Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP part 6 ppt

39


PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Hiện trạng canh tác cây đu đủ ở nơi lấy mẫu
Huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp
Cao Lãnh là một vùng đất khá trù phú, màu mỡ dù đất đai có nhiều nơi bị nhiễm
phèn song có thể khắc phục đƣợc. Nơi đây lại có nguồn nƣớc tƣới dồi dào với hệ
thống kênh rạch chằng chịt, khí hậu nóng ẩm nên rất thích hợp cho việc trồng đu đủ.
Đu đủ ở đây thƣờng đƣợc trồng xen với các cây lâu năm nhƣ xoài, bƣởi, cam,
chanh. Do đƣợc trồng xen với cây ăn trái do đó việc bón phân cho cây trồng chính
cũng phần nào cung cấp đƣợc dinh dƣỡng cần thiết cho cây đu đủ vì thế đu đủ ở đây
có sức sống mạnh mẽ, xanh tốt, cho trái sai, kích thƣớc lớn. Đồng thời nhờ đó mà cây
còn tăng sức chống chịu cũng nhƣ tính đề kháng với các loại bệnh, đặc biệt là bệnh về
virus. Song cũng có những vƣờn do cây nhiễm virus từ khi còn nhỏ nên cây suy tàn
sớm, buộc phải chặt bỏ.
Huyện Tân Phú và Định Quán, tỉnh Đồng Nai
Đây là vùng đất cũng khá màu mỡ song khí hậu có sự thay đổi lớn trong năm. Do
sự khác biệt rõ rệt về khí hậu cũng nhƣ nguồn nƣớc tƣới giữa hai mùa mƣa và nắng
nên ngƣời dân nơi đây chỉ trồng đu đủ vào mùa mƣa khi trời nóng ẩm và nguồn nƣớc
tƣới dồi dào. Cũng tƣơng tự, cây đu đủ nơi đây cũng chỉ đƣợc trồng xen với cây khác
nhƣ cây điều, mãng cầu,… nhƣng so với Đồng Tháp thì đất đai nơi đây nhìn chung
nghèo dinh dƣỡng và khô cằn hơn với cấu hình đá tổ ong, chính vì vậy việc trồng đu
đủ có nhiều khó khăn nhƣ: phải thƣờng xuyên bón phân, tƣới nƣớc, cây có sức chống
chịu kém nên khi nhiễm bệnh cây nhanh chóng suy tàn,…
Nhìn chung, do hiện nay ở nƣớc ta chƣa có sự đầu tƣ thích đáng cho việc sản xuất
cũng nhƣ chế biến sản phẩm nên đu đủ ở nƣớc ta có giá trị kinh tế khá thấp (thƣờng

chỉ khoảng 600 - 1200 đồng/ kg trái tƣơi). Chính nguyên nhân này kèm theo dịch bệnh
virus càng làm cho nền sản xuất đu đủ chỉ ở mức nhỏ, tự phát, không tập trung, trồng
xen tạm thời để lấy ngắn nuôi dài.


40


Về giống, chủ yếu ngƣời dân chọn cây cho trái tốt, thu quả, giữ hạt lại rồi tự ƣơm
giống cho vụ sau chứ không mua từ trung tâm hay trại giống.
Về phân bón, do cây đu đủ sử dụng rất nhiều dinh dƣỡng do đó cần bón nhiều. Các
loại phân thƣờng sử dụng là N-P-K, Super lân, kali, urê …
Thuốc bảo vệ thực vật thƣờng là các thuốc diệt côn trùng gây bệnh nhƣ thuốc diệt
rệp, nhện, rầy… bao gồm Supracide, Admire 50EC, Danitol, Sherzol…
Phƣơng pháp trồng nhìn chung là trồng xen thành từng hàng hoặc thành từng líp
bao quanh các cây trồng chính.
Qua đánh giá sơ bộ khi lấy mẫu, các vƣờn có tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng là khá cao,
hầu nhƣ tất cả các cây trong vƣờn đều nhiễm bệnh với các dấu hiệu nhƣ có sọc dầu
trên thân, cuống; lá biến dạng ở nhiều mức độ; trái có các đốm hình vòng nhẫn. Mức
độ thiệt hại còn tùy thuộc vào thời điểm cây bị nhiễm bệnh (nếu cây nhiễm bệnh ở giai
đoạn 3 – 4 tháng thì cây suy tàn, còi cọc, không cho trái; cây nhiễm ở giai đoạn 8 - 9
tháng thì vẫn cho trái nhƣng trái nhỏ, đôi khi bị biến dạng) và tình trạng dinh dƣỡng
của cây (cây đƣợc chăm sóc tốt có sức chống chịu và đề kháng bệnh tốt hơn).
4.2. Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm với bộ kit DAS- ELISA
4.2.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra
Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo địa bàn điều tra
Địa điểm
Số mẫu
điều tra
Số mẫu

nhiễm
Tỉ lệ nhiễm
bệnh (%)
Tỉnh
Đồng
Tháp
Huyện
Cao Lãnh
Xã Mỹ Hiệp
41
38
92,68
Xã Bình Thạnh
31
24
77,42
Tỉnh
Đồng
Nai
Huyện
Định
Quán
Xã Phú Tân
19
9
47,37
Huyện
Tân Phú
Xã Phú Lộc
19

9
47,37
Xã Phú An
25
4
16,00
Tổng
135
84
62,22



41



92.68
77.42
47.37
47.37
16.00
0.00
25.00
50.00
75.00
100.00
Xã Mỹ
Hiệp
Xã Bình

Thạnh
Xã Phú
Tân
Xã Phú
Lộc
Xã Phú An
ĐỊA ĐIỂM LẤY MẪU
TỈ LỆ NHIỄM BỆNH
Tỉ lệ nhiễm
bệnh (%)

Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh trên các địa bàn điều tra
Qua đánh giá kết quả từ Bảng 4.1 và Đồ thị 4.1, nhận thấy tỉ lệ nhiễm bệnh theo các
vùng nhƣ sau:
- Xã Mỹ Hiệp: 92,68 %
- Xã Bình Thạnh: 77,42 %
- Xã Phú Tân: 47,37 %
- Xã Phú Lộc: 47,37 %
- Xã Phú An: 16 %
Nhận xét thấy tỉ lệ nhiễm bệnh ở vùng Đồng Tháp cao hơn hẳn Đồng Nai mặc dù
điều kiện dinh dƣỡng và khí hậu ở Đồng Tháp tốt và thuận lợi hơn Đồng Nai. Nguyên
nhân có thể do ở Đồng Tháp dù cây đã bị nhiễm virus song do đƣợc chăm sóc tốt nên
cây có khả năng chống chịu cao vì thế vẫn sinh trƣởng đến khi ra hoa, kết trái; còn ở
Đồng Nai, điều kiện tự nhiên khắc nghiệt hơn cộng với sự chăm sóc không tốt bằng ở
Đồng Tháp nên một khi cây nhiễm bệnh sẽ nhanh chóng suy tàn, còi cọc và sớm bị
loại bỏ, do đó cây còn tồn tại đƣợc thƣờng là cây có tính kháng bệnh hoặc chỉ nhiễm
virus dòng nhẹ.


42

4.2.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây
Bảng 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh Đốm vòng theo giống cây
Địa điểm
Giống cây
Da bông (Db)
Mã Lai (Ml)
Địa phƣơng (Đp)
(+)/Σ
% (+)
(+)/Σ
% (+)
(+)/Σ
% (+)
Tỉnh Đồng Tháp
Huyện Cao Lãnh
Xã Mỹ Hiệp
28/31
90,32
10/10
100
-
-
Xã Bình Thạnh
17/21
80,95
6/10
60
-

-
Tỉnh Đồng Nai
Huyện Định Quán
Xã Phú Tân
-
-
-
-
9/19
4,74
Huyện Tân Phú
Xã Phú Lộc
-
-
-
-
9/19
47,37
Xã Phú An
-
-
-
-
4/25
16,00
Tổng
45/52
86,54
16/20
80

22/63
34,92

(+)/Σ: Số cây nhiễm bệnh trong tổng số cây
% (+): Tỉ lệ cây nhiễm bệnh
“-“ : không có lấy mẫu
86.54
80
34.92
0.00
25.00
50.00
75.00
100.00
Da bông (Db) Mã Lai (Ml) Địa phương
(Đp)
GIỐNG CÂY
TỈ LỆ NHIỄM BỆNH
Tỉ lệ nhiễm
bệnh (%)

Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây
Nhận xét
Từ Bảng 4.2 và Đồ thị 4.2 nhận thấy tỉ lệ nhiễm bệnh trên các giống cây nhƣ sau:
- Giống Da Bông: 86,54 %
- Giống Mã Lai: 80 %
- Giống Địa phƣơng: 34,92 %


43

Giống Địa phƣơng chủ yếu thu mẫu từ tỉnh Đồng Nai do đó ở chỉ tiêu này ta chỉ có
thể so sánh tình hình nhiễm bệnh trên hai giống Da bông và Mã Lai thu thập tại tỉnh
Đồng Tháp. Theo đồ thị trên, nhận thấy giống Da bông có tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng
cao hơn giống Mã Lai.
4.2.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây
Bảng 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây
Tuổi cây
Số mẫu
Số mẫu nhiễm bệnh
Tỉ lệ nhiễm (%)
4 - 5 tháng (chƣa trái)
20
14
70,00
6 - 8 tháng
63
54
85,71
8 - 11 tháng
16
2
12,50
Trên 1 năm
36
13
36,11
Tổng
135

83
61,48
70.00
85.71
12.50
36.11
0.00
25.00
50.00
75.00
100.00
TỈ LỆ NHIỄM BỆNH
4-5 tháng
(chưa trái)
6-8 tháng 8-11 tháng Trên 1năm
TUỔI CÂY
Tỉ lệ nhiễm
(%)

Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây
Nhận xét
Từ Bảng 4.3 và Đồ thị 4.3 nhận thấy tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây nhƣ sau:
- Từ 4 - 5 tháng: 70 %
- Từ 6 - 8 tháng: 85,71 %
- Từ 8 - 11 tháng: 12,5 %
- Trên 1 năm: 36,11 %


44

Nhƣ đã biết, virus PRSV này thƣờng phát triển và lây lan mạnh vào thời kì cây bắt
đầu trƣởng thành (6 – 8 tháng), tuy nhiên cũng xuất hiện khi cây còn nhỏ (4 - 5 tháng).
Còn tỉ lệ nhiễm bệnh trên độ tuổi 8 – 11 tháng và hơn 1 năm chiếm tỉ lệ thấp là do số
lƣợng mẫu lấy ở độ tuổi này quá ít (16 mẫu 8 - 11 tháng tuổi, 36 mẫu hơn một năm
tuổi). Do đó, đánh giá sự nhiễm bệnh theo độ tuổi trong thí nghiệm này do lƣợng mẫu
lấy ở mỗi độ tuổi là quá ít nên không phản ánh chính xác mức độ nhiễm bệnh theo độ
tuổi mà chỉ có thể cho ta biết rằng cây có thể nhiễm bệnh ở mọi độ tuổi, mọi giai đoạn
của quá trình phát triển.
4.3. Kết quả thí nghiệm PCR
Thiết kế thí nghiệm
Chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số từ lá đu đủ bằng kit ly trích Aurum
TM

Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) của công ty Bio- Rad. Từ dung dịch RNA
thu đƣợc, tiến hành phản ứng sao chép ngƣợc thành DNA với bộ kit iScript
TM
cDNA
Synthesis Kit cũng do Bio- Rad cung cấp. Sau đó, từ nguồn cDNA thu đƣợc, thực hiện
phản ứng khuếch đại PCR với cặp mồi 1 (nêu ở phần vật liệu và phƣơng pháp). Sản
phẩm nhân bản đƣợc phát hiện bằng điện di trên gel agarose 1,5 % cùng với thang 100
bp, nhuộm bằng ethium bromide, đọc kết quả bằng máy đọc gel. Kết quả thu đƣợc nhƣ
sau:
a) b)
Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn
b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2
LD: Ladder
ĐQ: Mẫu lấy ở huyện Định Quán
MH: Mẫu lấy ở xã Mỹ Hiệp
TP: Mẫu lấy ở huyện Tân Phú

BT: Mẫu lấy ở xã Bình Thạnh

300 bp
100 bp
650 bp
400 bp
300 bp
100 bp


45


Nhận xét:
Khi thực hiện phản ứng PCR trên quy trình nhiệt chuẩn, chúng tôi thấy chỉ xuất
hiện 1 band duy nhất có kích thƣớc 300 bp, không thấy band 900 bp. Để hoạt động của
mồi đặc hiệu hơn, chúng tôi tiến hành thay đổi thông số về nhiệt độ (chu kì nhiệt 1 và
2) song sản phẩm thu đƣợc lại có nhiều band, và cũng không thấy xuất hiện band
mong muốn. Do nhiệt độ thay đổi khá nhiều và gần đến nhiệt độ biến tính của mồi mà
không thu đƣợc kết quả nên chúng tôi tiến hành giữ nguyên chu kì nhiệt chuẩn và
chuyển sang thay đổi các thông số hóa chất trong phản ứng PCR. Qua nghiên cứu tài
liệu về các chất có tác dụng hỗ trợ cho phản ứng PCR (enhancers of PCR), nhận thấy
chất DMSO (Dimethylsulfoxide) là một chất có tác dụng duy trì sự tách mạch của
DNA trong giai đoạn biến tính, qua đó hỗ trợ cho phản ứng khuếch đại hoàn toàn trình
tự DNA, nhất là đối với những trình tự khá dài (Sambrook; Newton C.R., 1997). Nồng
độ DMSO trong hỗn hợp phản ứng là 2 %. Kết quả thu đƣợc từ nghiệm thức với chu
kì nhiệt chuẩn và thành phần hóa chất có bổ sung DMSO:

Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1
Nhận thấy, sản phẩm PCR xuất hiện nhiều band bao gồm band 900 bp (band có kích

thƣớc mong muốn), 350 bp và 100 bp. Nhƣ vậy, DMSO đã phát huy tác dụng trong
nghiệm thức này.
Tuy nhiên, sản phẩm thu đƣợc đa kích thƣớc và band mong muốn khá mờ, nhƣ vậy
chứng tỏ cặp mồi đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này là không đặc hiệu. Thật vậy, qua
900 bp



350 bp

100 bp


46


tra cứu các thông tin về độ đặc hiệu của cặp mồi 1 trên trang web NCBI- BLAST thấy
chỉ mồi antisense là bắt cặp với đoạn gene CP của PRSV, còn mồi sense thì không
thấy sự bắt cặp nào với gene CP.
Độ đặc hiệu của mồi xuôi 1
Query = Sense 5‟- ATC ATT CCA TGG GCG TGT TCC ATG AAT CAA- 3‟
(30 letters)
Taxonomy reports
Distribution of 5 Blast Hits on the Query Sequence

Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1
Các trình tự đích có khả năng bắt cặp với mồi xuôi 1 (đƣợc xắp xếp theo thứ tự
giảm dần về độ đặc hiệu của mồi)
 gi|21627138|gb|AE003811.3| Drosophila melanogaster chromosome 2R,
section 39 of 74 of the complete sequence

 gi|49609491|emb|BX950851.1| Erwinia carotovora subsp. atroseptica
SCRI1043, complete genome
 gi|24653840|ref|NM_166092.1| Drosophila melanogaster CG16801-PA,
isoform A (CG16801) mRNA, complete cds
 gi|24653838|ref|NM_137188.1| Drosophila melanogaster CG16801-PB,
isoform B (CG16801) mRNA, complete cds
 gi|13430987|gb|AC008342.12|AC008342 Drosophila melanogaster,
chromosome 2R, region 51F-51F, BAC clone BACR33K06, complete
sequence
Độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1
Query = Antisense 5‟- AGC TAA CCA TGG GCG AGT ATT CAG TTG CGC- 3‟
(30 letters)


47


Taxonomy reports
Distribution of 40 Blast Hits on the Query Sequence

Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1
Các trình tự đích có khả năng bắt cặp với mồi ngƣợc 1 (đƣợc xắp xếp theo thứ tự
giảm dần về độ đặc hiệu của mồi)
 gi|29469899|gb|AY231130.1| Papaya ringspot virus Mex-VrPO, complete
genome
 gi|3882013|emb|AJ012649.1|PRI012649 Papaya ringspot virus CP gene,
isolate Veracruz (VTB-6), partial cds
 gi|247640|gb|S89893.1| 3' region: coat protein [papaya ringspot virus PRSV,
type W Australian isolate, Cucurbita pepo cv. Green Ruffles (Northrup King),
Genomic RNA, 1070 nt]

 gi|6694283|gb|AF196839.1|AF196839 Papaya ringspot virus isolate H1K coat
protein gene, partial cds
 gi|6694281|gb|AF196838.1|AF196838 Papaya ringspot virus isolate Puerto
Rico coat protein gene, partial cds


48


 gi|3511154|gb|AF063220.1| Papaya ringspot virus isolate P polyprotein gene,
partial cds
 gi|12744709|gb|AF319507.1|AF319507 Papaya ringspot virus isolate VrCo-7
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744707|gb|AF319506.1|AF319506 Papaya ringspot virus isolate VrCa-15
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744705|gb|AF319505.1|AF319505 Papaya ringspot virus isolate VrAc-27
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744703|gb|AF319504.1|AF319504 Papaya ringspot virus isolate TbC-43
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744701|gb|AF319503.1|AF319503 Papaya ringspot virus isolate TbC-42
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744699|gb|AF319502.1|AF319502 Papaya ringspot virus isolate SpT-27
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744697|gb|AF319501.1|AF319501 Papaya ringspot virus isolate CpPM-
40 coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744695|gb|AF319500.1|AF319500 Papaya ringspot virus isolate CpPM-
39 coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744693|gb|AF319499.1|AF319499 Papaya ringspot virus isolate YcY-15
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744689|gb|AF319497.1|AF319497 Papaya ringspot virus isolate VrCo-1

coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744687|gb|AF319496.1|AF319496 Papaya ringspot virus isolate VrAl-18
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744685|gb|AF319495.1|AF319495 Papaya ringspot virus isolate TmLC-
70 coat protein (CP) gene,partial cds
 gi|12744683|gb|AF319494.1|AF319494 Papaya ringspot virus isolate TmCM-
25 coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744681|gb|AF319493.1|AF319493 Papaya ringspot virus isolate QrFC-3
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744679|gb|AF319492.1|AF319492 Papaya ringspot virus isolate QrFC-2
coat protein (CP) gene, partial cds