực hiện qua 4 bớc: xử lý ADN cần tạo dòng, tạo vectơ tái tổ hợp, biến
nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dòng.

- Xử lý ADN cần tạo dòng
Trớc hết ADN cần tạo dòng đợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Sản phẩm PCR sau đó đợc làm sạch để thu đợc phân đoạn ADN có kích thớc nh
mong muốn, loại bỏ mồi và các thành phần khác trong phản ứng PCR. Bớc này
nhằm tạo điều kiện cho bớc chọn dòng đợc thực hiện nhanh và hiệu quả, tránh
những plasmit tái tổ hợp có kích thớc không mong muốn.
- Tạo vectơ tái tổ hợp
Vectơ tái tổ hợp đợc tạo ra bằng cách gắn gen quan tâm (đoạn ADN cần tạo
dòng) vào vectơ tách dòng. Thông thờng, sau khi chạy PCR với enzym Taq
polymerase, enzym này sẽ gắn thêm một nucleotit là Adenin vào đầu 3 của đoạn
gen đợc nhân lên. Lợi dụng tính chất này các nhà khoa học đã nghiên cứu thiết kế
các thế hệ vectơ tách dòng có mang một nucleotit là Thymin ở đầu 5 của vectơ đã
đợc mở vòng sẵn tại PCS (polycloning site-vùng nhân dòng đa điểm cắt). Hiện nay,
có rất nhiều vectơ tách dòng có đặc tính này, nh pCR

2.1-TOPO, pGEM

-T...
Vectơ tách dòng và ADN cần tạo dòng đợc trộn chung theo một tỷ lệ nhất
định dới sự xúc tác của enzym T
4
ligase, ADN sẽ đợc gắn vào vectơ theo nguyên tắc
bổ sung A-T tại vị trí mở vòng.
- Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ
Trong quá trình gắn gen vào vectơ sẽ hình thành nên các vectơ tái tổ hợp
khác nhau. Bớc này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép
vectơ tái tổ hợp thành một số lợng lớn bản sao. Tuỳ vào mục đích sử dụng, ngời ta sẽ
chọn tế bào chủ là tế bào E. coli hay tế bào nấm men.
- Chọn dòng
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cách thông dụng: chọn lọc theo phơng

pháp kháng sinh (kanamycin hoặc ampicillin) nhằm loại trừ các tế bào vi khuẩn
13
không đợc biến nạp và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác và chọn lọc theo phản ứng
với cơ chất (X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn có mang vectơ nhng không có
đoạn gen đợc chen vào.
1.4.5. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)
Hiện nay, có rất nhiều phơng pháp để xác định tế bào vi khuẩn có plasmit
mang gen mong muốn, nh phơng pháp colony-PCR, cắt plasmit bằng các enzym hạn
chế, hoặc PCR từ plasmit. Trong đó phơng pháp colony-PCR cho phép phát hiện
nhanh khuẩn lạc mang plasmit tái tổ hợp mong muốn. Phơng pháp này có u điểm là
nhanh, ít tốn kém và đơn giản. Hiện nay, kỹ thuật này đợc ứng dụng rất rộng rãi
trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR dựa trên nguyên tắc kỹ thuật PCR, chỉ khác
ở chỗ mẫu ADN đợc thay bằng ADN plasmit giải phóng từ khuẩn lạc. ở nhiệt độ cao
(94-95
0
C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmit tái tổ hợp. Plasmit tái
tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.
1.4.6. Kỹ thuật xác định trình tự nucleotit
Những phơng pháp đọc trình tự axit nucleic đang đợc sử dụng hiện nay đều đợc cải
tiến từ phơng pháp enzym học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotit của
Sanger và cộng sự (1977). Phơng pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzym ADN
polymerase mạch bổ sung cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định. Đặc trng của
phơng pháp là ngoài bốn loại nucleotit thông thờng còn sử dụng thêm bốn loại
dideoxynucleotit là những deoxynucleotit trong đó nhóm 3OH đợc thay bằng H. Điều
này khiến cho các dideoxynucleotit không còn khả năng hình thành các cầu nối
phosphodiester và do đó ngừng quá trình tổng hợp. Trong kỹ thuật đọc trình tự
nucleotit tự động, mỗi dideoxynucleotit đợc đánh dấu bằng một fluochrome có màu
khác nhau. Nh vậy, tất cả oligonucleotit cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotit sẽ
có cùng một màu. Sau khi điện di trong ống vi mao quản, tạo ra một dãy các phân

đoạn ADN hơn kém nhau một nucleotit. Thiết bị phát hiện huỳnh quang (detector)
phát hiện các băng theo thời gian, băng nào xa nhất đợc phát hiện trớc. Detector phát
tín hiệu lên máy tính. Detector là một thiết bị khuếch đại tín hiệu. Kết quả xác
định trình tự sẽ đợc xử lý bằng phần mềm máy tính chuyên dụng.
Chơng 2. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Nghiên cứu về đánh giá tính đa dạng của các dòng virus gây bệnh đốm vòng
đu đủ của Việt Nam thông qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá
protein vỏ (CP) cho thấy 16 dòng PRSV phân lập từ các khu vực khác nhau của Việt
Nam có mức độ giống nhau từ 89,7% đến 99,8%. Trong đó 4 dòng virus Tuyên
14
Quang, Kon Tum, Sài Gòn và Cần Thơ là các dòng có tính đại diện cao nhất cho các
vùng đợc nghiên cứu. Từ cơ sở trên 4 mẫu lá đu đủ nhiễm PRSV đợc thu từ 4 vùng
trên của Việt Nam đã đợc sử dụng trong nghiên cứu này (Bảng 4).
Bảng 4. Danh sách các mẫu lá đu đủ nhiễm PRSV đợc sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên vùng thu mẫu Ký hiệu
1 Tuyên Quang TQ
2 Cần Thơ CT
3 Kon Tum KT
4 Sài Gòn SG
Bảng 5. Mã số các trình tự gen NIb trong Ngân hàng gen
quốc tế
STT Mã số trong NCBI Vùng phân lập Viết tắt
1 AY162218 Thái Lan AY162218-TH
2 AY010722 Thái Lan AY010722-TH
3 AF405532 Thái Lan AF405532-TH
4 AF405531 Thái Lan AF405531-TH
5 AF405530 Thái Lan AF405530-TH
6 AF405529 Thái Lan AF405529-TH

7 AF469604 Trung Quốc AF469604-China
8 X96538 Trung Quốc X96538-China-SM
9 X78557 Đài Loan X78557-Taiwan
10 X67673 Hawaii X67673-HA
11 S46722 Hawaii S46722-HA
2.1.2. Hoá chất, thiết bị
+ Hoá chất
- Thang ADN 1 kb (Fermentas)
- Kit tách chiết ARN (Trizol Regents Kit), bộ hoá chất sử dụng cho RT-
PCR (Cloned AMV Reverse Transcriptase Kit) của hãng Invitrogen (Mỹ).
15