Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire

1
PHẦN MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trong chăn nuôi heo, vấn đề quan trọng là heo phải mắn đẻ, sai con, tốc độ tăng
trƣởng nhanh, ít tiêu tốn thức ăn và phẩm chất quày thịt tốt. Vì vậy các nhà chọn giống
đã không ngừng nghiên cứu, chọn lọc và cải tạo giống nhằm đem lại năng suất và hiệu
quả cao nhất. Có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến năng suất và hiệu quả kinh tế của
việc chăn nuôi heo nhƣ: phẩm chất con giống, dinh dƣỡng, trình độ chăm sóc quản lý,
vệ sinh phòng bệnh…Trong đó phẩm chất con giống là yếu tố đặc biệt quan trọng.
Để cải thiện năng suất sinh sản trên heo nái, đặc biệt là số con trên ổ, tỉ lệ sống sót
của các heo con sau khi sinh các nhà chọn giống ở các nƣớc đã áp dụng nhiều chƣơng
trình chọn giống mới kết hợp với phƣơng pháp chọn lọc truyền thống. Ngƣời ta đã tiến
hành chọn giống heo dựa vào gen đánh dấu (Marker assisted selection – MAS). Theo
các nghiên cứu của Vincent và cộng sự (1998), Drogemuller và cộng sự (2000),
Rothchild và cộng sự (1996, 2000) cho thấy gen thụ thể prolactin (PRLR), gen thụ thể
estrogen (ESR) và retinol binding protein 4 (RBP4) có mối liên hệ với năng suất sinh
sản của nái. Trong nƣớc đã có một số tác giả đã áp dụng kỹ thuật PCR trong việc phát
hiện sự hiện diện của các gen có liên quan đến sự sinh sản của heo (Lê Thị Thúy và
cộng sự, 2002; Nguyễn Ngọc Tuân và cộng sự, 2001; Võ Thị Tuyết và cộng sự, 2005)
Công nghệ sinh học đã bắt đầu đi vào giải quyết các vấn đề thực tiễn của nghành
chăn nuôi. Đƣợc sự đồng ý của Ban chủ nhiệm Bộ môn công nghệ sinh học, dƣới sự
hƣớng dẫn của TS. Võ Thị Tuyết chúng tôi tiến hành đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật
PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire”
1.2 Mục đích - yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Ứng dụng PCR để phát hiện sự hiện diện của gen thụ thể prolactin và xác định kiểu
gen của nó trong quần thể.
1.2.2 Yêu cầu
Ly trích DNA từ mẫu máu và da tai

2
Xác định qui trình phản ứng PCR phù hợp nhất
Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu ly trích đƣợc
Xử lý enzyme các mẫu có sự hiện diện của gen PRLR
Xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen PRLR trên các mẫu


3
PHẦN 2: TỔNG QUAN
2.1 Giới thiệu sơ lƣợc về giống heo Yorkshire
Đây là giống heo lai giữa giống Large White và giống khác ở vùng Yorkshire của
Anh Quốc, nên lấy tên gọi là giống Yorkshire. Giống heo này hiện nay đƣợc nuôi rộng
rãi khắp nơi trên thế giới, và hầu hết các trại giống ở Việt Nam do những ƣu điểm
thích nghi rộng và năng suất cao. Về hình dáng bề ngoài giống Yorkshire có những
đặc điểm nhƣ thân hình dài, trông dáng vẻ nặng nề, đầu to, trán rộng, bụng gọn. Ngực
rộng và sâu. Hai chân dài chắc khỏe, đùi to. Hai tai lớn hình tam giác, dựng đứng, sắc
trắng. Sáu tháng tuổi đạt 90 – 100 kg, khi trƣởng thành nặng khoảng 250 – 300 kg.
Mỗi năm đẻ từ 1.8 – 2.2 lứa, mỗi lứa khoảng 8 – 9 con, trọng lƣợng heo con sơ sinh
1.8 kg / con. Giống Yorkshire có đặc điểm nuôi con giỏi, là giống đứng đầu trong tổng
đàn ngoại nhập ở nƣớc ta.
2.2 Prolactin
2.2.1 Nguồn gốc, cấu tạo
Prolactin còn gọi là LTH (Luteo tropic hormone) . Ở ngƣời và các loài động vật
hƣu nhủ prolactin đƣợc tổng hợp và phân tiết ở tế bào ƣa acid của tuyến não thùy. Nó
là một polypeptide gồm mƣời chín cấu tử amino acid và trọng lƣợng phân tử khoảng
23000 Da.
2.2.2 Tác dụng của prolactin
Prolactin có tác động sinh học lên sự phát triển của tuyến vú, sự tiết sữa của ngƣời

và thú cái trong thời gian mang thai và nuôi con. Trên một số loài động hữu nhũ,
prolactin còn tác động đến hoàng thể kích thích sự phân tiết hormone progesterone.
Prolactin đƣợc phân tiết từ các tế bào ƣa acid của tuyến não thùy theo máu di
chuyển đến cơ quan đích, ở đây xảy ra sự tiếp nhận prolactin. Sự tiếp nhận này đƣợc
quyết định bởi các thụ thể có tại các cơ quan đích. Bình thƣờng bất cứ heo mẹ, heo bố
hay heo con nào cũng phân tiết đƣợc prolactin, nhƣng chỉ những cá thể có thụ thể tiếp
nhận prolactin (prolactin receptor) thì mới chịu ảnh hƣởng của hormone này. Sự xuất
hiện của thụ thể prolactin chịu kiểm soát chủ yếu bởi yếu tố di truyền (prolactin
receptor gene).


4
2.2.3 Cơ chế tác động của prolactin
Prolactin khi đến tế bào mục tiêu sẽ kết hợp với các protein chuyên biệt (receptor)
tạo thành phức hợp hormone – receptor ở màng tế bào, phức hợp này hoạt hóa enzyme
adenylcyclase định vị ở màng tế bào xúc tác phản ứng thành lập c.AMP từ ATP.
c.AMP trực tiếp gây hiệu ứng sinh học trong tế bào chất và trong nhân, nhƣ tác động
vào đơn vị ức chế trong protein kinase, giúp cho protein kinase hoạt động và xúc tác
phản ứng phosphoryl hóa các cấu tử serine trong các protein ở tế bào mục tiêu dẫn
đến hoạt hóa enzyme, tăng phân tiết tế bào, tăng vận chuyển cơ chất qua màng và cả
hoạt tác gen.

Nguồn gốc: Hình scan từ Giáo trình sinh hoá học - Phần I: Sinh hoá học tĩnh, NXB
Đại học quốc gia TP. HCM của PGS. TS Nguyễn Phƣớc Nhuận
Hình 2.1: Cơ chế tác động của hormone tại tế bào mục tiêu



Hoạt tác gen
Kích hoạt các
enzyme,
hormone


5
2.2.4 Gen thụ thể prolactin
Cùng với sự phát hiện ra gen thụ thể estrogen, gen halothan...Ngƣời ta cũng đã phát
hiện ra gen thụ thể prolactin. Gen này đƣợc nghiên cứu nhƣ gen dự tuyển trong công
tác chọn giống ở các dòng heo: Large White, Landrace, Duroc...Theo các nghiên cứu
của Vincent (1998), Linville, Drogemuler (2001), Hamann (2001) nếu trên các cá thể
heo có sự xuất hiện của gen thụ thể prolactin thì số con trên ổ đẻ nhiều, tỉ lệ sống sót
của các heo con cao. Đặc biệt, trọng lƣợng heo con sinh ra vẫn duy trì ở mức bình
thƣờng không có chênh lệch đáng kể so với các ổ đẻ có số con ít. Ngoài ra, các nhà
nghiên cứu cũng thấy sự tăng khối lƣợng trên ngày của các cá thể heo con có sự hiện
diện của gen thụ thể prolactin cao hơn các cá thể không có sự hiện diện của gen này.
Các nghiên cứu về gen thụ thể prolactin chỉ dừng lại ở mức xác định mối tƣơng

quan giữa sự hiện diện của gen thụ thể prolactin với sự tăng năng suất sinh sản và tăng
trọng của cơ thể heo chứ không xác định rõ cơ chế của gen này lên sự tăng năng suất
sinh sản hay tăng trọng cơ thể. Có nhiều giả thuyết cho rằng sự xuất hiện của gen này
kèm theo xuất hiện của một gen khác kiểm soát các tính trạng về năng suất của heo
(Vincent, 1998).
Ở heo gen PRLR đƣợc định vị trên nhiễm sắc thể 16. Gen này liên kết khá chặt chẽ
với ba marker nằm tại các locus: S0006 (LOD – 10,29), GHR (6,35), S0077 (3,23). Để
xác định đƣợc tính đa hình của gen PRLR, Vincent và cộng sự đã dùng kỹ thuật PCR –
RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism). Trƣớc
ông dùng kỹ thuật PCR để phân lập một đoạn DNA của gen PRLR, sau đó dùng
enzyme AluI phân cắt đoạn DNA này. Với cách này thì ông đã xác định đƣợc kích
thƣớc của các băng cắt DNA nhƣ sau: 124, 110, 90, 79 và 76 bp. Trong đó, băng 110
và 90 bp đƣợc xác định là đa hình. Những sản phẩm PCR nào có hiện diện băng 90 bp
đƣợc xác định là alen A, băng 110 bp đƣợc xác định là alen B. Gen PRLR có tính đa
hình rất cao. Ở các dòng heo khác nhau khi xử lý enzyme AluI gen PRLR thì các đoạn
cắt cũng có nhiều kích thƣớc khác nhau. Hai alen A và B tạo thành các kiểu gen AA,
AB, BB. Trong ba kiểu gen này thì trên các giống heo Large White, Meishan,
Landrace kiểu gen AA có năng suất sinh sản cao hơn, kích thƣớc heo con sinh ra đồng
đều và số con trên ổ đẻ nhiều hơn kiểu gen AB, BB.



6
Bảng 2.1: Các thông số của gen thụ thể prolactin lấy từ genbank
Locus SSU96306
Định danh Gen PRLR
Số truy cập U96306
Sinh vật Ngƣời và các động vật hữu nhủ
Tác giả Vincent A.L., Wang L., Tuggle C.K., Robic A., Rothschild M.F.
Trình tự 1- agcaggagaa cggcgaccgg ccggagaagg ctggcgcccc tgaaaccagc

aaggaatacg cccaggtgtc ccgggtgatg gataaccaca tcctggtgtt
agtgcaggat ccgcgagctc gaaacgtggc tccgtttgaa gaaccaacca
aggagacccc gccatcccgg ccgcagaatc cagctgcgaa agacctggcc
agcttcacca cggccccggg ccactgcaga cacccgctgg gtgggctgga
ttacctcgat cccgcaggct ttatgcactc ctttcagtga gagcttggtt catgggatga
tgggttacaa ggtggggttt ttttcaggtc gcactacgtg aaatgcactc taccagagaa
agctcgaaaa tggggttaga atgacactac ccagactcac agttcactcc tcttcatgct
ccattttcaa ccacttgcc- 449 bp
2.3 Giới thiệu về DNA (Deoxyribonucleotide acid)
Acid nucleic là vật chất mang thông tin di truyền của cơ thể sống. Acid nucleic
đƣợc cấu tạo từ các đơn phân (monomer) là các nucleotide. Mỗi nucleotide gồm có ba
thành phần: nhóm phosphate, đƣờng pentose, và nhóm bazơ hữu cơ. Bazơ hữu cơ gồm
có hai nhóm: nhóm bazơ purin và nhóm bazơ pyrimidine. Nhóm purin gồm có:
adenine (A) và guanine (G). Nhóm pyrimydine gồm có: thymine (T) và cytosine (C).
Bốn loại bazơ hữu cơ này kết hợp với nhóm phosphate và đƣờng pentose tạo thành
bốn loại nucleotide, ngƣời ta viết tắt chúng là A, T, G, C. Các nucleotide này nối với
nhau thành một chuỗi dài hay mạch DNA.
Phân tử DNA có cấu trúc xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi
nucleotide. Hai mạch đơn liên kết với nhau bằng liên kết hidro, liên kết đƣợc hình
thành giữa các bazơ bổ sung A với T và G với C. A liên kết với T bằng hai liên kết
hidro, G liên kết với C bằng ba liên kết hidro. Mỗi mạch đơn có một đầu OH tự do và
một gốc phosphate tự do. Ngƣời ta qui ƣớc là đầu chứa gốc phosphate tự do là đầu 5’,
đầu chứa gốc OH tự do là đầu 3’.


7
Một đặc điểm có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu phân tử DNA đó là khả năng
hồi tính và biến tính của DNA:
Sự biến tính là hiện tƣợng hai mạch DNA tách rời nhau do đứt gãy các liên
kết hidro bởi nhiều yếu tố vật lý và hoá học nhƣ: nhiệt độ, dung dịch kiềm,

formaline, urea…Hiện tƣợng biến tính do nhiệt độ xảy ra khi nhiệt độ nóng
chảy (melting temperature, T
m
) của DNA thấp hơn nhiệt độ của môi trƣờng.
T
m
cao hay thấp tuỳ thuộc vào thành phần của DNA. DNA chứa càng nhiều
G, C thì nhiệt độ nóng chảy càng cao do G liên kết với C bằng ba liên kết
hidro tƣơng đối bền vững nên cần nhiều nhiệt lƣợng hơn để phá huỷ liên kết
này.
Hồi tính là hiện tƣợng hai mạch đơn DNA sau khi tách rời ban đầu gắn với
nhau theo nguyên tác bổ sung hình thành nên phân tử DNA mạch kép. Đặc
điểm hồi tính và biến tính của DNA là cơ sở để thực hiện phản ứng PCR
(polymerase chain reaction).
N
N
NH
N
NH
2

N
NH
NH
N
NH
2
O

N

NH
NH
2
O

NH
NH
O
O
CH
3



Hình 2.2: Cấu trúc của các loại bazơ hữu cơ
Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide nhƣ sau:


Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide

OH
O
O
OH
OH
OH
O
P
Bazơ hữu cơ
Adenine

Cytosine

Guanine

Thymine



8
2.3.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA
DNA đƣợc xem là vật chất sống vì nó có khả năng tự nhân đôi. Đặc điểm
cơ bản của sự tái bản này là sự tái bản theo nguyên tắc bán bảo toàn
(semiconservative replication). Khi bắt đầu quá trình sao chép có sự tách rời
của chuỗi xoắn kép DNA tạo thành hai mạch đơn. Mỗi mạch đơn đƣợc dùng
làm khuôn để tổng hợp mạch mới. Kết quả từ một phân tử DNA ban đầu sẽ
tạo ra hai phân tử DNA con giống hệt nhau và giống với DNA mẹ, mỗi phân
tử DNA con đƣợc hình thành từ một mạch mới và một mạch cũ.
Ở mỗi một lần tái bản, có sự tháo xoắn chuỗi DNA mẹ nhờ enzyme
topoisomerase và protein DNA A. Trong quá trình sao chép các chuỗi tách
rời nhau dƣới dạng mạch đơn nhờ enzyme helicase, enzyme này phá vỡ các
liên kết hidro giữa các nucleotide. Nhiều loại helicase cùng họat động đồng
thời, một số gắn lên mạch 3’ – 5’, một số gắn trên mạch 5’ – 3’. Các mạch
tách rời sẽ đƣợc ổn định dƣới dạng mạch đơn nhờ các protein SSB (single
strand binding) gắn lên khắp các mạch đơn làm các mạch này không thể gắn
lại với nhau. Sự tái bản đƣợc khởi đầu bằng việc kéo dài một đoạn mồi có
bản chất là RNA (ribonucleotide acid) đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn nhờ
các DNA polymerase. Sự thêm các nucleotide luôn theo hƣớng 5’– 3’. Tức
là trên hai mạch DNA có một mạch sự tái bản diễn ra theo chiều thuận và
mạch còn lại sự tái bản diễn ra theo chiều nghịch. Trên mạch khuôn 3’- 5’

sự tái bản theo chiều 5’- 3’ cùng hƣớng với chiều tháo xoắn sự tái bản trên
mạch này diễn ra một cách liên tục và đƣợc gọi là sợi tiến nhanh. Trên mạch
còn lại sự tái bản diễn ra ngƣợc với chiều tháo xoắn. Sự tổng hợp mạch mới
ở đây không diễn ra liên tục mà dƣới dạng những đoạn ngắn gọi là những
đoạn Okazaki.
Sự tái bản bán bảo thủ có vai trò rất quan trọng vì qua đó khi tế bào phân
chia có thể truyền sang tế bào con bản sao nguyên vẹn toàn bộ cơ cấu di
truyền của nó. Trong sự phân bào bình thƣờng thì DNA đƣợc nhân đôi khi
các nhiễm sắc thể tách rời nhau.



9
Bảng 2.2: Các yếu tố cần thiết cho sự tự nhân đôi của DNA
STT Tên Chức năng
1

DNA mẹ Làm khuôn cho sự tổng hợp
2

Nucleotide: A, T, G, C Nguyên liệu cho sự tổng hợp
3

Mg
2+
Cần thiết cho hoạt động của các enzyme DNA
polymease
4
Ezyme: DNA polymerase,
topoisomerase, helicase,

RNA primase, protein
DNA A…
Tháo xoắn, tách các mạch đơn, cố định mạch
đơn, tổng hợp mồi và kéo dài chuỗi.


Hình 2.4: Sự nhân bản DNA

Mạch đƣợc tổng hợp
liên tục
Mạch đƣợc tổng hợp
từ các đoạn Okazaki


10
2.3.2 Gen, allen và sự đa hình của gen
2.3.2.1 Gen
Gen là một đoạn DNA có khả năng kiểm soát một chức năng hoặc một tính trạng
nào đó của cơ thể sống. Đoạn DNA có khả năng sao mã tạo ra mRNA (RNA thông
tin). Từ mRNA thông tin này có thể đƣợc mã hóa tạo ra protein. Protein là đơn vị cấu
tạo nên sự sống, mọi thành phần của cơ thể sống hầu hết đƣợc cấu tạo từ protein nhƣ
các men tiêu hóa, các hormone, các thành phần cấu tạo của tế bào… Có nhiều gen
không tham gia tổng hợp protein nhƣng nó có khả năng ức chế hoạt động của một gen
hay một tổ hợp gen khác. Những loại gen này rất phổ biến ở động vật và ngƣời.
Cấu trúc tổng quát của một gen động vật đƣợc phân chia thành hai vùng nhƣ sau:
vùng mã hoá và vùng điều hoà ở đầu 5’(Lê Đức Trình, 2001; Bùi Trang Việt, 2002).
Vùng mã hoá bao gồm một chuỗi lần lƣợt các exon và intron. Các exon là các vùng
gen mã hoá protein. Theo qui ƣớc ngƣời ta gọi nucleotide thứ nhất nơi khởi sự sao
chép là +1, nucleotide trƣớc đó là -1. Còn các intron là các vùng gen không mã hoá
acid amin. Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm ra rõ chức năng của vùng này trong quá

trình biểu hiện gen.
Vùng điều hoà gồm các enhancer và promotor. Các enhancer là nơi chứa các trình
tự nhận biết chuyên biệt của nhiều yếu tố điều hoà. Các promotor bao gồm các trình tự
từ 6 – 8 nucleotide (đôi khi đến 20 nucleotide), nhận biết một cách gián tiếp RNA
polymerase, thƣờng nhất là : TATA box (trình tự giàu T và A, ví dụ TATAAA), GC
box, CCAAT box.
Sự biểu hiện của gen hay sự điều hoà hoạt động của gen
Sự biểu hiện gen ở động vật rất phức tạp. Sự biểu hiện này bị tác động bởi các yếu
tố điều hoà có bản chất là protein, steroid, DNA. Trên cấu trúc của gen, các enhancer
có các vùng trình tự nhận biết đƣợc các yếu tố này và có thể dẫn đến hiện tƣợng sao
chép DNA tạo ra mRNA. Nếu xảy ra sự sao chép thì mRNA tạo ra ban đầu sẽ trải qua
quá trình trƣởng thành. Cả exon và intron đều đƣợc sao chép thành mRNA, nhƣng
trƣớc khi rời khỏi nhân, các đoạn tƣơng ứng với intron bị loại đi, các đoạn exon còn lại
nối lại với nhau tạo thành mRNA có trình tự liên tục mã hoá acid amin.



11
Sự liên kết giữa gen và marker
Marker là một đoạn DNA liên kết với gen (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000).
Khi phát ra những đoạn DNA mới kiểm soát một chức năng nào đó của cơ thể sống,
ngƣời ta cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa marker và gen định vị trên nhiễm sắc
thể nào đó. Điều này hoàn toàn có thể thực hiện đƣợc nhờ công trình có tính lịch sử
của Morgan về liên kết gen và khoảng cách di truyền (tính bằng centi Morgan, viết tắt
là cM). Bản đồ di truyền của ruồi giấm đƣợc phát hiện rất sớm vào năm 1925. Những
tính trạng di truyền chung với nhau đƣợc xếp chung vào một nhóm liên kết gen, trên
cùng một nhiễm sắc thể. Những tính trạng này đƣợc xác định trên nhiễm sắc thể tùy
mức độ liên kết của nó. Sự sắp xếp độc lập của các nhiễm sắc thể giúp cho việc xác
định vị trí các locus trong các nhóm liên kết gen. Sự xuất hiện của hiện tƣợng quấn
chéo (crossing over) trong gián phân giảm nhiễm giúp cho việc xác định thứ tự các

locus trong nhiễm sắc thể. Khoảng cách di truyền đƣợc đo bằng tần suất tái tổ hợp gen.
Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ liên kết với một tính trạng hình thái nào đó, mà
ngƣời ta có thể đo đếm đƣợc – gen đó có thể xem là marker gen.
Việc lập bản đồ gen và việc chọn lọc marker hình thái nhƣ vậy tốn rất nhiều thời
gian, thậm chí hàng chục năm trời. Số lƣợng marker thu đƣợc theo kiểu chọn lọc này
rất ít và chỉ có ở qui mô hình thái. Do vậy ngƣời ta đã sử dụng marker isozyme đã làm
cho vấn đề thay đổi theo chiều hƣớng tốt hơn, nhƣng số lƣợng marker thu đƣợc cũng
rất ít không thỏa mãn cho nhu cầu nghiên cứu. Trong tình hình này thì DNA marker
đƣợc đề xuất (Tankley và ctv, 1980). Về căn bản thì bất cứ chuỗi mã DNA nào đƣợc
dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể xem nhƣ
một DNA marker. Nhƣng nó phải đảm bảo về tính ổn định, sự xuất hiện của nó phải
luôn luôn có sự xuất hiện của gen quan tâm.
2.3.2.2 Allen và sự đa hình của gen
Gregor Mendel (1856) định nghĩa allen nhƣ sau: “ Allen là các dạng khác nhau của
một gen cùng qui định một tính trạng”, các đối tƣợng đƣợc ông khảo sát ở đây là đậu
Hòa Lan. Từ năm 1925 trở đi, sau khi Morgan thành công trong việc lập bản đồ di
truyền của ruồi giấm, các khái niệm về nhiễm sắc thể, khoảng cách di truyền
và locus đƣợc hình thành thì allen đƣợc định nghĩa lại nhƣ sau: “ Allen là


12
các dạng khác nhau của cùng một gen định vị trên một locus của cùng một
nhiễm sắc thể cùng qui định một tính trạng nào đó ở cơ thể sinh vật”.
Allen là cơ sở để xác định tính đa hình của gen. Gen có càng nhiều allen
thì tính đa hình càng cao. Mỗi allen đƣợc hình thành từ sự đột biến đoạn mã
di truyền của gen gốc do các yếu tố môi trƣờng sống, các tác nhân vật lý,
hóa học hay các sai sót trong quá trình sao chép. Các đột biến này nếu tạo
thuận lợi cho sự sống sót, sinh sản của cá thể sẽ đƣợc duy trì và lan truyền
trong quần thể. Nhƣ vậy, gen là đơn vị có tính chất đột biến ( Bùi Chí Bữu
và Nguyễn Thị Lang, 1999). Trong tự nhiên hai cá thể cùng một loài mang

cùng một gen chƣa hẳn là có đoạn trình tự chuỗi mã di truyền của gen giống
nhau, giữa những cá thể khác nhau thì luôn xuất hiện đột biến khác nhau
nhƣng hiếm khi biểu hiện thành các đặc điểm hình thái. Tính đa hình của
gen trong trƣờng hợp này chỉ đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phân tích
ở mức phân tử.
2.3.3 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ mô động vật
DNA đƣợc chiết tách từ mô và các cơ quan của động thực vật. Ở động vật
DNA đƣợc chiết tách từ da, cơ vân, mô mỡ và từ máu.
Qui trình này cơ bản gồm 3 bƣớc:
Bƣớc 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tiến hành nghiền mô, tế bào
trong dung dịch SDS (sodium dodecyl sulphate) và proteinase (proteinase
K). Hỗn hợp sẽ phá hủy màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi
trƣờng, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong dung dịch chứa
DNA bằng hổn hợp dung dịch phenol và chloroform kết hợp với phƣơng
pháp ly tâm.
Bƣớc 3: Tủa dung dịch acid nucleic, thu nhận acid nucleic dạng cô đặc
trong ethanol hoặc isopropanol.





13
2.3.4 Phƣơng pháp định tính và định lƣợng cho DNA
2.3.4.1 Định lƣợng bằng phƣơng pháp đo OD (optical density)
Phƣơng pháp này không thật chính xác, chỉ ƣớc lƣợng tƣơng đối nồng độ acid
nucleic có trong mẫu. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa vào sự hấp phụ ánh
sáng tử ngoại có bƣớc sóng λ = 260 nm.
Một đơn vị OD tƣơng ứng với nồng độ là:

- 50 μg / ml cho một dung dịch sợi đôi
- 40 μg / ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn
Ví dụ: một OD
260 nm
= 0,9 sẽ tƣơng ứng với:
- Dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi bằng 0,9*50 = 4,5 μg
- Dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA bằng 0,9*40 = 3,6 μg
Tuy nhiên cách tính này chỉ đúng với dung dịch có độ tinh sạch cao. Để kiểm tra
độ tinh sạch của DNA thu đƣợc ngƣời ta đo thêm giá trị OD 280 nm, ở bƣớc sóng này
protein có mức hấp thụ cao nhất. Nhƣng các protein cũng hấp thụ ở bƣớc sóng 260
nm, do đó làm sai giá trị thật của acid nucleic có trong mẫu. Một dung dịch acid
nucleid đƣợc xem là sạch nếu có tỉ số OD
260 nm
/ OD
280 nm
nằm trong khoảng 1,8 – 2.
Nồng độ DNA trong mẫu đƣợc tính bằng công thức sau:
Nồng độ (ng / μl) = OD
260 nm
*62,9 - OD
280 nm
*36
2.3.4.2 Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
Phƣơng pháp điện di là phƣơng pháp cho phép xác định kích thƣớc của các đoạn
DNA. DNA đƣợc cho vào một bản gel agarose và đặt trong điện trƣờng. Do DNA tích
điện âm nên trong môi trƣờng điện trƣờng nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng.
Agarose là một trong các dạng của polysacharide. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose
sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi vài phút. Khi nguội lại những hạt
agarose sẽ kết tụ lại với nhau (gelling). Giữa những hạt nhƣ vật có những lỗ rất nhỏ.
Tùy theo nồng độ của gel mà kích thƣớc của các lỗ nhỏ này khác nhau. Nồng độ gel

càng cao thì kích thƣớc của các lỗ càng nhỏ và ngƣợc lại. Khi DNA đi qua các lỗ nhỏ
này sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo lực trở kháng làm ngăn cản sự
dịch chuyển này. DNA có kích thƣớc càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự di
chuyển càng chậm và ngƣợc lại. Các DNA cùng kích thƣớc sẽ di chuyển về cùng vị trí


14
và tạo thành các băng, các băng này có thể quan sát đƣợc sau khi nhuộm chúng trong
dung dịch ethium bromide và đặt dƣới tia tử ngoại.
2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)
2.4.1 Giới thiệu về phản ứng PCR
Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi
DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzyme DNA polymerase.
Nguyên tắc phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau:
Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94 - 95
o
C
Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc
vào trình tự của primer, thông thƣờng khoảng 40 – 50
o
C.
Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 72
o
C
Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần.



Hình 2.5: Các chu kỳ của phản ứng PCR

2.4.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR
2.4.2.1 Taq polymerase
Taq polymerase là enzyme chính tham gia vào quá trình tổng hợp các
mạch DNA. Enzyme này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch
DNA tạo điều kiện cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq
polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus.
2 4 6 8 1 0
Biến tính
Ủ bắt cặp
Kéo dài
Lặp lại n lần
94–95
o
C
72
o
C
45-56
o
C


15
Enzyme này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA
khoảng 94
o
C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động của Taq polymerase khoảng
70 – 72
o
C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzyme này quá thấp không

đủ lƣợng enzyme xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không mong
muốn.
2.4.2.2 Các nucleotid
dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hổn hợp 4 loại
nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng
hợp mạch DNA mới. Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng
sẽ làm cho phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase.
2.4.2.3 Primer (mồi)
Primer (mồi) là những đoạn oligoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ
sung với trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp
DNA. Chiều dài của mồi thƣờng từ 10 – 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho
quá trình tổng hợp mạch mới. Khi mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq
polymeresa bắt đầu kéo dài chuỗi DNA.
2.4.2.4 Dung dịch đệm
Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg
2+
. Nó rất cần
thiết cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase,
làm tăng nhiệt độ nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl
2
tối ƣu
là 1.5 mM.
Môi trƣờng đệm KCl đã và đang áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất
đệm hữu dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp môi
trƣờng này không hiệu quả nên ngƣời ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg
2+
.
Những đoạn DNA giàu G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium
sulphate làm giảm những sản phẩm đƣợc phát triển một cách không hoàn
toàn trong PCR với Taq . Phƣơng pháp này dùng phát hiện những đoạn gen

có kích thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide.



16
2.4.2.5 DNA khuôn
Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên
cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào,
các vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn
mẫu sử dụng có khuynh hƣớng giảm từ 1 µg xuống khoảng 20 ng nhằm giảm
việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn.
2.4.2.6 Số chu kỳ phản ứng
Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qua 40 chu kỳ. Số chu kỳ
cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì
sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm
hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzyme dùng trong
phản ứng.
2.4.2.7 Nhiệt độ và pH
Những enzyme đƣợc sử dụng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự thay đổi nhiệt độ có
ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì
khoảng nhiệt độ từ 94 – 95
o
C là thích hợp nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt
lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi ngƣời ta sử dụng 72
o
C, đây là nhiệt độ tối
ƣu cho Taq polymerase hoạt động. Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định
nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng
nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56
o

C.
Hầu hết các enzyme, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu có pH = 8. Ở
pH này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng acid các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi
DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng
PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8.
2.4.2.8 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục
Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR chúng ta thƣờng gặp những hiện tƣợng
không mong muốn nhƣ: không có hiện diện sản phẩm PCR, sản phẩm PCR ít, xuất
hiện các băng phụ. Dƣới đây là bảng trình bày các hiện tƣợng không mong muốn xảy
ra khi thực hiện phản ứng PCR và cách khắc phục nó.


17
Bảng 2.3: Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục
1. Có nhiều sản phẩm chuỗi ngắn
không đặc trƣng
Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp
Gia tăng thời gian ủ bắt cặp
Gia tăng thời gian kéo dài chuỗi
Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuỗi lên đến 74 – 78
o
C
Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ
nguyên nồng độ MgCl
2
ở mức 1,5 – 2 nM.
Gia tăng nồng độ MgCl
2
lên 3 – 4,5 mM, nhƣng
giữ nguyên nồng độ dNTP

Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng tap polymerase
2. Có nhiều sản phẩm chuỗi dài
không đặc trƣng
Giảm thời gian ủ bắt cặp
Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp
Giảm thời gian kéo dài
Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68
o
C
Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn
giữ nồng độ MgCl
2
ở mức 1,5 – 2 mM
Gia tăng nồng độ MgCl
2
lên 3 – 4,5 nM, nhƣng
vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP
Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng Taq polymerase


18
3. Không có sản phẩm nào cả Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào
phản ứng
Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với
việc cấp rã đông.
Gia tăng hàm lƣợng mồi

Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu
Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10
o
C
4. Sản phẩm PCR ít Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể
Gia tăng lƣợng mồi
Gia tăng lƣợng DNA khuôn
Gia tăng lƣợng Taq polymerase

2.4.2.9 Ứng dụng của PCR
PCR có nhiều ứng dụng trong ngành sinh học. PCR với cặp primer đƣợc thiết kế
riêng sẽ phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn. Từ đây nó đƣợc ứng dụng trong các
lĩnh vực:
Y khoa: dùng chẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus.
Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây
trồng. Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống. Dùng phát hiện ra
các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo nhƣ việc xác định gen thụ
thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin...
Thực phẩm: Xác định các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn vius có trong mẫu thực
phẩm. Dùng chứng nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay là sản phẩm chuyển
gen…
2.5 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR – RFLP
2.5.1 Kỹ thuật RFLP ( restriction fragment length polymorphism)
Đây là phƣơng pháp so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu bằng
một enzyme giới hạn (restriction endonuclease) nhằm tìm hiểu xem có hay không đột


19
biến điểm (làm mất hay xuất hiện một vị trí giới hạn mới) hoặc có hay không sự thay
đổi một trình tự DNA.

Trƣờng hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số
lƣợng và kích thƣớc thì sẽ có sự giống nhau về các băng DNA. Ngƣợc lại, nếu có xuất
hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự
khác nhau về các băng DNA.
Các bƣớc để tiến hành kỹ thuật RFLP:
Tiến hành phân lập DNA của sinh vật muốn kiểm tra sự đa hình của DNA
Xác định enzyme cắt phù hợp nhất với genome của sinh vật kiểm tra
Tiến hành phân cắt mẫu DNA thu đƣợc với enzyme cắt
Chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose hoặc polyarylamid
Tiến hành lai Southern blot với mẫu dò thích hợp
Xác định kích thƣớc của các đoạn đa hình trên phim sau khi thực hiện
Southern blot và đƣa ra kết luận
Quá trình phân tích RFLP trên nhiễm sắc thể gặp rất nhiều khó khăn. Việc xử lý
enzyme giới hạn của DNA này sẽ tạo ra hàng triệu mảnh DNA có kích thƣớc rất khó
phân biệt. Nếu chạy điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethium bromide thì không
dễ gì phát hiện ra đƣợc sự khác biệt giữa chúng. Kết quả ta nhận đƣợc hình ảnh là một
dải liên tục gồm nhiều vệt đậm. Do đó việc thiết kế probe (mẫu dò) để xác định sự đa
hình trong kỹ thuật Southern blot là vô cùng quan trọng.
2.5.2 Kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction - restriction
fragment length polymorphism)
Nhằm khắc phục hiện tƣợng tạo ra quá nhiều băng DNA khi phân cắt genome bằng
một enzyme giới hạn và phải thiết kế probe thích hợp trong việc phân tích sự đa hình
DNA của kỹ thuật RFLP ngƣời ta đƣa ra kỹ thuật PCR – RFLP. PCR – RFLP là kỹ
thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR trƣớc.
Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzyme thích hợp. Sự khác nhau
của các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethium bromide cho ta biết đƣợc sự
đa hình của đoạn DNA. Nhƣ vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR – RFLP gồm các
giai đoạn sau:

20
Tiến hành phản ứng PCR với cặp primer thích hợp để phân lập
đoạn DNA cần phân tích sự đa hình.
Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzyme cắt thích hợp.
Chạy điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đƣa ra
kết luận.
2.6 Các enzyme giới hạn
Các enzyme giới hạn đƣợc khám phá cuối năm 1960, có khả năng cắt
DNA ở những vị trí rất là chính xác, nó đóng vai trò rất quan trọng trong
phân tích gen. Ngƣời ta phân ra làm ba loại enzyme:
Loại 1: Khi enzyme nhận biết đƣợc trình tự , nó sẽ di chuyển một đoạn
khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng khoảng vài chục nucleotide.
Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự ngay tại vị trí đó.
Loại 3: Enzyme nhận biết trình tự cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20
nucleotide.
Loại 2 là nhóm duy nhất đƣợc sử dụng trong công nghệ sinh học phân tử.
Mỗi enzyme nhận biết một trình tự cắt từ 4 – 6 nucleotide. Có hai kiểu cắt
chính của enzyme là cắt theo đầu dính và cắt theo đầu bằng:
Kiểu cắt đầu bằng:



Kiểu cắt đầu dính:



…TGG CCA…
…ACC GGT…

…C GGCCG…

…GCCGG C…
Enzyme Eco52I
…AG CT…
…TC GA…
Enzyme AluI
Enzyme BalI


21
PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT
3.1 Thời gian, địa điểm
3.1.1 Thời gian
Khóa luận đƣợc tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15 tháng 08
năm 2005.
3.1.2 Địa điểm
Lấy mẫu máu, da tai tại trại giống Đông Á, huyện Dĩ An tỉnh Bình Dƣơng.
Tiến hành xét nghiệm mẫu để phát hiện gen thụ thể prolactin tại Trung Tâm
Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh.
3.2 Đối tƣợng khảo sát
Gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire ở trại giống.
3.3 Nội dung thực hiện
Chọn quy trình ly trích DNA thích hợp từ mẫu máu, da tai.
Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu đƣợc lấy từ trại giống.
Phân tích kiểu gen của các heo giống
Xác định tần số xuất hiện của kiểu gen thụ thể prolactin
3.4 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm
Vật liệu
Vật liệu dùng trong thí nghiệm là mẫu máu và mẫu da tai đƣợc lấy từ các heo nái

tại trại giống Đông Á.
Dụng cụ
Các dụng cụ để tiến hành thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, eppendorf các loại,
pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đƣng hóa chất, đầu lọc hóa chất, thùng đựng nƣớc đá,
bình tam giác.


22
Các thiết bị, máy móc
 Tủ cấy vô trùng
 Bồn ổn nhiệt
 Máy li tâm
 Tủ định ôn
 Tủ lạnh
 Máy đo OD
 Tủ sấy dụng cụ
 Thiết bị điện di
 Máy chụp gel
 Lò vi sóng
3.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.2.1 Thu thập mẫu
Các mẫu đƣợc lấy ngẫu nhiên trên các heo nái giống Yorkshire. Các loại mẫu
lấy bao gồm:
Lấy máu từ tỉnh mạch tai
Lấy mẫu da tai
Mỗi con heo thì lấy đồng thời mẫu máu và mẫu da tai.
Cách thu thập và bảo quản mẫu
Mẫu máu: lấy khoảng 1-1.5 ml máu ở mỗi cá thể heo. Máu đƣợc cho vô ống
nghiệm vô trùng chứa sẵn 4mg Na
2

ETDA.
Mẫu da: lấy khoảng 20 g mẫu da tai cho vào túi vô trùng.
Tất cả các loại mẫu lấy đƣợc mang về Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa
Sinh bảo quản. Mẫu da đƣợc bảo quản ở - 70
o
C, mẫu máu đƣợc bảo quản ở - 20
o
C.
khi nào dùng thì tiến hành rã đông và phân tích.







23
3.4.2.2 Ly trích DNA
Ly trích DNA từ mẫu máu (dựa theo qui trình ly trích DNA từ máu
của Roe và ctv, 1998)
1. Rã đông hoàn toàn mẫu máu, hút 500 l máu vào eppendorf 1.5 ml sau đó thêm
400 l TE 1X, trộn đều, ly tâm 12000 vòng / phút trong 1 phút ở 10
o
C, lấy cặn.
2. Cho vào 500 l TE 1X, vortex cho tan cặn, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 1 phút, ở
10
o
C, lấy cặn.
Lặp lại bƣớc này cho đến khi phần cặn trở nên trắng.
3. Cho vào 200 l natri acetate 0.2 M, vortex trong 10 giây; sau đó thêm 15 µl SDS

10 %; 3 µl proteinase K (20 mg / ml), ủ hỗn hợp gần 1 giờ trong tủ ấm ở 55
o
C.
4. Cho vào 60 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex nhẹ,
ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10
o
C.
5. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1.5 ml mới, sau đó cho vào 500 l
ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ - 20
o
C trong 2 giờ.
6. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10
o
C, bỏ phần nổi lấy phần cặn, làm ráo.
7. Cho vào 100 l TE 1X, vortex, ủ 55
o
C trong 15 phút.
8. Cho vào 10 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 250 l ethanol tuyệt đối
lạnh, trộn đều, ủ ở - 20
o
C trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở
10
o
C, bỏ phần nổi, lấy phần cặn.
9. Rửa cặn bằng 500 l ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10
o
C,
lấy cặn.
10. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55
o

C.
11. Hòa tan cặn bằng 100 l TE 1X, ủ 55
o
C qua đêm, vortex cho tan cặn.
Sản phẩm sau khi ly trích đƣợc trữ ở - 20
o
C hoặc sử dụng ngay.
Ly trích DNA từ da (dựa theo quy trình của Saner và ctv, 2000 đƣợc
Lê Thị Thu Phƣơng (2004) điều chỉnh)
1. Cho khoảng 5 mm
3
da vào eppendorf 1.5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu.


24
2. Cho 60 l dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl, 20mM NaCl, 1mM EDTA và 1% SDS,
pH = 8) và 3 l proteinase K (20 mg / ml). Ủ hổn hợp ở 55
o
C trong 1 giờ.
3. Cho vào 375 l natri acetate 0,2 M, vortex trong 10 giây.
4. Cho vào 200 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex
nhẹ, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10
o
C.
5. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1,5 ml mới, sau đó cho thêm 1 ml
ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20
o
C trong 2 giờ.
6. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10
o

C, lấy cặn, làm ráo.
7. Cho vào 180 l TE 1X, vortex, ủ ở 55
o
C trong 15 phút.
8. Cho vào 20 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 500 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn
đều , ủ ở - 20
o
C trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10
o
C, bỏ phần nổi, lấy
phần cặn.
9. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10
o
C, lấy
cặn.
10. Làm khô cặn trong tủ ấm 55
o
C
11. Hòa tan cặn bằng 200 l TE 1X, ủ 55
o
C qua đêm, vortex cho tan cặn.
Sản phẩm sau khi ly trích đƣợc trữ ở - 20
o
C hoặc sử dụng ngay.
3.4.2.3 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Tiến hành đo sản phẩm DNA ly trích bằng quang phổ kế ở bƣớc sóng 260 – 280 nm.
Nồng độ DNA đƣợc tính bằng công thức:
Nồng độ (ng / μl) = OD
260 nm
*62,9 - OD

280 nm
*36
DNA đƣợc xem là tinh sạch khi tỉ số mật độ quang ở bƣớc sóng 260 – 280 nm nằm
trong khoảng 1,8 – 2.
3.4.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen
PRLR
3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn
Xây dựng qui trình phản ứng PCR
o Xác định nhiệt độ và thời gian phản ứng PCR


25
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện bởi máy luân nhiệt (Thermal cycler version
2.11.32) trên mẫu máu và mẫu da sau khi ly trích với cặp primer:
Forward primer: 5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG- 3’
Reverse primer: 5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA- 3’
Hai primer F và R có nhiệt độ bắt cặp khác nhau chênh lệch nhau khoảng
4
o
C. Vincent (1998) đã đƣa ra khoảng nhiệt độ trung bình giữa hai nhiệt độ này
để thực hiện phản ứng PCR. Với các điều kiện máy móc thiết bị ở phòng thí
nghiệm của nƣớc ta khác với điều kiện tại nơi Vincent tiến hành nên chúng tôi
tiến hành 2 qui trình phản ứng PCR theo hai nhiệt độ bắt cặp khác nhau (Bảng
3.1)
Bảng 3.1: Nhiệt độ và thời gian của 2 qui trình phản ứng PCR
Qui trình 1 Qui trình 2
Bƣớc Nhiệt độ (
o
C) Thời gian (giây) Nhiệt độ (
o

C) Thời gian (giây)
1
2
3
4
5
93
93
60
72
72
180
30
60
60
3
93
93
62
72
72
180
30
60
60
3
Từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại 35 lần
 Ghi chú:
 Qui trình 1 là qui trình do A.L. Vincent (1998) đề xuất trong
việc phát hiện gen PRLR (qui trình 2 trang 26)

 Qui trình 2 là qui trình thí nghiệm với các điều kiện máy móc
thiết bị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trƣờng
đại học Nông Lâm TP. HCM
o Xác định nồng độ primer tham gia phản ứng PCR