thẩm định qui trình xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế bằng kỹ thuật trung hòa

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
**************



BÙI SỸ DŨNG


thÈm ®Þnh qui tr×nh x¸c ®Þnh hiÖu gi¸
huyÕt thanh kh¸ng ®éc tè uèn v¸n tinh chÕ
b»ng kü thuËt trung hßa


Chuyên ngành : Vi sinh Y học
Mã số : 60.72.68





LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC


Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS. TS. Lê Văn Phủng

HÀ NỘI - 2011


2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
**************






BÙI SỸ DŨNG

thÈm ®Þnh qui tr×nh x¸c ®Þnh hiÖu gi¸
huyÕt thanh kh¸ng ®éc tè uèn v¸n tinh chÕ
b»ng kü thuËt trung hßa








LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC









HÀ NỘI – 2011


3



.
:

PGS.TS, Lê Văn Phủng, Viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin
và Sinh phẩm Y tế, Trưởng bộ môn Vi sinh, Đại học Y Hà Nội
và tạo điều kiện cho nghiên cứu và
.

-
.
định Quố
.
, nhưng không phải là ít nhất
, những người
viên tôi .
M .


Bùi Sỹ Dũng


4


.
.

Bùi Sỹ Dũng




5

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ab:
Kháng thể
(Antibody)
Ag:
Kháng nguyên
(Antigen)
CV:

Hệ số biến thiên
(Coefficient of variation)
DĐVN IV:
Dược điển Việt Nam IV
DD/dd:
Dung dịch
ELISA:
Thử nghiệm miễn dịch gắn men
(Enzyme-linked Immunosorbent assay)
RIA:
Thử nghiệm miễn dịch phóng xạ
(Radio-Immuno-Assay)
Fab:
Mảnh Fab
(Antigen binding fragment)
Fc:
Mảnh Fc
(Cristallizable fragment)
GMP:
Thực hành sản xuất tốt

(Good Manufacturing Practice)
IVAC
Viện vắc xin và sinh phẩm y tế
(Institute of vaccine and medical biologicals)
IgG:
Immunoglobulin G
IU:
Đơn vị quốc tế
(Internationnal Unit)
KĐQG:
Kiểm định quốc gia
HTKĐTUVC:
Huyết thanh kháng độc tố uốn ván chuẩn


6
HTKĐTUVTN:
Huyết thanh kháng độc tố uốn ván thử nghiệm
L
+
/10:
Liều thử thách của độc tố uốn ván
MC:
Mẫu chuẩn
MCQT:
Mẫu chuẩn quốc tế
MTN:
Mẫu thử nghiệm
NICVB:
Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

(National Institute for Control of Vaccine and Biologicals)
OD:
Mật độ quang học
(Optical Density)
TN:
Thử nghiệm
TRS:
Hồ sơ kỹ thuật
(Technical Report Series)
TCYTTG:
Tổ chức Y tế thế giới (WHO)
(World Health Organization)
TIG-H:
Kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc từ người
(Tetanus Immuno-Globulin-Human)
ISO:
Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế
(International Standard Organization)
SAT:
Kháng độc tố uốn ván
(Serum Anti Tetanus)
SOP:
Quy trình chuẩn
(Standard Operating Procedure)
SD:
Độ lệch chuẩn
(Standard deviation)

7
MỤC LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 14
1.1 Thẩm định qui trình 14
1.1.1 Những trường hợp cần phải thẩm định qui trình 14
1.1.2 Yêu cầu chung 14
1.1.3 Các chỉ tiêu trong thẩm định qui trình xét nghiệm, kiểm định 15
1.2. Vi khuẩn uốn ván và huyết thanh kháng uốn ván 20
1.2.1 Vi khuẩn uốn ván 20
1.2.2 Kháng độc tố uốn ván 24
1.2.3 Huyết thanh kháng độc tố uốn ván 26
1.2.4 Sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván 27
1.3 Kiểm định chất lượng huyết thanh kháng độc tố uốn ván 33
1.3.1 Yêu cầu chung 33
1.3.2 Các tiêu chí kiểm tra chất lượng kháng độc tố uốn ván 33
1.3.3 Xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván bằng kỹ thuật
trung hòa 35
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40
2.1 Đối tượng nghiên cứu 40
2.2 Nguyên vật liệu 41
2.2.1 Động vật thí nghiệm 41
2.2.2 Độc tố uốn ván 41
2.2.3 Mẫu chuẩn 41
2.2.4 Mẫu thử nghiệm 41
2.2.5 Dung dịch pha độc tố uốn ván và huyết thanh kháng độc tố uốn ván 41

8
2.2.6 Dụng cụ 42
2.3 Phương pháp nghiên cứu 42
2.3.1 Thiết kế thử nghiệm và cách xác định độ đúng, hệ số biến thiên, hệ
số tương quan 42
2.3.2 Các bước tiến hành cho một lần thử nghiệm 44
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48
3.1 Độ đúng 48
3.2 Độ chính xác 55
3.3 Độ tuyến tính 62
Chƣơng 4: BÀN LUẬN 63
4.1 Thử nghiệm "có giá trị" và "không có giá trị" 63
4.2 Độ đúng 64
4.2.1 Trọng lượng chuột tham gia thử nghiệm 64
4.2.2 Độ dao động kết quả thử nghiệm 64
4.2.3 Độ đúng của qui trình 65
4.3 Độ chính xác 66
4.3.1 Trọng lượng chuột tham gia thử nghiệm 66
4.3.2 Độ dao động kết quả thử nghiệm 66
4.3.3 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian 67
4.4 Độ tuyến tính 67
KẾT LUẬN 70
KIẾN NGHỊ 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


9
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Độ pha loãng cao nhất của mẫu thử gây chết chuột trong các lần thử
nghiệm xác định độ đúng 48
Bảng 3.2 Trọng lượng của chuột (g) sử dụng trong xác định độ đúng 49
Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) kết quả thử nghiệm so với giá trị thực của mẫu (độ đúng) 54
Bảng 3.4 Độ pha loãng cao nhất của mẫu thử gây chết chuột trong các lần thử
nghiệm xác định độ chính xác 55
Bảng 3.5 Trọng lượng của chuột (g) sử dụng trong xác định độ chính xác 56
Bảng 3.6 Kết quả thử nghiệm tính theo % so với giá trị trung bình của mẫu
trong xác định độ chính xác của qui trình 60
Bảng 3.7 Hệ số biến thiên khi xác định độ lặp lại của qui trình 61
Bảng 3.8 Hệ số biến thiên khi xác định độ chính xác trung gian của qui trình 61




10
DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Minh họa độ đúng và độ chính xác của qui trình 19
Hình 1.2 Bệnh nhân uốn ván 20
Hình 1.3 Trực khuẩn uốn ván (Clostridium tetani) 21
Sơ đồ 1.1 Cấu trúc phân tử độc tố uốn ván và các sản phẩm thu được sau khi
xử lý với Papain và Thio urea 23
Sơ đồ 1.2 Tóm tắt qui trình sản xuất kháng độc tố uốn ván từ ngựa 28
Hình 1.4 Minh họa thử nghiệm trung hòa 36
Biểu đồ 3.1 Kết quả thử nghiệm độ đúng ở mẫu nồng độ 1000 IU/mL 51
Biểu đồ 3.2 Kết quả thử nghiệm độ đúng ở mẫu nồng độ 1100 IU/mL 52
Biểu đồ 3.3 Kết quả thử nghiệm độ đúng ở mẫu nồng độ 1200 IU/mL 52
Biểu đồ 3.4 Kết quả thử nghiệm độ đúng ở mẫu nồng độ 1300 IU/mL 53
Biểu đồ 3.5 Kết quả thử nghiệm độ đúng ở mẫu nồng độ 1400 IU/mL 53

Biểu đồ 3.6 Kết quả thử nghiệm độ chính xác trung gian ở mẫu lô số 324 58
Biểu đồ 3.7 Kết quả thử nghiệm độ chính xác trung gian ở mẫu lô số 325 59
Biểu đồ 3.8 Kết quả thử nghiệm độ chính xác trung gian ở mẫu lô số 326 59
Biểu đồ 3.9 Tương quan tuyến tính giữa kết quả thử nghiệm với nồng độ của
mẫu 62







11
DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Qui trình xác định thể tích dung dịch độc tố uốn ván chứa L
+
/10.
Phụ lục 2: Biểu mẫu tiến hành xác định thể tích dung dịch độc tố uốn ván
chứa L
+
/10.
Phụ lục 3: Qui trình xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh
chế bằng kỹ thuật trung hòa.
Phụ lục 4: Biểu mẫu tiến hành xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn

ĐẶT VẤN ĐỀ




12
Ở nước ta cũng như trên thế giới, các loại chế phẩm sinh học có nguồn gốc
từ vi khuẩn, vi rút v.v đã được sử dụng rộng rãi cho người nhằm mục đích
phòng (vắc xin) và/hoặc chống (huyết thanh miễn dịch) nhiều bệnh nhiễm vi
sinh vật. Các chế phẩm sinh học cần phải được kiểm tra chất lượng toàn diện
trước khi dùng cho người. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo tất cả các
loạt sinh phẩm trước khi cấp phép xuất xưởng phải được kiểm định nghiêm
ngặt về các tính chất an toàn, công hiệu, vô trùng, chất gây sốt và các đặc tính
về hoá lý
Kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc từ ngựa được sản xuất và sử dụng trên

thế giới từ những năm chiến tranh thế giới thứ nhất. Ở Việt Nam kháng độc tố
uốn ván được Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang sản xuất thành
công từ những năm 1980. Tuy vậy trên thị trường trong nước, hiện nay có
huyết thanh kháng độc tố uốn ván của 4 nhà sản xuất: Viện vắc xin và Sinh
phẩm Y tế (Tetanus Antitoxin), Sanofi - Pasteur (Tetanea), Trung Quốc (Anti-
Teta 2), Hungari (Tetanus Antitoxin). Mỗi năm có khoảng 20 loạt huyết thanh
kháng độc tố cần được đánh giá chất lượng trước khi đưa vào sử dụng. Để
thực hiện tốt việc xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế
cần có một qui trình đánh giá có độ tin cậy cao.
Hiện nay, trong khu vực và trên thế giới đang sử dụng phổ biến qui trình
xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván bằng kỹ thuật trung hòa.
Qui trình này cũng đã được Viện Kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y
tế (NICVB) và Viện vắc xin và sinh phẩm y tế (IVAC) sử dụng trong nhiều
năm và đây cũng là qui trình được ghi trong dược điển Việt Nam 4 (2009).
Tuy vậy, qui trình này vẫn chưa được thẩm định đầy đủ và chặt chẽ. Để góp
phần khắc phục những hạn chế này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:


13
"Thẩm định qui trình xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván
tinh chế bằng kỹ thuật trung hòa" với 3 mục tiêu sau:
1- Xác định độ đúng của qui trình.
2- Xác định độ chính xác của qui trình.
3- Xác định độ tuyến tính của qui trình.

14
Chƣơng 1
TỔNG QUAN

1.1 Thẩm định qui trình
Theo ISO/IEC 17025: Thẩm định qui trình kỹ thuật là việc khẳng định
bằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan rằng các thông số cần xác
định cho việc sử dụng một qui trình cụ thể đã được thực hiện [9].
Theo WHO: Thẩm định qui trình kỹ thuật là quá trình thiết lập một hoặc nhiều
hơn các đặc tính: Độ đúng, độ chính xác, độ tuyến tính, vùng tuyến tính, độ đặc
hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ mạnh phù hợp với từng qui
trình 49 50 .
1.1.1 Những trường hợp cần phải thẩm định qui trình
Việc thẩm định một qui trình kỹ thuật là nhằm chứng minh qui trình đó có
phù hợp với mục đích sử dụng không 38 . Thẩm định qui trình thử nghiệm
phải được tiến hành khi 45 49 : Áp dụng một qui trình mới (thẩm định toàn
phần), áp dụng các qui trình có trong Dược điển hoặc chuyển giao kỹ thuật (thẩm
định một phần) hoặc nếu có thay đổi lớn về qui trình thử nghiệm (thay đổi dụng cụ,
trang thiết bị, công thức hoặc qui trình thực hiện) thì tiến hành tái thẩm định một
phần 22 50 .
Thẩm định qui trình kỹ thuật là một qui định bắt buộc, được tiến hành định
kỳ nhằm đảm bảo chất lượng của các kết quả thử nghiệm, vì kết quả thử
nghiệm có thể bị biến đổi bởi những yếu tố: Nhiệt độ, độ ẩm, điện áp, con
người, thiết bị và các phòng thí nghiệm khác nhau [51] [55].
1.1.2 Yêu cầu chung
Điều quan trọng nhất trong quá trình thẩm định là: các qui trình đó được
diễn ra trong các điều kiện thực. Tức là mọi hoạt động diễn ra tương tự như


15

các hoạt động thường xuyên mà qui trình đó được thực hiện trong quá trình
làm việc. Ví dụ: Số người /nhân viên tham gia, các qui trình đi vào, đi ra;
giám sát môi trường, thao tác thực hiện giống như công việc thực hàng ngày
khi áp dụng qui trình cần thẩm định 50 .
Tất cả các số liệu liên quan thu được trong quá trình thẩm định và các
công thức được sử dụng để tính toán các đại lượng đặc trưng của việc thẩm
định cần được đưa ra và thảo luận. Các chất đối chiếu được sử dụng trong quá
trình thẩm định cần phải được đánh giá rõ ràng và kèm theo tài liệu về độ tinh
khiết. Mức độ tinh khiết phụ thuộc vào mục đích sử dụng 38 .
1.1.3 Các chỉ tiêu trong thẩm định qui trình xét nghiệm, kiểm định
Thẩm định qui trình thử nghiệm là một quá trình xác định một hay nhiều
chỉ số phù hợp đối với thử nghiệm về 22 37 38 41 45 .
- Độ đúng.
- Độ chính xác.
- Độ tuyến tính và vùng tuyến tính.
- Độ đặc hiệu.
- Độ mạnh.
- Giới hạn phát hiện.
- Giới hạn định lượng.
1.1.3.1 Độ đúng (Accuracy)
Độ đúng của một qui trình biểu diễn mức độ gần gũi giữa giá trị tìm thấy
sau thử nghiệm với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu đã biết 38 41 49
50 .
Độ đúng được đánh giá trên kết quả của: Tối thiểu 9 lần thử nghiệm trong
khoảng nồng độ đã được xác định của qui trình (ví dụ: 3 nồng độ đã được xác
định giá trị, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần) hoặc tối thiểu 6 lần thử
nghiệm ở nồng độ thử 100% 41 50 .


16

Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm thu được sau thử nghiệm của
lượng chất cần tìm đã được thêm vào mẫu hoặc sự khác biệt giữa giá trị trung
bình đo được và giá trị thực với cùng khoảng tin cậy 38 49 50 .
1.1.3.2 Độ chính xác (Precision)
Là giá trị gần nhất giữa nhiều lần đo thu được trong nhiều lần lấy mẫu, nó
có thể biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn (SD), hoặc hệ số biến thiên (CV), độ
chính xác có thể được coi là 38 49 50 :
- Độ lặp lại (Repeatability): Độ lặp lại diễn tả độ "chụm" của một qui
trình, trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại
còn được gọi là độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng.
- Độ chính xác trung gian (Intermediate precision): Độ chính xác trung gian
diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện
ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau.
- Tính tái lặp (Reproducibility): Tính tái lặp diễn tả độ chính xác giữa các
phòng thí nghiệm (Các nghiên cứu phối hợp giữa các phòng thí nghiệm
thường được áp dụng để tiêu chuẩn hoá phương pháp).
Độ chính xác được đánh giá trên kết quả của: Tối thiểu 9 lần thử nghiệm
trong khoảng nồng độ đã được xác định của qui trình (ví dụ: 3 nồng độ đã
được xác định, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần) hoặc tối thiểu 6 lần thử
nghiệm ở nồng độ thử 100% 41 50 .
Độ chính xác của mỗi một qui trình cần phải đưa ra các dữ liệu sau: Độ
lệch chuẩn (standard deviation), độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard
deviation) hay hệ số biến thiên (coefficient of variation) và khoảng tin cậy
41 50 .
1.1.3.3 Độ tuyến tính (Linearity): Là khả năng của một thử nghiệm thu được
các kết quả thí nghiệm dựa vào đường thẳng biểu diễn sự tương quan giữa độ


17
đáp ứng của đại lượng đo được và nồng độ chất cần tìm trong mẫu 22 38

45 49 50 .
Độ tuyến tính được đánh giá trên kết quả của: Tối thiểu 5 nồng độ mẫu đã
được xác định giá trị, mỗi nồng độ được tiến hành tối thiểu 3 lần 22 37 41
50 .
1.1.3.4 Vùng tuyến tính (Range): Là vùng của phương pháp thể hiện bởi
khoảng giữa mức độ/nồng độ thấp và cao của các chất cần phân tích được xác
định với mức độ chấp nhận về độ đúng, độ chính xác vẫn còn tuyến tính 22
37 41 49 50 .
1.1.3.5 Độ đặc hiệu (Specificity): Là khả năng xác định được chất cần tìm
có trong mẫu thử khi có mặt các thành phần khác: tá dược, tạp chất 22 37
41 49 50 .
1.1.3.6 Độ mạnh (Ruggedness): Là mức độ tái lặp các kết quả thu được
bằng cách phân tích các mẫu giống nhau với nhiều thay đổi nhỏ so với điều
kiện chuẩn (phòng thí nghiệm khác nhau, kỹ thuật viên khác nhau, dụng cụ,
trang thiết bị khác nhau, thuốc thử khác lô, khác nhau về nhiệt độ, thời gian
thử ) 38 41 45 50 .
1.1.3.7 Giới hạn phát hiện (LOD - Limit of Detection): Là lượng nhỏ nhất
chất cần tìm có thể xác định được nhưng không định lượng được giá trị chính
xác của nó 38 41 45 50 .
1.1.3.8 Giới hạn định lượng (LOQ - Limit of Quantitation): Là lượng nhỏ nhất
chất cần tìm mà một qui trình kỹ thuật có thể định lượng được với điều kiện
thỏa mãn độ đúng, độ chính xác thích hợp. Xác định LOQ bằng cách pha
loãng đến nồng độ tối thiểu có thể phát hiện được chất thử với độ đúng và độ
chính xác theo yêu cầu 38 41 45 50 .


18
Tùy thuộc vào từng loại qui trình như: Nhận dạng, định lượng, xác định
giới hạn, xác định công hiệu và xác định thành phần mà chúng ta có thể sử
dụng các thông số phù hợp như sau 38 41 45 50 .

Thử nghiệm
Thông số
Nhận dạng
Xác định độ tinh khiết
Xác định
công hiệu
Xác định
thành phần
Định lƣợng
Xác định
các giới hạn
Độ đúng
-
+
-
+
+
Độ chính xác
-
+
-
+
+
Độ mạnh
+
+
+
+
+
Đường/vùng tuyến tính

-
+
-
+
+
Độ đặc hiệu
+
+
+
+
+
LOD
+
-
+
-
-
LOQ
-
+
-
-
-

(-): Các chỉ tiêu này thông thường không cần phải đánh giá.
(+): Các chỉ tiêu này cần phải đánh giá.


19

Giá trị đã biết trước của mẫu thử nghiệm
Giá trị của các lần thử nghiệm
Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm
Hình 1.1 Minh họa độ đúng và độ chính xác của qui trình
Hình A giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm cao nhưng giá trị trung
bình của các lần thử nghiệm cách xa giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử
nghiệm có độ chính xác cao, nhưng độ đúng thấp 9 .
Hình B giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm thấp và giá trị trung
bình của các lần thử nghiệm cách xa giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử
nghiệm có độ chính xác và độ đúng đều thấp 9 .




Cao
Cao
Thấp
Thấp
Độ đúng
Độ chính xác

A
B
D
C


20
Hình C giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm cao và giá trị trung bình

của các lần thử nghiệm gần với giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử nghiệm
có độ chính xác và độ đúng đều cao 9 .
Hình D giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm thấp nhưng giá trị trung
bình của các lần thử nghiệm gần với giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử
nghiệm có độ chính xác thấp, nhưng độ đúng cao 9 .
1.2. Vi khuẩn uốn ván và huyết thanh kháng uốn ván
1.2.1 Vi khuẩn uốn ván
1.2.1.1 Lịch sử phát hiện vi khuẩn uốn ván
Bệnh uốn ván là một bệnh đã được ghi nhận từ cách đây hơn 2000 năm.
Biểu hiện đặc trưng của bệnh là co cứng cơ, lưng vồng lên, cơ bụng cứng, cổ
ưỡn ngửa ra sau, chân duỗi thẳng toàn thân uốn cong. Tuy vậy mãi đến cuối
thế kỷ 19 người ta mới hiểu biết về căn nguyên gây bệnh là Clostridium tetani
và nhờ đó mà tìm ra được cách phòng bệnh 19 .


Hình 1.2 Bệnh nhân uốn ván
Lưng vồng lên, cơ bụng cứng, toàn thân uốn cong

Năm 1884, hai nhà nghiên cứu là Antonio Carle và Giorgio Rattone đã
nhận thấy mối liên quan giữa vết thương và bệnh co cứng. Cùng năm,


21
Nicolaier đã lấy đất chà xát vào động vật thí nghiệm cho thấy, làm như thế có
thể gây được chứng uốn ván 19 .
Năm 1886, Rosenbach là người đầu tiên tìm thấy và mô tả trực khuẩn uốn
ván trong bệnh phẩm vết thương ở người 19 .
Năm 1889, Shibasaburo Kitasato đã nuôi cấy thành công vi khuẩn uốn ván
từ bệnh nhân bị uốn ván 19 .
Năm 1890, Faber đã chứng minh được rằng, vi khuẩn uốn ván sản xuất

(tiết) ra ngoại độc tố và chất này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh
sinh của bệnh uốn ván. Cũng trong thời gian này, Behring và Kitasato đã chế
tạo được huyết thanh chống uốn ván, bằng cách gây miễn dịch cho thỏ và
ngựa, mở ra kỷ nguyên mới trong điều trị bệnh uốn ván (dùng kháng huyết
thanh đặc hiệu) 9 .
Năm 1955, Moynihan đã sản xuất kháng độc tố uốn ván từ huyết thanh
người 4 8 31 40 .



Hình 1.3 Trực khuẩn uốn ván (Clostridium tetani)
Trực khuẩn thon dài, nha bào hình tròn ở một đầu trông giống như cái dùi trống (mũi tên)


22
1.2.1.2 Hình thái và đặc tính sinh học
Vi khuẩn uốn ván có tên khoa học là Clostridium tetani, là trực khuẩn thon
dài, đường kính thân 0,5 - 1,1 µm, dài 2,4 - 5 µm, có lông mọc xung quanh
thân, di động mạnh. Ở các nuôi cấy non, vi khuẩn bắt màu Gram dương, sau
24 giờ nuôi cấy có thể bắt màu Gram âm. Trong những điều kiện thích hợp,
nha bào hình thành được trong vòng 48 - 72 giờ. Nha bào chịu đựng được 100
o
C từ 1 đến 2 giờ, sấy khô ở 150
o
C trong 1 giờ 4 8 19 .
1.2.1.3 Độc tố uốn ván
Trực khuẩn uốn ván sinh ra hai ngoại độc tố là tetanospasmin và tetanolysin
6 19 .
- Tetanospasmin là độc tố quan trọng nhất, có tác dụng độc với thần kinh, gây
triệu chứng đặc hiệu (co cơ) của bệnh uốn ván, độc tố gắn vào tế bào thần kinh

trung ương mà không gây một biến đổi nào ở hình thái cấu trúc của tế bào này 6
19 .
- Tetanolysin có tính chất làm tan máu, gần giống như streptolysin của
Streptococcus tan huyết. Tetanolysin dễ bị ô xy làm biến chất. Tetanolysin có
độc tính đối với tim nên có thể gây chết người 2 6 19 .
- Tetanospasmin là một protein nhạy cảm với nhiệt độ, có trọng lượng phân
tử 150.000; gồm 2 tiểu đơn vị: chuỗi nặng (H) - trọng lượng phân tử khoảng
100.000 chịu trách nhiệm gắn vào gangliosid trên màng tế bào thần kinh và
chuỗi nhẹ (L) - trọng lượng phân tử khoảng 50.000, mang độc tính. Hai chuỗi
được nối với nhau bằng cầu nối disulfit -S-S Khử cầu nối này ta thu được 2
chuỗi riêng biệt và không còn tính độc, nhưng khi nối trở lại, độc tính lại hồi
phục. Người ta cũng có thể dùng papain để cắt phân tử độc tố (mà vẫn giữ
được cầu nối disulfit) thành 2 đoạn không độc, mỗi đoạn có thể dùng làm
kháng nguyên gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm và chúng vẫn phản ứng
đặc hiệu với kháng độc tố (hình 1.2 ) 19 .


23
Tetanospasmin là một trong hai độc tố có tính độc cao nhất, chỉ đứng sau
ngoại độc tố của vi khuẩn gây ngộ độc thịt Clostridium botulinum: chỉ 10
-4
µg
đã đủ gây chết chuột nhắt trắng trong 48 giờ (liều gây chết của Clostridium
botulinum là 10
-6
µg). Độc tố uốn ván được hình thành trong tế bào, một phần
được tiết ra ngoài, một phần được giải phóng khi tế bào bị ly giải. Sau xử lý
bằng formol, tetanospasmin trở thành giải độc tố (anatoxin) 19 29 40 .
Độc tố hòa tan được trong nước, bị hủy ở nhiệt độ 65
o

C trong 1 - 2 giờ, bị
biến chất dưới tác dụng của ánh sáng, các chất kiềm và axit mạnh 13 32 .


Sơ đồ 1.1 Cấu trúc phân tử độc tố uốn ván
và các sản phẩm thu được sau khi xử lý với Papain và Thio urea

COO
-
S
S
466
438
H
3
N
S
S
-
OOC
H
3
N
+
H
3
N
+
-
COO

-
H
3
N
+
Mảnh
A
-
B
Mảnh C
Chuỗi L
Chuỗi
H
Papain
(vừa đủ)
Thio
Urea

H
3
N
+
Phân tử độc tố
uốn ván
COO
Các sản phẩm thu được
+


24

1.2.1.4 Giải độc tố uốn ván
Độc tố uốn ván được giải độc thì tạo thành giải độc tố. Giải độc tố uốn ván
là một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao, có khả năng kích thích cơ
thể hình thành kháng thể trung hòa độc tố. Người ta sử dụng giải độc tố để sản
xuất vắc xin phòng bệnh uốn ván. Hiện nay, hầu hết các nhà sản xuất đều sử
dụng chủng Clostridium tetani Harvard, nuôi cấy trên môi trường Mueller -
Miller trong nồi lên men với thời gian khoảng 1 tuần, cho đến khi vi khuẩn
giải phóng ra độc tố. Sản phẩm thu được từ quá trình nuôi cấy này (độc tố
thô) được lọc và giải độc bằng focmalin với nồng độ cuối cùng là 0,5% với pH
7,6 và giữ ở 37
o
C trong thời gian 4 tuần để độc tố uốn ván được giải độc hoàn
toàn 19 43 .
1.2.2 Kháng độc tố uốn ván
Kháng độc tố uốn ván thuộc lớp globulin miễn dịch IgG cho nên có cấu
trúc phân tử giống như cấu trúc phân tử chung của lớp IgG. Phân tử IgG có
phân tử lượng 150.000 daltons, khi dùng papain xử lý, phân tử này được cắt
làm 3 mảnh có trọng lượng phân tử tương tự nhau, khoảng 50.000 daltons.
Hai trong 3 mảnh có cấu trúc và tính năng giống nhau và có khả năng kết hợp
đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Hai mảnh này là Fab (antigen binding
fragment) vì có khả năng kết hợp với kháng nguyên. Mảnh thứ 3 có khả năng
kết tinh trong dung dịch và được gọi là mảnh Fc (cristallizable fragment)
không có khả năng kết hợp với kháng nguyên nhưng mang các thuộc tính sinh
học khác của phân tử globulin miễn dịch.
Khi phân tử IgG được xử lý với chất Mercaptoethanol để cắt cầu nối disulfua
(S-S) thì phân tử sẽ được chia thành 4 chuỗi giống nhau từng đôi. Một đôi có phân
tử lượng 53.000 daltons gọi là chuỗi nặng viết tắt là H (H: Heavy) và một đôi có
phân tử lượng là 22.000 daltons gọi là chuỗi nhẹ L (L: Light). Phân tử IgG nếu
đem xử lý với men pepsin, men này sẽ cắt chuỗi nặng ở phía đầu COOH của cầu

25
nối S-S liên chuỗi nặng bởi vậy phân tử chỉ được chia làm 2 mảnh: Mảnh lớn có
phân tử lượng khoảng 100.000 daltons và có 2 hóa trị để kết hợp kháng nguyên và
được gọi là mảnh F(ab’)2, mảnh nhỏ còn lại nhanh chóng bị phá hủy.
Cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ đều có vùng thay đổi (variable domain), ở đó
trình tự sắp xếp của các axid amin biểu lộ ở mức cao tính đa dạng của khả
năng gắn đặc hiệu với kháng nguyên lên mỗi phân tử IgG. Vị trí thay đổi của
phân tử ở chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được gọi lần lượt là VH và VL (V:
Variable; H: Heavy; L: Light). Phân tử IgG gắn kháng nguyên với tính đặc
hiệu như nhau. Mỗi vị trí gắn kháng nguyên được hình thành bởi liên kết của
một vùng VH với vùng VL. Những khu vực khác của phân tử kháng thể
không có sự thay đổi về trật tự sắp xếp axid amin được gọi là vùng hằng định
CH trên chuỗi nặng và CL trên chuỗi nhẹ (C: Constant).
Chuỗi nhẹ chỉ có một vị trí CL, trong khi chuỗi nặng có ba vị trí là CH1
,

CH2
,
CH3. Chúng có cấu trúc khác nhau đối với từng lớp dưới IgG. Các cầu
disulfit nối hai chuỗi nặng đối diện với nhau tại mối nối giữa CH2 và CH2, tại
đó cấu trúc bậc 3 của protein tạo ra vị trí nhận biết đặc hiệu đối với C1
q
là
phần đầu tiên bị hoạt hóa theo con đường cũ (kinh điển, classical) của hệ
thống hoạt hóa bổ thể 30 35 42 43 .
Phân tử IgG có tầm quan trọng đối với một số chức năng của kháng thể
như thực bào kháng nguyên qua trung gian bổ thể. Ngoài ra có thể có chức
năng đối với phản ứng phụ do trị liệu bằng Immunoglobulin.
Hai vùng CH3 đối nhau được hợp nhất bởi cầu nối không đồng hóa trị,

trong khi 2 vùng CH2 vẫn tách biệt bởi hai chuỗi oligosaccharid. Phân đoạn
Fc của IgG chịu trách nhiệm dọn sạch (clearing) các phức hợp kháng nguyên
kháng thể (Ag/Ab) bằng cách:
- Hoạt hóa hệ thống bổ thể.