Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α

1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt Vấn Đề
Cách đây hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đúng khi nhận thấy việc
sử dụng DNA tái tổ hợp nhƣ là một công cụ hữu hiệu trong việc nâng cao năng suất
cây trồng và chất lƣợng lƣơng thực, thực phẩm đồng thời vẫn thúc đẩy đƣợc một nền
nông nghiệp bền vững. Tiếp theo những nhận định này là hàng loạt những đột phá
trong nghiên cứu khoa học về các phƣơng pháp chuyển gen, trong việc phát hiện và
bảo tồn những gen quý.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn
lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề
này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt đông của gen, sự biểu hiện
ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận
đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên
cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta
quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không
thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục tiêu trên bộ
gen.
Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả
năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng
bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng
cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp
sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế
bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ
thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc
tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng
tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các
thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục
đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu

nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu.
Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về
kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành thực hiện

2
đề tài “ Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly
DH5α” trong khoá luận tốt nghiệp của mình.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Thiết lập quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescipt và chuyển
đƣợc plasmid tái tổ hợp này vào tế bào ký chủ Ecoly DH5α.
1.3 Nội dung thực hiện
1.3.1 Phần 1
Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD
600nm
và mật số tế bào vi
khuẩn dựa trên sự tƣơng quan của số tế bào theo thời gian nuôi cấy kết hợp với tƣơng
quan của giá trị OD
600nm
theo thời gian nuôi cấy.
Thiết lập quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất.
Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn
E.coly DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt.
Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp, kết
hợp với phản ứng cắt enzym giới hạn để kiểm tra.
1.3.2 Phần 2
Chuẩn bị đoạn DNA để chèn.
Cắt và tinh sạch vector.
Phản ứng sửa chữa sai sót trên đoạn DNA chèn, nhằm tạo ra đoạn DNA có đầu
bằng.
Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn.

Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào.
Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillyn, X-gal, IPTG
Kiểm tra lại kết quả biến nạp đoạn gen bằng phản ứng cắt, phản ứng PCR trên
plasmid tách chiết từ thể biến nạp.








3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU

2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn
2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp
Biến nạp là hiện tƣợng tiếp nhận DNA từ bên ngoài vào tế bào vi khuẩn. Hiện
tƣợng biến nạp đƣợc chứng minh lần đầu tiên trên vi khuẩn Streptococcus pneumoniae
do Fred Griffiths, năm 1928, sau đó đƣợc kiểm chứng lại bởi Avery và cộng sự năm
1944 (viện Rocketfeller). Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng có trạng thái
khả nạp tự nhiên, chúng có khả năng hấp thu DNA tự nhiên có sẵn ở môi trƣờng sống.
Nguồn DNA này có đƣợc từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy. Kết quả thu
đƣợc là vi khuẩn thể hiện một hoặc vài tính trạng mới, tính trạng này ổn định và có
khả năng di truyền.
Từ các nghiên cứu của Griffiths và Avery đã chỉ ra rằng tế bào vi khuẩn phải ở
trạng thái sinh lý đặc biệt mới có khả năng hấp thu DNA, đó là “trạng thái khả nạp”.
Trạng thái khả nạp xuất hiện tự nhiên ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất
dinh dƣỡng và oxy trong môi trƣờng sống của chúng giảm xuống thấp. Trong thực tế
nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào vi khuẩn để chúng có khả năng hấp

thu DNA.
2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen
2.1.2.1 Vai trò
Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích
nghi với môi trƣờng sống.
Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật.
2.1.2.2 Ứng dụng
Biến nạp DNA vào vi khuẩn còn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Từ rất
lâu, vi sinh vật đã đƣợc xem và sử dụng nhƣ nhà máy sinh học (lyving factories) tạo ra
các sản phẩm sinh học phục vụ nhu cầu con ngƣời, ví dụ kháng sinh Penicillyn đƣợc
chiết xuất từ nấm Penicillyum và Streptomycin tạo ra từ vi khuẩn Streptomyces
griseus. Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi
khuẩn và ở đó một lƣợng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ đƣợc tạo ra, sau đó kết
hợp với các phƣơng pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con

4
ngƣời. Nhiều loại vaccine dùng trong y học và thú y, nhiều giống cây trồng chứa gen
kháng bệnh đã đƣợc tạo ra thay thế cho những phƣơng pháp cổ điển.
Biến nạp gen vào vi khuẩn còn giúp thực hiên những nghiên cứu khác nhƣ đọc
trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản sự ổn định của đọan gen đƣợc dễ
dàng.
2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tƣợng biến nạp
Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần mà
DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ.
Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức
tối thiểu ảnh hƣởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu trúc
cũng nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành các
kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc với
màng và nhận đƣợc sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào.
Hệ thống vận chuyển này đƣợc hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một số

protein màng. Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG của
màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó chúng
đƣợc hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu
trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA. ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào.
ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào
(Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998).
ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC để
đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào. Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi
bám vào đầu Carboxyl của ComEA và đƣợc phân ra thành những đoạn dƣới tác động
của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới đƣợc cắt ra
này đƣợc đƣa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào.
Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ
DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng nhƣ các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA,
addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kých hoạt sự phiên mã.
ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã. ComK đƣợc điều chỉnh chính xác sự biểu
hiện của nó. Sự biểu hiện của ComK đƣợc quy định bởi một mạng lƣới phức tạp bao
gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB. Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998,
Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự

5
ngắn giàu A/T, đƣợc sắp xếp trong một khung đọc đặc trƣng và lynh động dọc theo sợi
xoắn DNA. Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB
promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T
AAAAN
5
TTTT.
ComK đƣợc điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, đƣợc hoạt hoá dƣơng
bởi AbrB, sinR, DegU. CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP
nội bào nhƣ là một chỉ thị về dinh dƣỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu phare
ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử. Từ đó, cho phép tế bào

thích nghi với những giới hạn về dinh dƣỡng. DegU giúp cho ComK bám chặt hơn vào
ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng độ ComK
thấp.
2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly
2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo.
Biến nạp nhân tạo là việc đƣa một đoạn DNA vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số
lƣợng bản sao, phục vụ cho mục đích nghiên cứu khác.
Trong phòng thí nghiệm, nhằm mục đích tăng cƣờng khả năng biến nạp, ngƣời ta
thƣờng xử lý tế bào chủ bằng các phƣơng pháp hóa học hay vật lý. Tế bào chủ sau khi
đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp trên gọi là tế bào khả nạp. Tế bào E.coly là một tế
bào chủ đƣợc sử dụng rộng rãi vì cấu trúc di truyền của nó tƣơng đối đơn giản, thông
tin di truyền đã đƣợc biết tƣờng tận nên dễ dàng phát hiện tế bào có mang gen lạ.
E.coly là một vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 2,5µm, có roi (flagella) và
bộ gen gồm 4639221 cặp base mã hoá cho ít nhất 4000 gen. Giống nhƣ tất cả các loài
vi khuẩn gram âm khác E.coly không có màng nhân và nhiễm sắc thể là một phân tử
sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí khởi đầu sao chép.
Các tế bào E.coly có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid DNA và chọn lọc các DNA
plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay các phức hợp màu với X-gal.
2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly
Trong trƣờng hợp có glucose, E.coly tăng trƣởng nhanh chóng. Nếu thay glucose
bằng lactose (β-galactisido-glucose), E.coly ngừng tăng trƣởng và hồi phục sau đó nhờ
tổng hợp đƣợc 3 enzym
Permerase kých thích sự thấm lactose
Acetylase (vai trò chƣa rõ)

6
Β-galactosidase xúc tác sự thuỷ giải lactose thành galactose và glucose
Ba enzym này chỉ đƣợc tổng hợp khi cần để phóng thích glucose từ lactose; chúng
đƣợc cảm ứng bởi lactose. Jacobs và Monod (1961) giải thích sự cảm ứng này qua mô
hình hoạt động của operon Lac (lactose operon). Operon Lac là đoạn DNA chứa:

Ba gen cấu trúc lacZ (mã hoá β- galactosidase), lacY (mã hoá permerase) và lacA
(mã hoá acetylase). Một trình tự nucleotide gọi là promoter (vùng khởi động: P), đánh
dấu điểm khởi đầu sao chép của cả 3 gen. Một trình tự nucleotide gọi là operator (vùng
hoạt động: O) nằm giữa promoter và các gen mã hoá enzym. Operator quyết địmh
RNA polymerase không lyên kết hay lyên kết với promoter và di chuyển dọc theo các
gen (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002).

Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly.
Trích dẫn từ Bài giảng sinh học phân tử, Bùi Trang Việt, 2002.

Ngƣời ta gọi một nhóm gen với các chức năng lyên hệ cùng với promoter và
operator là operon. Operon chỉ có ở procaryote; sự tập hợp các gen trong operon giúp
các gen lyên hệ biểu hiện nhanh chóng (do sự thay đổi môi trƣờng), vì chúng đƣợc
kiểm soát chỉ bởi một “nút đóng mở” duy nhất (đó chính là operator). Trƣớc operon
lacZ là gen điều hoà I, gen này mã hoá repressor, tức protein có vai trò kìm hãm sự
biểu hiện gen. Hoạt động của operon Lac đƣợc chứng minh nhƣ sau:
Khi có glucose (và không có lactose), gen điều hoà I hoạt động (I có promoter
riêng) để tạo ra repressor; repressor nhận biết và lyên kết với operator, cản sự lyên kết
gen điều hoà
Gen điều
hoà
Vùng cấu trúc
gen
của lac operon
cấu trúc
gen của
cấu trúc
gen của
cấu trúc
gen của

7
của RNA polynerase và promoter. Khi có lactose (và không có glucose), lactose lyên
kết với repressor và làm biến đổi hình thể của repressor, do đó repressor không lyên
kết với operator: operon Lac mở, RNA polymerase lyên kết với promoter và trƣợt dài
theo các gen của operon; mRNA (mã hoá cho cả 3 enzym) đƣợc tạo thành và đƣợc
dịch mả thành các polypeptide riêng biệt. Với hỗn hợp glucose và lactose, E.coly dùng
glucose trƣớc, sự dùng lactose bị đàn áp: đó là sự “kìm hãm dị hoá”. Khi glucose
giảm, ngƣời ta chứng minh cAMP gia tăng và cố định trên một protein gọi là CAP
(catabolyte gen activator protein) hay CRP (cAMP recepter protein). phức hợp cAMP-
CAP cố định trên promoter và làm tăng khả năng lyên kết của RNA polymerase với
promoter.
Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông
thƣờng E.coly dùng để biến nạp đƣợc cải tiến thành các chủng chủ theo các hƣớng cơ
bản là loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế vì các hệ thống này sẽ can thiệp vào sự sao
chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn khi đó DNA lạ sẽ bị phân giải và thay đổi hoạt
tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích luỹ trong tế bào. Thông thƣờng
ngƣời ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA
-
) là gen mã hóa cho endonuclease I. Việc
mất endonuclease này sẽ làm tăng sản lƣợng plasmid và cải thiện chất lƣợng DNA
chiết tách bằng các phƣơng pháp sinh hoá chuẩn (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002).
2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp
Có hai phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp
2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý
Phƣơng pháp này sử dụng xung điện tác động lên tế bào chủ từ đó gây nên sự thay
đổi trong cấu trúc tế bào và tính thấm ở màng. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là tiến
hành nhanh chóng, tế bào sau xử lý có hiệu suất biến nạp cao.
2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học
Là phƣơng pháp sử dụng hoá chất xử lý tế bào (có thể kết hợp với nhiệt độ).

Phƣơng pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp nhƣng đơn
giản và dễ thực hiện.
Hiện nay để tạo tế bào E.coly khả nạp theo các phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta có
thể tiến hành theo 3 cách khác nhau
Thứ nhất, phƣơng pháp Hanahan cho phép tạo những tế bào E.coly khả nạp có hiệu
quả biến nạp cao (5x10
8
khuẩn lạc/µg plasmid DNA).

8
Thứ hai, phƣơng pháp Inoue dễ lặp lại hơn phƣơng pháp Hanahan và tạo ra các tế
bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 1x10
8
đến 3x10
8
khuẩn lạc/µg plasmid DNA.
Thứ ba, phƣơng pháp Calcium chloride, phƣơng pháp này đƣợc phát triển từ hơn 30
năm qua và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 5x10
6
đến 2x10
7
khuẩn
lạc/µg plasmid DNA. Thông thƣờng, ngƣời ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch
muối lạnh của kim loại hoá trị II nhƣ CaCl
2
, MgCl
2
, RbCl
2
.

Việc biến nạp DNA plasmid vào E.coly đạt hiệu quả cao hơn khi có sự hiện diện
của ion Ca
2+
ở nhiệt độ thấp (0-4
o
C). Ion Ca
2+
có thể gây ra những xáo trộn trên màng
tế bào làm cho DNA xâm nhập tế bào E.coly dễ dàng hơn. Giai đọan sốc nhiệt kế tiếp
để kých thích sự chuyển của phân tử DNA vào trong tế bào, môi trƣờng dƣỡng chất
đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào phục hồi và DNA tiến hành sao mã, dịch mã để
tạo ra các protein tƣơng ứng.
2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp
Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào
chủ. Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có kháng sinh.
Do đó, khi trải E.coly biến nạp lên môi trƣờng chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu
nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trƣởng. Các tế bào
không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trƣởng đƣợc.
Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã đƣợc mở vòng là
một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn. Do vậy,
có những thể biến nạp có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh
nhƣng không mang gen mục tiêu. Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu
đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp. Phổ biến là các phƣơng pháp sau:
Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh
hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation.
Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai (lai khuẩn lạc).
Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc).
Thông thƣờng, để phân tích một dòng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp là khảo sát
plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích.
Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGem và các plasmid có nguồn

gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E.coly chứa những trình tự
điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn

9
này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo
thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các
vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-
galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-
galactosidase E.coly (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức
năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất
hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal (5-Bromo- 4-
chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi
β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt
nó, bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để
có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kých hoạt là IPTG (đồng phân của
galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kých hoạt
của gen lacZ.
Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm
ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation
không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng.
2.3.5 Chiết tách DNA plasmid
Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng
bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số
lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc
hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn
lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là
công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết
đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là
tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác
nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết.

Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ:
Phƣơng pháp nhiệt độ cao
Phƣơng pháp Lythium
Phƣơng pháp SDS-kiềm


10
2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR
Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi
DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzym DNA polymerase.
Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau:
Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94-95
o
C
Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa Primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào
trình tự của Primer, thông thƣờng khoảng 40 – 50
o
C.
Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 72
o
C
Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần.

Hình 2.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR.

2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR
Taq polymerase
Taq polymerase là enzym chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA.
Enzym này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện

cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập
từ vi khuẩn suối nƣớc nóng thermus aquaticus. Enzym này có tính chịu nhiệt rất cao,
nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94
o
C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động
của Taq polymerase khoảng 70 – 72
o
C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzym này
quá thấp không đủ lƣợng enzym xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không
mong muốn.
2 4 6 8 1 0
Biến tính
Ủ bắt cặp
Kéo dài
Lặp lại n lần
94–95
o
C
72
o
C
45-56
o
C

11
Các nucleotid tự do
dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide
dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên lyệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới.
Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm phát sinh các lỗi sao

chép của Taq polymerase.
Primer (mồi)
Primer (mồi) là những đoạn olygoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với
trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Chiều dài của
mồi thƣờng từ 10 – 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới. Khi
mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq polymerase bắt đầu kéo dài chuỗi DNA.
Dung dịch đệm
Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg
2+
. Nó rất cần thiết cho
quá trình lyên kết các dNTP, xúc tác cho enzym Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ
nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl
2
tối ƣu là 1.5mM.
Môi trƣờng đệm KCl đã và đang đƣợc áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm
hữu dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng này
không hiệu quả nên ngƣời ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg
2+
. Với những đoạn DNA giàu
G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium sulphate nhằm làm giảm những
sản phẩm đƣợc tạo một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq . Phƣơng pháp này
dùng phát hiện những đoạn gen có kých thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide.
DNA khuôn
Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho
thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu
khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn mẫu sử dụng có khuynh
hƣớng giảm từ 1µg xuống khoảng 100ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không
mong muốn.
Số chu kỳ phản ứng
Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qúa 40 chu kỳ. Số chu kỳ

cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì

12
sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm
hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzym dùng trong
phản ứng.
Nhiệt độ và pH
Những enzym đƣợc sử dụng trong phản ứng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Theo Trần
Thị Dân (2000), sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên
biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 95
o
C là thích hợp
nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi
ngƣời ta sử dụng nhiệt độ 72
o
C, đây là nhiệt độ tối ƣu cho Taq polymerase hoạt động.
Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác
định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng
cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56
o
C.
Hầu hết các enzym, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu có pH = 8. Ở pH
này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng axit các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi
DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng
PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8.
Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục
Bảng 2.1 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục
1. Có nhiều
sản phẩm
chuỗi ngắn

không đặc
trƣng
Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp
Gia tăng thời gian ủ bắt cặp
Gia tăng thời gian kéo dài chuỗi
Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuỗi lên đến 74 – 78
o
C
Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ nguyên nồng độ
MgCl
2
ở mức 1,5 – 2 nM.
Gia tăng nồng độ MgCl
2
lên 3 – 4,5 mM, nhƣng giữ nguyên nồng độ
dNTP
Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng tap polymerase

13
2. Có nhiều
sản phẩm
chuỗi dài
không đặc
trƣng
Giảm thời gian ủ bắt cặp
Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp
Giảm thời gian kéo dài
Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68

o
C
Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl
2
ở
mức 1,5 – 2 mM
Gia tăng nồng độ MgCl
2
lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng
độ dNTP
Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng Taq polymerase
3. Không có
sản phẩm nào
cả
Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng
Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông.
Gia tăng hàm lƣợng mồi
Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu
Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10
o
C
4. Sản phẩm
PCR ít
Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể
Gia tăng lƣợng mồi
Gia tăng lƣợng DNA khuôn
Gia tăng lƣợng Taq polymerase

Ứng dụng của PCR
PCR có nhiều ứng dụng trong ngành sinh học. PCR với cặp primer đƣợc thiết kế
riêng sẽ phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn. Từ đây nó đƣợc ứng dụng trong các
lĩnh vực:
Y khoa: dùng chuẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus.
Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây
trồng. Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống. Dùng phát hiện ra
các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo nhƣ việc xác định gen thụ
thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin...

14
Thực phẩm: Xác định các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn hoặc vi rút có trong mẫu thực
phẩm. Sử dụng để xác nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay là sản phẩm chuyển gen.
2.3.7 Điện di DNA
Phƣơng pháp điện di là phƣơng pháp cho phép xác định kých thƣớc của các đoạn
DNA. DNA đƣợc cho vào một bản gel agarose và đặt trong điện trƣờng. Do DNA tích
điện âm nên trong môi trƣờng điện trƣờng nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng.
Agarose là một trong các dạng của polysacharide. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose
sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi vài phút. Khi nguội lại những hạt
agarose sẽ kết tụ lại với nhau (gellyng). Giữa những hạt nhƣ vậy có những lổ rất nhỏ.
Tùy theo nồng độ của gel mà kých thƣớc của các lỗ nhỏ này khác nhau. Nồng độ gel
càng cao thì kých thƣớc của các lổ càng nhỏ và ngƣợc lại. Khi DNA đi qua các lổ nhỏ
này sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo lực trở kháng làm ngăn cản sự
dịch chuyển này. DNA có kých thƣớc càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự
di chuyển càng chậm và ngƣợc lại. Các DNA cùng kých thƣớc sẽ di chuyển về cùng vị
trí và tạo thành các băng, các băng này có thể quan sát đƣợc sau khi nhuộm chúng
trong dung dịch ethium bromide và chiếu dƣới tia tử ngoại.
2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA
Khái niệm về vector
Vector là vật lyệu quan trọng trong các thí nghiệm biến nạp DNA, thí nghiệm gen

cloning. Vector đƣợc chọn phải có khả năng mang một hoặc nhiều gen vào tế bào chủ
và cần có các đặc điểm tiêu chuẩn nhƣ sau:
Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao chép
bộ gen tế bào chủ. Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có
chứa chúng. Các đặc tính này thƣờng đƣợc mã hoá bởi các gen chọn lọc. Mang những
vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym giới hạn. Các vị trí cắt giới hạn này có tác
dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector ban đầu. Có kých thƣớc
càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lƣợng DNA tối đa. Hơn nữa, kých thƣớc
vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, càng đƣợc sao chép nhanh
và hiểu quả. Tồn tại đƣợc trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn
nhất cho tế bào chủ. Các vector biểu hiện cần chứa thêm promoter thích hợp cho việc
biểu hiện gen trong sinh vật chủ.

15
Các dạng vector thƣờng sủ dụng là plasmid và phage (nhiễm sắc thể của virút).
2.4.1 Plasmid

Hình 2.3 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning (Nguồn tài lyệu T.A. Brown, 1997).

Plasmid là phân tử DNA dạng vòng có kých thƣớc phân tử nhỏ, có trong vi khuẩn
và vi sinh vật khác, plasmid có khả năng nhân bản độc lập với chromosome của tế bào
ký chủ. Chúng có khả năng mang một hoặc nhiều gen, thƣờng là gen mã hóa các chất
có ích cho vi khuẩn . Ví dụ, plasmid mang gen Ampicillyn hoặc Chloramphenocol sẽ
giúp vi khuẩn chủ kháng lại và tồn tại trong môi trƣờng có kháng sinh này. Tính kháng
với loại kháng sinh nào đó đƣợc xem nhƣ là một dấu hiệu chọn lọc, hay đặc điểm để
nhận điện quan trọng giúp khẳng định sự hiện diện của gen ngoại lai.
Cấu trúc plasmid bao gồm vùng ori (origin of replycation) giúp quá trình nhân
nhanh về số lƣợng nhƣng không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ.
Những plasmid nhỏ có thể sử dụng DNA của tế bào ký chủ cho việc nhân bản của nó,
nhƣng đối với các plasmid lớn, chúng mang những gen mã hóa chuyên biệt giúp cho

quá trình tái bản của chính nó. Tuy nhiên một vài plasmid có thể gắn vào nhiễm sắc
thể của vi khuẩn vì vậy số lƣợng plasmid đƣợc nhân lên cùng với sự phân chia tế bào
vi khuẩn. Những plasmid hợp nhất gọi là episome thƣờng ổn định qua nhiều chu kì
phân chia tế bào, nhƣng trong một giai đọan nào đó plasmid cũng có thể ở dạng tự do.
Phân loại plasmid đƣợc dựa vào những đặc tính cơ bản mã hóa bởi các gen của nó.
Có 5 loại plasmid đƣợc định tính nhƣ sau:
Loại 1: F plasmid (Fertilyty) chỉ mang tra gen, có khả nạng chuyển vị và tiếp hợp.
Ví dụ F plasmid của E.coly. Loại 2: R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp
Vùng
chèn
DNA

16
chất kháng lại các chất kháng sinh giúp tế bào ký chủ tồn tại trong môi trƣờng sống. Ví
dụ RP4 trong vi khuẩn Pseudomonas. Loại 3: Col plasmid tạo ra colycin gây chết vi
khuẩn khác. Ví dụ ColE1 trong E.coly. Loại 4: Degradative plasmid giúp ký chủ tạo
các chất sinh học có tính chất đặc biệt trong điều kiện nào đó, nhƣ toluen, salycylyc
axit. Ví dụ TOL plasmid trong Pseudomonas putida. Loại 5: Virulence plasmid xác
định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ. Ví dụ Ti plasmid trong Agrobacterium
tumefaciens gây bệnh bƣớu trên cây hai lá mầm.
Trong các thí nghiệm phân lập và biến nạp gen thƣờng sử dụng plasmid có nhiều
tới rất nhiều gen giúp cho plasmid tồn tại và họat động trong những ký chủ thích hợp.
Gen cần thiết gồm gen kháng kháng sinh, giúp cho việc chọn đúng những tế bào mang
plasmid, gen ori giúp cho quá trình lập lại, gen chỉ thị nhằm nhận biết sự tái tổ hợp,
vùng MSC (multiple cloning site, vùng đa vị trí gắn kết) chứa nhiều vị trí đƣợc nhận
biết bởi nhiều loại men cắt khác nhau giúp cho sự chèn nhiều đoạn DNA có cấu trúc
khác nhau, và các gen khác nhƣ promoter (p), gen chỉ thị nhƣ lacZ’, vùng có cấu trúc
bổ sung của primer cho phép thực hiện PCR kiểm tra kết quả.
2.4.2 Phage
Là vật lyệu di truyền của Bacteriophage, loại virus tấn công vi khuẩn. Khi tấn công

DNA của phage đƣợc truyền vào ký chủ và ở đó nó trải qua quá trình nhân lên số
lƣợng, ngƣời ta lợi dụng đặc tính này để thiết kế các vector mang DNA vào tế bào.
Ngoài ra, còn có vector lai giữa plasmid và phage mà ở đó các chức năng của phage
đƣợc biểu hiện và sử dụng theo một cách nào đó, gọi là phasmid. Các vector lai giữa
plasmid và phage đƣợc hoàn thiện cho tới nay và đƣợc sử dụng rộng rãi cho các ứng
dụng nhƣ giải trình tự DNA và sản xuất các mẫu dò để sử dụng trong các nghiên cứu
về lai axit nucleic. Các vector này là những plasmid quan trọng, chúng chứa điểm khởi
đầu sao chép f1 của phage M13, và có thể tiếp nhận các đoạn DNA có kých thƣớc tới
10kb (pEMBL9, pBluescript).
2.5 Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA
Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa chữa
DNA, enzym gắn DNA biến nạp và vector.
2.5.1 Các enzym cắt giới hạn
Khái niệm hiện tƣợng giới hạn: Các thực khuẩn thể xâm nhiễm vào tế bào vi
khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số lƣợng phage tăng lên

17
đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Nhƣng trong một số trƣờng
hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiện tƣợng này
có thể do một trong hai nguyên nhân là DNA phage gắn vào vi khuẩn dƣới dạng không
hoạt động trong một thời gian hay DNA phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn
tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này là các enzym cắt giới hạn. Đây
chính là hiện tƣợng giới hạn.
Khi nghiên cứu DNA phage bằng phƣơng pháp Southern blot, ngƣời ta thấy rằng
DNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kých thƣớc nguyên vẹn trong khi DNA
phage trích từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành những đọan nhỏ hơn kých
thƣớc đã xác định. Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có một số vi
khuẩn bị phân hủy. Các phage do số ít vi khuẩn này phóng thích có khả năng phân hủy
chủng vi khuẩn trƣớc kia còn kháng phage.
Tất cả những hiện tƣợng nêu trên là kết quả của một hệ thống gồm hai enzym: Các

enzym cắt giới hạn cắt DNA phage ở những vị trí chuyên biệt, luôn luôn tạo thành
những đọan có kých thƣớc nhất định và Methylase là enzym chịu trách nhiệm gắn
nhóm methyl vào A hay C ở vị trí cắt của các enzym cắt giới hạn. Khi A hay C đƣợc
methyl hóa, enzym cắt giới hạn không còn nhận biết đƣợc vị trí cắt. DNA vi khuẩn
không bị chính các enzym cắt giới hạn của chúng cắt là nhờ cơ chế này.
Các enzym cắt giới hạn hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote, chƣa có hệ
thống nào tƣơng đƣơng đƣợc phát hiện ở eucaryote.
Khái niện enzym cắt: Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy
giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định. Dựa vào khả năng này
ngƣời ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn: Loại 1: khi enzym nhận biết đƣợc trình
tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và
giải phóng độ khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: enzym nhận biết trình tự và cắt
ngay tại vị trí đó. Loại 3: enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó
khoảng 20 nucleotide. Trong các thí nghiệm ngƣời ta chỉ sử dụng các enzym cắt giới
hạn loại 2
Khái niệm trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự
nocleotide đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm từ 4-8 nucleotide (thƣờng là 4
hay 6). Các RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers. Đối với một

18
số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của
trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác.
Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T
Bgly GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào.
Đặc trƣng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palyndromic,
nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo chiều
5’ 3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch.

Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn
(a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn

(b) DNA của vi khuẩn không đƣôc nhận biết bởi enzym cắt
Các kiểu cắt của RE loại 2:
Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm.
Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại
phải dùng enzym T4 lygase.
HaeIII

5’ GG CC 3’
3’ GG CC 3’

5’ GG CC 3’
3’ CC GG 5’
Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch.
Trong trƣờng hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại, hai phân tử
EcoRI
không cắt
DNA đƣợc
methyl hoá
DNA
đƣợc
methyl
hoá
Enzym cắt
giới hạn
EcoRI
Enzym cắt
giới hạn
EcoRI
DNA
không

đƣợc
methyl
hoá
DNA không
đƣợc methyl
hoá
Phân cắt
Đầu dính

19
DNA có nguồn gốc khác nhau khi đƣợc cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết
hợp thành một thông qua các đầu dính.
EcoRI

5’ G AATT C 3’
3’ C TTAA G 5’

5’ G AATT 3’
3’ C TTAA G 5’
2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA
2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I)
Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn đƣợc tổng hợp, nhờ một enzym sao
chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hƣớng 5’P 3’OH. Các DNA polymerase
tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA đƣợc gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA.
DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để khởi đầu một chuỗi
axit nucleic cần cho vào môi trƣờng phản ứng một mồi axit nucleic.
DNA polymerase I(từ E.coly) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động
enzym: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải) 3’ 5’ và
exonuclease 5’ 3’.
Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn vị

nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’. Do đó, enzym
Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase
5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’.
2.5.2.2 Terminal transferase
Enzym này đƣợc ly trích từ tuyến ức của bê. Terminal transferase xúc tác phản ứng
gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA. Sự gắn này mang tính
ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn
toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng.
Enzym này đƣợc sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho phân tử
DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phƣơng pháp xác định trình tự
nucleic axit theo Maxam và Gilbert.


20
2.5.2.3 Các DNase
Các DNase thƣờng đƣợc cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng
cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp các
olygonucleotide. Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn
2+
hay
Mg
2+
. Khi có Mn
2+
, DNase tác động trên hai sợi DNA gần nhƣ ở cùng một nơi để cho
những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide). Khi có Mg
2+
, DNase tác động trên
mỗi sợi DNA riêng lẻ.
2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá.

Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi
DNA. Ngƣời ta thƣờng khử phosphoril hoá vector vừa đƣợc mở bởi enzym giới hạn để
tránh sự tự đóng lại của vector. Enzym loại này thƣờng đƣợc sử dụng là CIP (Calf
intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng
cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng. Trong phản ứng của enzym này cần
có sự hiện diện của ion Zn
2+
nhƣ là yếu tố hoạt hoá. Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt
enzym bang cách thêm vào một lƣợng nhỏ proteinase K và EDTA, sản phẩm khử
phosphoril đƣợc tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek và cộng
sự, 1973).
2.5.4 Các enzym nối DNA
Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym cắt
giới hạn lyên quan đến sự hình thành lyên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và gốc
hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi lyền kề. Sự hình thành lyên kết này có thể
đƣợc xúc tác bởi hai loại enzym là E.coly DNA lygase hay T4 DNA lygase.
2.5.3.1 E.coly DNA lygase
Enzym đƣợc ly trích từ E.coly xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu sole

5’ ACGG + TAATCGCCA 3’
3’ TGCCATTA GCGGT 5’
E.coly DNA lygase

5’ ACGGTAATCGCCA 3’
3’ TGCCATTAGCGGT 3’


21
2.5.3.2 T4 DNA lygase
Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coly. Enzym này có cùng chức năng với

lygase trích từ E.coly nhƣng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng
nên là lygase đƣợc chuộng nhất trong sinh học phân tử.
2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội
2.6.1 Với plasmid
Enzym hạn chế cắt vector ở vị trí hạn chế hay MSC. Các DNA sợi kép (plasmid
thẳng) với các đầu dính hay bằng đƣợc tạo thành. Đoạn DNA lạ đƣợc cắt ra từ một
phân tử DNA lớn bởi cùng enzym cắt giới hạn (với trƣờng hợp đầu dính) hoặc thu
nhận từ phản ứng PCR. Sau đó, phản ứng nối giữa vector và DNA chèn đƣợc tiến hành
dƣới sự xúc tác của DNA lygase, DNA lygase giúp sự tạo nối đồng hóa trị giữa các
nucleotide cạnh nhau.
2.6.2 Với DNA phage
Khác với DNA plasmid, DNA không đóng vòng, nhƣng ta cũng có thể tạo các ngân
hàng DNA bằng cách dùng các phage làm vector, theo cùng nguyên tắc với sự dùng
plasmid. Các bƣớc tạo DNA tái tổ hợp : Làm phóng thích DNA phage ra khỏi vỏ, làm
cho các đầu tận cùng của đọan DNA insert có khả năng tƣơng hợp với các đầu tận
cùng của DNA phage, và sau đó dùng lygase để nối lyền các đoạn DNA, tái tạo vỏ
phage nhờ chất trích protein từ vỏ phage. Đến đây, phage sẵn sàng nhiễm vào vi
khuẩn. Để tăng bội DNA phage ngƣời ta cho các phage nhiễm vào vi khuẩn. Các
phage chứa DNA lạ sinh sản mạnh và phá vỡ vi khuẩn. Các vi khuẩn sau đó đƣợc trải
trên thạch trong hộp petri.
2.7 Các nghiên cứu về biến nạp DNA
Cohen và công sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào
vi khuẩn E.coly bằng phƣơng pháp Calcium chloride.
Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp,
biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa
ra công thức tính hệ số biến nạp
N = A x10
n
x OV/PV
N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA

A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc
n: hệ số pha loãng

22
OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl)
OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl)
Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình
chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau:
10mM Pipes, 55mM MnCl
2
, 15mM CaCl
2
, 250mM KCl
Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào
khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E.coly khác nhau.
Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hƣởng rất
lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp. Giá trị OD
600
thích hợp của
dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn nhƣ sau: XL-blue là
từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45. Nồng độ của CaCl
2
sử dụng
trong dung dich TB tối ƣu là 75mM. Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy
thời gian lƣu trữ tế bào khả nạp ở -20
o
C là 7 ngày, ở -70
o
C là 15 ngày.

23
PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp
Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15
tháng 08 năm 2005.
Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh Trƣờng Đại học Nông lâm
Thành phố Hồ Chí Minh và phòng 118,105 khu Phƣợng Vỹ Trƣờng Đại học Nông lâm
Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật lyệu và phƣơng pháp dùng trong thí nghiệm
3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm

Vật lyệu dùng trong thí nghiệm là vi khuẩn E.coly DH5α và plasmid
pBluescirpt II SK (
+
/
-
), đoạn DNA thu đƣợc từ phản ứng PCR.
3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α
Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số
lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid.
Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15)
hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1.
Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation với tiểu
phần mang đầu amino của β-galactosidase đƣợc mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan
1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986)
3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-)
pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector
nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự. pBluescript chứa
MSC với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn. Bên ngoài vùng MSC là T7, T3
RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro. Trình tự của T7,
T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự.
pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase. Việc
phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp
xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MSC so với
trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter. Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của
enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và
ngƣợc lại.

24

Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MSC của plasmid pBluescript II SK (+/-)

3.2.1.3 Đoạn DNA
Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là
Đoạn DNA (629bp) chứa gen mã hoá 2,4-diacetylploroglucinol (2,4-DAPG) trong
vi khuẩn Psedomonas fluorescens.
Đoạn DNA(580bp)trong vùng ITS của loài nấm Beauveria bassiana.
3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm
Đĩa petri, Ống nghiệm
Eppendorf các loại
Pipet và đầu tip
Lọ thủy tinh đƣng hóa chất
Đầu lọc hóa chất
Thùng đựng nƣớc đá
Bình tam giác
3.2.3 Các thiết bị máy móc
Tủ cấy vô trùng
Bồn ổn nhiệt
Máy ly tâm
Tủ định ôn
Máy lắc vi khuẩn
Tủ lạnh
Máy đo OD
Tủ sấy dụng cụ
Thiết bị điện di
Máy chụp gel
Lò vi sóng
3.2.4 Các loại môi trƣơng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua )
Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract,
natri chlorua, ampicillyn)

Môi trƣờng LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar )

25
Môi trƣờng LB agar, kháng sinh ampicillyn, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto
yeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillyn, X-gal, IPTG )
3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm
Hóa chất dùng cho PCR (đƣợc cung cấp bởi công ty Bio-rad)
iTaq polymerase
MgCl
2

dNTP
s

PCR buffer
Các loại hoá chất khác
Tryptone
Bacto yeast extract
Natri chlorua
Canxi chlorua
X-gal
IPTG
Kháng sinh Ampicillyn
Glucose
Tris- HCl pH 8.0
EDTA
Sodium dodecyl sulfat (SDS)
Natri hydroxide
Glacial acetic
Potassium acetat

Glycerol 70%
Bromophenol blue
Ethidiumbromide
3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm
BamHI với trình tự nhận biết: G GATCC
(Roche, Cat.No. 220 612) CCTAG G
EcoRV với trình tự nhận biết: GAT ATC
(Roche, Cat.No. 667 145) CTA TAG
Hind III với trình tự nhận biết: A AGCTT
(Roche, Cat.No. 656 313) TTCGA A
DNA T4 lygase (usb, Product No. 70005Y) do công ty Amersham cung cấp.
DNA Polymerase I large fragment (Klenow) (BioLabs, Code number M0210S) do
công ty Bio-rad cung cấp.