Luận văn : PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR part 6 doc

40

540 bp
sản phẩm PCR
1000 bp


500 bp


100 bp


Sản phẩm phụ
của phản ứng PCR
đơn vị 5,8S) và các gen mã hóa cho tiểu đơn vị lớn rRNA. Vùng ITS rất hữu ích cho
những nghiên cứu về đặc điểm phân tử của nấm (Bridge P.D. và Arora. D.K., 2000).
Cặp primer ITS A và ITS B được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của sinh vật
eukaryote có khả năng khuếch đại vùng DNA có khả năng biến đổi nằm giữa đầu 3’
của rDNA 18S và đầu 5’ của rDNA 28S, vùng này bao gồm cả gen rDNA 5,8S được
nằm chồng qua bởi hai vùng ITS (ITS 1 và ITS 2) (Silva và cộng sự, 1998). Những
primer này khuếch đại hữu hiệu một đoạn DNA duy nhất từ DNA hệ gen của nấm.
Kích thước của đoạn DNA khuếch đại được là 540 bp (hình 4.7).


Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu nấm C. cassiicola.
Ghi chú:
L1: DNA ladder
L2: MT/C/5.

L3: RRIV 2
L4: RRIV4
L5: AC 88
L6: LH 83/152

Phản ứng PCR được thực hiện theo quy trình của Silva và các cộng sự (1998). Hình
4.7 cho thấy, sử dụng quy trình trên đã cho phép khuếch đại được vùng ITS mong
muốn. Tuy nhiên, kết quả điện di trên gel agarose cũng cho thấy ngoài sản phẩm chính
còn có các sản phẩm phụ không mong muốn. Sản phẩm PCR có sản phẩm phụ có thể
là do một số nguyên nhân như primer quá nhiều, thời gian của bước kéo dài kéo dài
hơn mức cần thiết, lượng DNA khuôn mẫu sử dụng nhiều cũng làm xuất hiện sản


41

phẩm phụ, và phản ứng có quá nhiều chu kỳ. Trong điều kiện cho phép chúng tôi đã
thay đổi lượng primer sử dụng và đã thu nhận được sản phẩm PCR đặc hiệu hơn như
hình 4.8. Tuy nhiên, ngoài yếu tố primer chúng tôi cũng đã kiểm tra các yếu tố khác có
ảnh hưởng như thế nào đến sự khuếch đại một đoạn DNA trong vùng ITS của nấm
C. cassiicola. Kết quả cho thấy các yếu tố khác không tạo ra sự ảnh hưởng đáng kể nào
lên sản phẩm PCR tạo thành và chúng tôi không đưa ra thảo luận ở đây.

Hình 4.8: Sản phẩm PCR thu nhận đƣợc sau khi giảm lƣợng primer dùng trong
phản ứng PCR.
L1: MT/C/5.
L2: RRIV 2
L3: RRIV4
L4: AC 88
L5: LH 83/152
L6: LH 82/008

L7: LH 83/152.

Sản phẩm PCR của 7 mẫu phân lập được kiểm tra kích thước và so sánh với các đối
chứng dương khác (sử dụng quy trình tương tự để khuếch đại vùng ITS của nấm
Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae) (hình 4.9).
Qua hình 4.9, chúng tôi nhận thấy, phản ứng PCR với cặp primer ITS A và
ITS B cũng có khả năng khuếch đại được vùng ITS của nấm Beauveria bassiana và
Metarhizum anisopliae. Điều này là hợp lý vì cặp primer này được thiết kế cho vùng
bảo tồn ITS, và hầu hết các nấm đều có vùng này.
Theo chúng tôi, nếu sử dụng kỹ thuật này để chẩn đoán bệnh rụng lá Corynespora
do nấm C. cassiicola gây ra dựa trên sản phẩm khuếch đại của vùng ITS 1, ITS 2 bằng
cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả, vì sản phẩm PCR thu được có kích


42

thước giống nhau (540 bp) ở các loài nấm khác, điều này không cho phép nhận dạng
nấm C. cassiicola dựa trên sản phẩm khuếch đại của vùng ITS1, ITS2.

Hình 4.9: Kiểm tra kích thƣớc sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola và so sánh
với sản phẩm PCR của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae .
L1: DNA ladder
L2: MT/C/5
L3: RRIV2
L4: RRIV4
L5: AC 88
L6: RO/CM/10
L7: LH 82/152
L8: LH 82/008
L9: Beauveria bassiana

L10: Metarhizum anisopliae
L11: Đối chứng âm
Ghi chú: Hai nguồn nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae do Bộ môn BVTV –
Khoa Nông Học, Đại học Nông Lâm TP.HCM cung cấp.

Kết quả này cũng cho thấy cần phải tìm ra một vị trí khác trên DNA hệ gen đặc
trưng hơn cho C. cassiicola, để việc chẩn đoán bệnh do C. cassiicola gây ra nhanh
chóng và chính xác hơn.
Việc nghiên cứu về gen mã hóa cho protein độc tố cassiicoline có thể giúp giải
quyết được vấn đề này. Đây có thể là hướng đi sẽ được nhiều phòng thí nghiệm lựa
chọn trong tương lai.
4.4 Phân tích đa dạng vùng ITS của nấm C. cassiicola
RFLP là một kỹ thuật mới được ứng dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di
truyền. Trong kỹ thuật này chủ yếu ứng dụng các enzyme cắt giới hạn nhằm phân cắt
một đoạn DNA hoặc cả hệ gen của một sinh vật nào đó. Nếu hai sinh vật có sự giống
nhau về mặt di truyền khi phân cắt bằng RE sẽ tạo thành những đoạn DNA có kích
thước giống nhau, số đoạn DNA tạo thành cũng giống nhau. Phương pháp RFLP

500 bp

540 bp


43

nguyên bản đòi hỏi phải trải qua giai đoạn Southern blot. Do vậy, trong phân tích đa
dạng di truyền của các loài nấm, đặc biệt là phân tích đa dạng di truyền trong cùng
loài, phương pháp RFLP – PCR được ứng dụng phổ biến hơn. Kỹ thuật này có nghĩa
là sử dụng các RE để phân cắt sản phẩm PCR một đoạn gen hay một đoạn DNA nào
đó, không trải qua giai đoạn southern blot. Sau khi phân cắt bằng các RE, sản phẩm sẽ

được phân tích bằng cách điện di trên gel để xem xét có hay không có sự đa hình kích
thước của các đoạn DNA tạo thành. Kỹ thuật này đơn giản hơn kỹ thuật RFLP thông
thường. Hiện nay, RFLP – PCR được ứng dụng nhiều trong phân loại, nhất là phân
loại ở mức độ dưới loài (đã ứng dụng thành công đối với nấm Verticilium, Rhizoctonia
và Fusarium) (Bridge P.D. và Arora. D.K., 2000).
Do sản phẩm PCR tương đối đặc hiệu nên được sử dụng trực tiếp vào phân tích
RFLP mà không cần phải tinh sạch. Sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola được phân
cắt riêng rẽ bằng các enzyme cắt giới hạn CfoI, EcoRI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI.
Sản phẩm tạo thành được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose. Chúng tôi nhận
thấy mỗi enzyme đều tạo ra các sản phẩm giống nhau ở tất cả các mẫu khảo sát (hình
4.10, hình 4.11, hình 4.12, hình 4.13, hình 4.14, hình 4.15).

Hình 4.10: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme EcoRI.
L1: DNA ladder L5: AC 88
L2: MT/C/5 L6: RO/CM/10
L3: RRIV2 L7: LH 82/152
L4: RRIV4 L8: LH 82/008


300 bp
200 bp


44




Hình 4.11: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme MspI.
Ghi chú:

L1: DNA ladder
L2: MT/C/5
L3: RRIV2
L4: RRIV4
L5: AC 88
L6: RO/CM/10
L7: LH 82/152
L8: LH 82/008


Hình 4.12: Phân cắt sản phẩm PCR bởi enzyme CfoI.
Ghi chú
L1: DNA ladder
L2: MT/C/5
L3: RRIV2
L4: RRIV4
L5: AC 88
L6: RO/CM/10
L7: LH 82/152
L8: LH 82/008


300 bp

100 bp
Sản phẩm
PCR cắt
không
hoàn toàn

400 bp


100 bp



45



Hình 4.13: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme RsaI.
Ghi chú:
L1: DNA ladder
L2: MT/C/5
L3: RRIV2
L4: RRIV4
L5: AC 88
L6: RO/CM/10
L7: LH 82/152
L8: LH 82/008
L9: sản phẩm PCR trƣớc khi cắt.


Hình 4.14: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HaeIII.
L1: DNA ladder
L2: MT/C/5
L3: RRIV2
L4: RRIV4
L5: AC 88

L6: RO/CM/10
L7: LH 82/152
L8: LH 82/008



400 bp


100 bp


400 bp

100 bp




Hình 4.15: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme Sau3AI.
Ghi chú:
L1: DNA ladder
L2: MT/C/5
L3: RRIV2
L4: RRIV4
L5: AC 88
L6: RO/CM/10
L7: LH 82/152
L8: LH 82/008
L9: Sản phẩm PCR khi chƣa cắt

300 bp

100 bp



Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi cắt bằng enzyme EcoRI, chúng tôi thu được hai
đoạn DNA có kích thước khoảng 240 bp và 300 bp. Sự phân cắt bằng enzyme HaeIII
tạo thành hai đoạn DNA có kích thước khoảng 390 bp và 160 bp. Những kết quả này
phù hợp với những nghiên cứu trước đây của Silva và cộng sự (1998), Safiah và cộng
sự (2003). Sự phân cắt bằng RE khi điện di trên gel agarose cho phép ước lượng kích
thước của những đoạn DNA tạo thành dựa vào thang DNA chuẩn. Tuy nhiên, chúng
tôi không thể so sánh những kết quả mà chúng tôi thu nhận được khi cắt sản phẩm
PCR bằng những enzyme khác với những kết quả nghiên cứu trước đây trên thế giới
do không có số liệu và những nghiên cứu ở mức độ phân tử của nấm C. cassiicola hiện
nay chưa nhiều.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, hầu hết các RE được sử dụng chỉ tìm thấy một vị
trí cắt ngoại trừ enzyme CfoI có thể có đến 3 vị trí cắt khác nhau. Kết quả điện di cho
thấy, khi cắt bằng CfoI chỉ thu nhận được 2 đoạn DNA, một đoạn có kích thước
khoảng 300 bp, một đoạn có kích thước khoảng 100 bp. Điều đó có nghĩa là ngoài 2
đoạn DNA đó còn có những đoạn DNA khác không thể quan sát được, có thể do
nguyên nhân sau: lượng DNA quá ít, nhuộm bằng ethidium bromide không cho phép
nhận biết sự có mặt của đoạn DNA này. Ngoài enzyme CfoI, khi phân cắt bằng
enzyme Sau3AI, các đoạn DNA vừa tạo thành có tổng kích thước không bằng kích
thước của sản phẩm PCR, điều này được giải thích tương tự như trường hợp xảy ra với
enzyme CfoI.
Mặc dù các mẫu phân tích có biểu hiện triệu chứng khác nhau trên lá cao su,

nhưng khi phân tích đa hình vùng ITS bằng các enzyme cắt giới hạn không nhận thấy
bất cứ sự khác biệt nào ở vị trí cắt của các enzyme đã sử dụng. Các mẫu thu nhận ở 2
khu vực khác nhau cũng cho kết quả giống nhau khi phân cắt bằng các enzyme cắt giới
hạn. Tuy nhiên, số lượng mẫu phân tích còn ít nên chưa thể đánh giá có hay không có
sự đa dạng di truyền trong quần thể nấm C. cassiicola trên các dvt cao su ở Việt Nam.
Mặt khác, có thể những mẫu trên có thể có sự khác biệt trong trình tự nucleotide,
nhưng những khác biệt này không xảy ra ngay vị trí cắt của các enzyme cắt, phân tích
bằng các enzyme cắt không phát hiện được sự sai khác.
Kết quả phân tích vùng ITS bằng 6 RE đều không phát hiện bất cứ sự khác biệt
nào. Các mẫu nấm mà chúng tôi phân tích có thể cùng thuộc một chủng nấm
C. cassiicola và đây có thể là chủng nấm C. cassiicola duy nhất gây bệnh trên cây cao
su ở Việt Nam hiện nay. Tuy nhiên, để có thể đi đến những kết luận chính xác hơn cần
phải nghiên cứu trên số lượng lớn các mẫu nấm C. cassiicola.



PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận
Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su hiện nay có biểu hiện triệu chứng bệnh
rất khác nhau, mức độ bệnh tùy theo tính mẫn cảm của từng dvt cao su khác nhau.
Việc này làm cho việc kiểm soát tình hình bệnh trở nên khó khăn. Việc nghiên cứu về
tác nhân gây bệnh C. cassiicola phần nào giúp cho chiến lược quản lý tình hình bệnh
trở nên dễ dàng hơn. Qua nghiên cứu về một số mẫu bệnh do tác nhân C. cassiicola
gây ra chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau.
Quy trình thực hiện phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng ITS của nấm
C. cassiicola đã được ứng dụng ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới có thể được sử
dụng để nghiên cứu nấm C. cassiicola ở Việt Nam.
Việc ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh rụng lá Corynespora trên cây

cao su với cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả do kích thước của đoạn DNA
khuếch đại được không đặc hiệu so với các nấm khác.
Phân tích sản phẩm khuếch đại vùng ITS của các mẫu nấm trên các dvt cao su
khác nhau, có triệu chứng bệnh khác nhau bằng các enzyme cắt giới hạn không nhận
thấy bất cứ sự khác biệt nào ở kích thước của đoạn DNA tạo thành. Các mẫu nấm là
giống nhau khi phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS.
Các mẫu nấm nghiên cứu có thể cùng thuộc một chủng và đây có thể là chủng
C. cassiicola duy nhất gây bệnh cho cây cao su ở Việt Nam hiện nay.
5.2. Đề nghị
Những dvt cao su mới lai tạo ở Việt Nam biểu hiện mức độ bệnh rất khác nhau
(Nguyễn Ngọc Mai, 2005). Những nghiên cứu khác trên thế giới cho thấy giữa các
dòng nấm C. cassiicola trên cây cao su có sự phân hóa di truyền (Safia và cộng sự,
2003 ). Do vậy, chúng tôi đưa ra một số đề xuất sau.
Tăng số lượng mẫu kiểm tra để kết quả phân tích mang tính khái quát hơn.
Cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về đặc điểm sinh trưởng, phát triển cũng
như tính độc của nấm C. cassiicola trên cây cao su kết hợp với ứng dụng kỹ thuật
RAPD – PCR để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao
su ở Việt Nam, đồng thời xác định mối quan hệ giữa tính kháng của các dvt cao su lai



tạo trong nước với những khác biệt về di truyền của nấm C. cassiicola. Điều này sẽ có
lợi cho công tác tạo giống kháng và công tác quản lý bệnh.
Tiến tới giải trình tự vùng ITS để xác định mức độ biến dị trong vùng ITS của
nấm C. cassiicola Việt Nam so với các dòng nấm C. cassiicola khác đã giải trình tự
trên thế giới, xác định vị trí phân loại C. cassiicola Việt Nam trong cây phân loại nấm
C. cassiicola.
Để hướng tới tạo giống cao su kháng bệnh rụng lá Corynespora cần nghiên cứu
đa hình gen kháng C. cassiicola trên cây cao su, việc này giúp chọn nhanh dvt có khả
năng kháng C. cassiicola và cũng là cơ sở để thực hiện lai tạo những dvt mới có khả

năng kháng bệnh.