Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 1 pdf

1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt Vấn Đề
Cách đây hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đúng khi nhận thấy việc
sử dụng DNA tái tổ hợp nhƣ là một công cụ hữu hiệu trong việc nâng cao năng suất
cây trồng và chất lƣợng lƣơng thực, thực phẩm đồng thời vẫn thúc đẩy đƣợc một nền
nông nghiệp bền vững. Tiếp theo những nhận định này là hàng loạt những đột phá
trong nghiên cứu khoa học về các phƣơng pháp chuyển gen, trong việc phát hiện và
bảo tồn những gen quý.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn
lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề
này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt đông của gen, sự biểu hiện
ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận
đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên
cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta
quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không
thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục tiêu trên bộ
gen.
Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả
năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng
bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng
cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp
sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế
bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ
thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc
tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng
tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các
thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục

đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu
nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu.
Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về
kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành thực hiện


2
đề tài “ Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly
DH5α” trong khoá luận tốt nghiệp của mình.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Thiết lập quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescipt và chuyển
đƣợc plasmid tái tổ hợp này vào tế bào ký chủ Ecoly DH5α.
1.3 Nội dung thực hiện
1.3.1 Phần 1
Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD
600nm
và mật số tế bào vi
khuẩn dựa trên sự tƣơng quan của số tế bào theo thời gian nuôi cấy kết hợp với tƣơng
quan của giá trị OD
600nm
theo thời gian nuôi cấy.
Thiết lập quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất.
Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn
E.coly DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt.
Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp, kết
hợp với phản ứng cắt enzym giới hạn để kiểm tra.
1.3.2 Phần 2
Chuẩn bị đoạn DNA để chèn.
Cắt và tinh sạch vector.
Phản ứng sửa chữa sai sót trên đoạn DNA chèn, nhằm tạo ra đoạn DNA có đầu

bằng.
Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn.
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào.
Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillyn, X-gal, IPTG
Kiểm tra lại kết quả biến nạp đoạn gen bằng phản ứng cắt, phản ứng PCR trên
plasmid tách chiết từ thể biến nạp.









3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU

2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn
2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp
Biến nạp là hiện tƣợng tiếp nhận DNA từ bên ngoài vào tế bào vi khuẩn. Hiện
tƣợng biến nạp đƣợc chứng minh lần đầu tiên trên vi khuẩn Streptococcus pneumoniae
do Fred Griffiths, năm 1928, sau đó đƣợc kiểm chứng lại bởi Avery và cộng sự năm
1944 (viện Rocketfeller). Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng có trạng thái
khả nạp tự nhiên, chúng có khả năng hấp thu DNA tự nhiên có sẵn ở môi trƣờng sống.
Nguồn DNA này có đƣợc từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy. Kết quả thu
đƣợc là vi khuẩn thể hiện một hoặc vài tính trạng mới, tính trạng này ổn định và có
khả năng di truyền.
Từ các nghiên cứu của Griffiths và Avery đã chỉ ra rằng tế bào vi khuẩn phải ở
trạng thái sinh lý đặc biệt mới có khả năng hấp thu DNA, đó là “trạng thái khả nạp”.

Trạng thái khả nạp xuất hiện tự nhiên ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất
dinh dƣỡng và oxy trong môi trƣờng sống của chúng giảm xuống thấp. Trong thực tế
nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào vi khuẩn để chúng có khả năng hấp
thu DNA.
2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen
2.1.2.1 Vai trò
Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích
nghi với môi trƣờng sống.
Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật.
2.1.2.2 Ứng dụng
Biến nạp DNA vào vi khuẩn còn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Từ rất
lâu, vi sinh vật đã đƣợc xem và sử dụng nhƣ nhà máy sinh học (lyving factories) tạo ra
các sản phẩm sinh học phục vụ nhu cầu con ngƣời, ví dụ kháng sinh Penicillyn đƣợc
chiết xuất từ nấm Penicillyum và Streptomycin tạo ra từ vi khuẩn Streptomyces
griseus. Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi
khuẩn và ở đó một lƣợng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ đƣợc tạo ra, sau đó kết
hợp với các phƣơng pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con


4
ngƣời. Nhiều loại vaccine dùng trong y học và thú y, nhiều giống cây trồng chứa gen
kháng bệnh đã đƣợc tạo ra thay thế cho những phƣơng pháp cổ điển.
Biến nạp gen vào vi khuẩn còn giúp thực hiên những nghiên cứu khác nhƣ đọc
trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản sự ổn định của đọan gen đƣợc dễ
dàng.
2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tƣợng biến nạp
Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần mà
DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ.
Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức
tối thiểu ảnh hƣởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu trúc

cũng nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành các
kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc với
màng và nhận đƣợc sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào.
Hệ thống vận chuyển này đƣợc hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một số
protein màng. Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG của
màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó chúng
đƣợc hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu
trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA. ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào.
ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào
(Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998).
ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC để
đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào. Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi
bám vào đầu Carboxyl của ComEA và đƣợc phân ra thành những đoạn dƣới tác động
của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới đƣợc cắt ra
này đƣợc đƣa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào.
Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ
DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng nhƣ các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA,
addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kých hoạt sự phiên mã.
ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã. ComK đƣợc điều chỉnh chính xác sự biểu
hiện của nó. Sự biểu hiện của ComK đƣợc quy định bởi một mạng lƣới phức tạp bao
gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB. Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998,
Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự


5
ngắn giàu A/T, đƣợc sắp xếp trong một khung đọc đặc trƣng và lynh động dọc theo sợi
xoắn DNA. Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB
promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T
AAAAN
5

TTTT.
ComK đƣợc điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, đƣợc hoạt hoá dƣơng
bởi AbrB, sinR, DegU. CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP
nội bào nhƣ là một chỉ thị về dinh dƣỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu phare
ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử. Từ đó, cho phép tế bào
thích nghi với những giới hạn về dinh dƣỡng. DegU giúp cho ComK bám chặt hơn vào
ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng độ ComK
thấp.
2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly
2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo.
Biến nạp nhân tạo là việc đƣa một đoạn DNA vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số
lƣợng bản sao, phục vụ cho mục đích nghiên cứu khác.
Trong phòng thí nghiệm, nhằm mục đích tăng cƣờng khả năng biến nạp, ngƣời ta
thƣờng xử lý tế bào chủ bằng các phƣơng pháp hóa học hay vật lý. Tế bào chủ sau khi
đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp trên gọi là tế bào khả nạp. Tế bào E.coly là một tế
bào chủ đƣợc sử dụng rộng rãi vì cấu trúc di truyền của nó tƣơng đối đơn giản, thông
tin di truyền đã đƣợc biết tƣờng tận nên dễ dàng phát hiện tế bào có mang gen lạ.
E.coly là một vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 2,5µm, có roi (flagella) và
bộ gen gồm 4639221 cặp base mã hoá cho ít nhất 4000 gen. Giống nhƣ tất cả các loài
vi khuẩn gram âm khác E.coly không có màng nhân và nhiễm sắc thể là một phân tử
sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí khởi đầu sao chép.
Các tế bào E.coly có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid DNA và chọn lọc các DNA
plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay các phức hợp màu với X-gal.
2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly
Trong trƣờng hợp có glucose, E.coly tăng trƣởng nhanh chóng. Nếu thay glucose
bằng lactose (β-galactisido-glucose), E.coly ngừng tăng trƣởng và hồi phục sau đó nhờ
tổng hợp đƣợc 3 enzym
Permerase kých thích sự thấm lactose
Acetylase (vai trò chƣa rõ)

6
Β-galactosidase xúc tác sự thuỷ giải lactose thành galactose và glucose
Ba enzym này chỉ đƣợc tổng hợp khi cần để phóng thích glucose từ lactose; chúng
đƣợc cảm ứng bởi lactose. Jacobs và Monod (1961) giải thích sự cảm ứng này qua mô
hình hoạt động của operon Lac (lactose operon). Operon Lac là đoạn DNA chứa:
Ba gen cấu trúc lacZ (mã hoá β- galactosidase), lacY (mã hoá permerase) và lacA
(mã hoá acetylase). Một trình tự nucleotide gọi là promoter (vùng khởi động: P), đánh
dấu điểm khởi đầu sao chép của cả 3 gen. Một trình tự nucleotide gọi là operator (vùng
hoạt động: O) nằm giữa promoter và các gen mã hoá enzym. Operator quyết địmh
RNA polymerase không lyên kết hay lyên kết với promoter và di chuyển dọc theo các
gen (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002).

Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly.
Trích dẫn từ Bài giảng sinh học phân tử, Bùi Trang Việt, 2002.

Ngƣời ta gọi một nhóm gen với các chức năng lyên hệ cùng với promoter và
operator là operon. Operon chỉ có ở procaryote; sự tập hợp các gen trong operon giúp
các gen lyên hệ biểu hiện nhanh chóng (do sự thay đổi môi trƣờng), vì chúng đƣợc
kiểm soát chỉ bởi một “nút đóng mở” duy nhất (đó chính là operator). Trƣớc operon
lacZ là gen điều hoà I, gen này mã hoá repressor, tức protein có vai trò kìm hãm sự
biểu hiện gen. Hoạt động của operon Lac đƣợc chứng minh nhƣ sau:
Khi có glucose (và không có lactose), gen điều hoà I hoạt động (I có promoter
riêng) để tạo ra repressor; repressor nhận biết và lyên kết với operator, cản sự lyên kết
gen điều hoà
Gen điều
hoà
Vùng cấu trúc
gen
của lac operon

cấu trúc
gen của
cấu trúc
gen của
cấu trúc
gen của


7
của RNA polynerase và promoter. Khi có lactose (và không có glucose), lactose lyên
kết với repressor và làm biến đổi hình thể của repressor, do đó repressor không lyên
kết với operator: operon Lac mở, RNA polymerase lyên kết với promoter và trƣợt dài
theo các gen của operon; mRNA (mã hoá cho cả 3 enzym) đƣợc tạo thành và đƣợc
dịch mả thành các polypeptide riêng biệt. Với hỗn hợp glucose và lactose, E.coly dùng
glucose trƣớc, sự dùng lactose bị đàn áp: đó là sự “kìm hãm dị hoá”. Khi glucose
giảm, ngƣời ta chứng minh cAMP gia tăng và cố định trên một protein gọi là CAP
(catabolyte gen activator protein) hay CRP (cAMP recepter protein). phức hợp cAMP-
CAP cố định trên promoter và làm tăng khả năng lyên kết của RNA polymerase với
promoter.
Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông
thƣờng E.coly dùng để biến nạp đƣợc cải tiến thành các chủng chủ theo các hƣớng cơ
bản là loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế vì các hệ thống này sẽ can thiệp vào sự sao
chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn khi đó DNA lạ sẽ bị phân giải và thay đổi hoạt
tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích luỹ trong tế bào. Thông thƣờng
ngƣời ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA
-
) là gen mã hóa cho endonuclease I. Việc
mất endonuclease này sẽ làm tăng sản lƣợng plasmid và cải thiện chất lƣợng DNA
chiết tách bằng các phƣơng pháp sinh hoá chuẩn (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002).
2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp

Có hai phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp
2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý
Phƣơng pháp này sử dụng xung điện tác động lên tế bào chủ từ đó gây nên sự thay
đổi trong cấu trúc tế bào và tính thấm ở màng. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là tiến
hành nhanh chóng, tế bào sau xử lý có hiệu suất biến nạp cao.
2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học
Là phƣơng pháp sử dụng hoá chất xử lý tế bào (có thể kết hợp với nhiệt độ).
Phƣơng pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp nhƣng đơn
giản và dễ thực hiện.
Hiện nay để tạo tế bào E.coly khả nạp theo các phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta có
thể tiến hành theo 3 cách khác nhau
Thứ nhất, phƣơng pháp Hanahan cho phép tạo những tế bào E.coly khả nạp có hiệu
quả biến nạp cao (5x10
8
khuẩn lạc/µg plasmid DNA).


8
Thứ hai, phƣơng pháp Inoue dễ lặp lại hơn phƣơng pháp Hanahan và tạo ra các tế
bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 1x10
8
đến 3x10
8
khuẩn lạc/µg plasmid DNA.
Thứ ba, phƣơng pháp Calcium chloride, phƣơng pháp này đƣợc phát triển từ hơn 30
năm qua và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 5x10
6
đến 2x10
7
khuẩn

lạc/µg plasmid DNA. Thông thƣờng, ngƣời ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch
muối lạnh của kim loại hoá trị II nhƣ CaCl
2
, MgCl
2
, RbCl
2
.
Việc biến nạp DNA plasmid vào E.coly đạt hiệu quả cao hơn khi có sự hiện diện
của ion Ca
2+
ở nhiệt độ thấp (0-4
o
C). Ion Ca
2+
có thể gây ra những xáo trộn trên màng
tế bào làm cho DNA xâm nhập tế bào E.coly dễ dàng hơn. Giai đọan sốc nhiệt kế tiếp
để kých thích sự chuyển của phân tử DNA vào trong tế bào, môi trƣờng dƣỡng chất
đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào phục hồi và DNA tiến hành sao mã, dịch mã để
tạo ra các protein tƣơng ứng.
2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp
Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào
chủ. Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có kháng sinh.
Do đó, khi trải E.coly biến nạp lên môi trƣờng chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu
nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trƣởng. Các tế bào
không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trƣởng đƣợc.
Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã đƣợc mở vòng là
một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn. Do vậy,
có những thể biến nạp có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh
nhƣng không mang gen mục tiêu. Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu

đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp. Phổ biến là các phƣơng pháp sau:
Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh
hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation.
Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai (lai khuẩn lạc).
Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc).
Thông thƣờng, để phân tích một dòng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp là khảo sát
plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích.
Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGem và các plasmid có nguồn
gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E.coly chứa những trình tự
điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn