Luận văn : Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire part 5 pot

37

Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 3 với nồng độ gel 1,5 %
4.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo hai loại mẫu khác nhau
Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR với 2 loại mẫu khác nhau, kết quả
thu đƣợc nhƣ Bảng 4.5 sau:
Bảng 4.5: So sánh tỉ lệ thành công của phản ứng PCR với hai loại mẫu khác nhau
Loại mẫu
Số mẫu thực hiện
Số mẫu thành công
Tỉ lệ thành công (%)
Máu
10
3
30
Da tai
10
7
70
Mẫu máu có tỉ lệ thành công thấp hơn mẫu da tai. Các loại protein của máu chủ yếu
là các phân tử hemoglobin có chứa nhóm heme (Nguyễn Phƣớc Nhuận, 2003). Theo
Erlich nhóm này ức chế mạnh đến hoạt động của Taq polymerase ( trích dẫn bởi Lê
Thị Thu Phƣơng, 2003). Do Taq polymerase bị ức chế nên phản ứng PCR có hiệu quả
thấp trong việc xác định gen PRLR.
1 2 3 4 5 6 7 8
Các băng
phụ chuỗi
ngắn

38

Hình 4.6: Kích thƣớc của sản phẩm PCR
Ghi chú: 1, 2,3 :sản phẩm PCR đƣợc thực hiện bởi cặp primer của A.L Vincent
LD (ladder): 100 bp
4.3 Kết quả thực hiện cắt enzyme giới hạn trên các nồng độ khác nhau
Việc xử lý enzyme là một trong những công đoạn quan trọng trong việc xác định
tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin. Đây là công đoạn rất tốn kém, đòi
hỏi chi phí cao khi thao tác trên số lƣợng mẫu lớn. Do đó, việc xác định nồng độ, thể
tích của các enzyme tham gia vào quá trình phân cắt sao cho hiệu quả nhất và kinh tế
nhất là rất cần thiết. Kết quả của việc cắt enzyme theo các qui trình khác nhau đƣợc
trình bày ở bảng 4.6 dƣới đây:
Bảng 4.6: So sánh tỉ lệ thành công giữa các nồng độ cắt enzyme khác nhau
Nồng độ
Số mẫu thực hiện
Số mẫu thành công
Tỉ lệ % thành công
1
10
0
0
2
10
10
100
3
10
10
100

Xử lý enzyme theo qui trình của nhà sản xuất không thành công. Sản phẩm sau khi
xử lý enzyme không thấy sự phân cắt của enzyme. Đây là qui trình chuẩn yêu cầu
1000 bp
400 bp
390 bp
LD 1 2 3 4 5


39
lƣợng DNA của mẫu đƣa vào tƣơng đối chính xác, lƣợng enzyme sử dụng tƣơng đối
cao. Sản phẩm PCR của chúng ta sau khi thu đƣợc thể tích khoảng 25 µl, nồng độ rất
khó định lƣợng, không thể đạt đến mức 1000 ng / µl . Nhƣ vậy, việc thực hiện theo qui
trình này vừa không hiệu quả, vừa tốn kém.
Ở qui trình 2, qui trình 3 các sản phẩm sau khi điện di cho kết quả rất tốt, các băng
thể hiện rất rõ. Nhƣ vậy không có sự khác biệt giữa qui trình 2 và qui trình 3. Nhƣng vì
lý do kinh tế nên chúng tôi quyết định chọn qui trình 3 sử dụng trong công tác phân
tích gen thụ thể prolactin.
Trong việc xử lý enzyme giới hạn này có nhiều vấn đề cần đƣợc quan tâm:
Nồng độ gel dùng để điện di:
Sản phẩm phân cắt enzyme là các đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng đối ngắn từ 50 –
121 bp. Nên chúng ta cần sử dụng nồng độ gel cao từ 2.5 – 6 %. Nếu chúng ta sử dụng
nồng độ gel thấp thì các băng DNA sau khi phân cắt sẽ bị nhoè, không phân biệt rõ
ràng. Trƣờng hợp cụ thể ở đây là sử dụng nồng độ gel 3.5 %, nhƣng theo các nghiên
cứu về gen PRLR của Vincent thì ông sử dụng nồng độ gel 6 %.Với nồng độ gel đậm
đặc nhƣ thế sẽ tạo ra kích thƣớc lổ gel nhỏ giúp cho các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ
phân biệt một cách rõ ràng, nhƣng khá tốn kém.

Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme giới hạn AluI với nồng độ gel 2 %
LD: ladder 25 bp

Các giếng 1, 2, 3, ,16 không thể phân biệt đƣợc các băng DNA
Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện
1 2 3 4 LD 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 LD
Các băng DNA
bị nhoè


40
Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện đóng vai trò rất quan trọng trong quá
trình điện di. Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện cao quá sẽ làm cho các đoạn
DNA di chuyển nhanh, các đoạn DNA phân tán không tập trung lại thành một
băng có kích thƣớc lớn gây khó khăn trong việc xác định, phân biệt kích thƣớc
của các đoạn DNA. Hiện tƣợng này chỉ đƣợc thấy rõ qua các đoạn DNA có kích
thƣớc dƣới 100 bp.
Các nghiên cứu của tác giả A.L. Vincent thì sự xuất hiện của các băng DNA
có kích thƣớc 90 bp: alen A; 110 bp: alen B sau khi phân cắt là có thể xác định
đƣợc kiểu gen của heo.

Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme với gel LMP 3,5 %
Các giếng bỏ trống và đánh số không phải sản phẩm cắt enzyme trong
khoá luận này
AB, BB: Các kiểu gen PRLR
4.4 Tần số xuất hiện của các kiểu gen trong quần thể
Sau khi xây dựng thành công qui trình thực hiện kỹ thuật PCR và qui trình
cắt enzyme hiệu quả nhất thì chúng tôi tiến hành áp dụng các kết quả đạt đƣợc
vào việc xác định sự hiện diện của gen thụ thể prolactin và tần số xuất hiện của
các kiểu gen thụ thể prolactin.

110 bp
AB BB LA BB BB BB LA
66 bp
25 bp
76 bp
124 bp


41
Sự hiện diện của gen thụ thể prolactin
Bảng 4.7: Tỉ lệ xuất hiện của gen PRLR

Số mẫu
Tỉ lệ %
Có sự hiện diện của gen PLRL
23
76,67
Không có sự hiện diện của gen
PLRL
7
23,33
Tỉ lệ sự xuất hiện của các kiểu gen PRLR
Với 30 mẫu ly trích sau khi thực hiện phản ứng PCR thì thu đƣợc 23 mẫu có sự
xuất hiện gen PRLR. Xử lý 23 mẫu này với AluI theo qui trình 2 bảng 3.3 để xác định
kiểu gen. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ bảng 4.8 sau:
Bảng 4.8: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR
Kiểu gen
Số mẫu
Tỉ lệ, %

AA
1
3,33
AB
7
23,33
BB
15
50




42
3.33
23.33
50
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3
Kiểu gen
Series1

Hình 4.9: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR

Tỉ lệ (%)
AA
AB
BB



43

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Qua thời gian khảo sát chúng tôi ghi nhận đƣợc các kết quả sau:
Tần số xuất hiện của gen thụ thể prolactin
Qua quá trình phân tích kiểm tra 30 mẫu lấy lừ 30 heo nái giống Yorkshire thì tần

số xuất hiện của gen này chiếm tỉ lệ 76,67 % so với tổng số mẫu phân tích. Tỉ lệ này
chiếm khá cao.
Tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin
Cả ba kiểu gen thụ thể prolactin đều xuất hiện trên giống Yorkshire. Tần số kiểu
gen BB chiếm tỉ lệ cao nhất (50 %), kiểu gen AB chiếm tỉ lệ 23,3 %, kiểu gen AA
chiếm tỉ lệ thấp nhất (3,33 %).
Các heo nái có kiểu gen AA theo các báo cáo của A. L. Vincent (1998),
Drogemuller (2001)…có năng suất sinh sản cao hơn các kiểu gen khác nhƣng do số
mẫu phân tích chƣa đủ lớn nên không có những kết luận về mối tƣơng quan giữa năng
suất sinh sản với kiểu gen AA.
5.2 Kiến nghị
Đƣa kỹ thuật xét nghiệm này vào công tác di truyền và chọn giống
Tiếp tục khảo sát với lƣợng mẫu lớn hơn, thu thập đầy đủ các số liệu về năng
suất sinh sản của các heo nái để có cơ sở đánh giá chính xác ảnh hƣởng của
gen thụ thể prolactin lên năng suất sinh sản của nái.













44
TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu - Nguyễn Thị Lang, 1999, Di truyền phân tử những nguyên tắc cơ bản
trong chọn giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp TP. HCM
2. Trần Thị Dân, 2000, Bài giảng sinh lý học gia súc, khoa Chăn Nuôi - Thú Y bộ
môn sinh lý, sinh hóa trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3. Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội
4. PGS. TS Nguyễn Phƣớc Nhuận, 2003, Giáo trình sinh hoá học - Phần I: Sinh hoá
học tĩnh, NXB Đại học quốc gia TP. HCM
5. Lê Thị Thu Phƣơng, 2003, Ứng d ụng k ỹ thuật PCR phát hiện gen thụ thể estrogen và
gen halothan, LVTS khoa Chăn nuôi Thú y trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM.
6. W. D. Phillips – T.J. Chilton, 1998, Sinh học - Tập 1, NXB Giáo Dục
7. Trịnh Ngọc Thu Trang, 2004, Khảo sát sức sinh sản của một số nhóm giống tại xí
nghiệp lợn giống Đông Á, LVTN khoa Chăn Nuôi - Thú Y trƣờng đại học Nông Lâm
TP. HCM.
8. Trần Thị Thuỳ Trang, 2003, Khảo sát ảnh hưởng của gen thụ thể estrogen và gen
halothan lên năng suất sinh sản của heo nái, LVTN khoa chăn nuôi thú Y trƣờng đại
học Nông Lâm TP. HCM.
9. Bùi Trang Việt, 2003, Giáo trình sinh học phân tử, đại học quốc gia TP. HCM khoa
sinh học trƣờng ĐH KHTN.
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
1. T.A. Brown, 1999, Gen clonning an introduction – Third editor, Chapman and hall,
London, UK
2. C. Drogemuller, H. Hamann, and O. Distl, 2001, Cadidate gene markers for litter
size in different German pigs line, J. Anim. Sci. 2001. 79: 2565 – 2570
3. S.T Nicholl, 1994, An introduction to geneticengineering, Camdridge University, UK
A.M Griffin, H.G Griffin, PCR technology current innovation, CRC press, London, UK
4. A. L. Vincent, G. Evans’, T.H. Short, C.K. Tuggle, and M.F. Rothschild’, 1998, The
prolactin receptor gene is asociated with increased litter size in pigs, Department of
Animal Science, Iowa State University, Ames 500011

45
CÁC TRANG WEB TỪ INTERNET:

/>=12559630&dopt=Citation
/>ef_uid=582