Luận văn : KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG PROGESTERONE TRONG SỮA BẰNG KỸ THUẬT ELISA ĐỂ CHẨN ĐOÁN MANG THAI SỚM, CHẬM ĐỘNG DỤC HOẶC PHỐI NHIỀU LẦN KHÔNG ĐẬU TRÊN BÕ CHO SỮA TẠI CÔNG TY CỔ PHẦN BÕ SỮA LONG THÀNH VÀ CÁC HỘ LÂN CẬN TỈNH ĐỒNG NAI part 4 ppsx

21
kể tỷ lệ sẩy thai từ 10% đến 11%. Đo hàm lƣợng progesterone trong máu hoặc sữa
vào ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 sau khi gieo tinh để có thể xác định tình trạng có
hay khơng có thai ở bò cái. Cơ sở của việc ứng dụng hàm lƣợng progesterone vào
ngày thứ 21 sau khi gieo tinh để xác định sớm sự mang thai của bò cái.

Hình 2.4 Động thái progesterone giúp chẩn đốn sớm có thai
(Chung Anh Dũng, 2002)

2.6.5 Các chỉ định và ứng dụng của xét nghiệm progesterone trong sữa
2.6.5.1 Chẩn đốn bò mang thai và khơng mang thai
Việc chẩn đốn có thai sớm bằng progesterone chính xác khoảng 80%, 20%
sai sót là do sự khác nhau về độ dài của chu kỳ động dục giữa các bò, các nhầm lẫn
trong phát hiện động dục, bệnh tử cung nhƣ bọc mủ tử cung, hoạt động khác thƣờng
của buồng trứng nhƣ u nang thể vàng hoặc nang trứng và phơi chết sớm. Việc sử
dụng progesterone để chẩn đốn có thai cần phải kết hợp với khám thai 40 ngày,
hoặc muộn hơn sau khi phối giống. Tuy nhiên, với một loạt các mẫu lấy vào ngày 0
(ngày phối tinh) và các ngày thứ 21 và 24, việc chẩn đốn sự khơng có thai có thể
Chẩn đóan
có thai dựa
vào hàm
lượng
progestron
…………
Không có
thai
Progesteron trong máu(ng/ml)
Ngày trong chu kỳ động dục

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Có thai
Chẩn đóan
có thai dựa
vào hàm
lượng
progestron
…………
Không có
thai
Progesteron trong máu(ng/ml)
Ngày trong chu kỳ động dục
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Có thai




22
đạt tới độ chính xác 95 – 100%. Do vậy, progesterone vốn đƣợc coi là công cụ để
chẩn đoán có thai sớm nên đƣợc sử dụng cho mục đích chẩn đoán không có thai và
từ đó có thể xác định đƣợc tình trạng có thai hay không có thai của gia súc. Việc
sớm xác định không có thai này sẽ tránh đƣợc sự bỏ lỡ cơ hội phối giống tiếp theo
(Chung Anh Dũng, 2002).
2.6.5.2 Xác nhận động dục
Bò cái thƣờng không có dấu hiệu động dục rõ ràng dẫn đến việc quyết định
phối giống sai. Vào thời điểm phối tinh có tới 15 – 20% bò sữa không động dục. Ở
một số trang trại, tỷ lệ phát hiện động dục sai có thể cao tới 50% hoặc hơn.

Progesterone trong sữa có thể dùng để xác định động dục ở bò. Nếu mẫu sữa kiểm
tra cho thấy hàm lƣợng progesterone cao thì có thể bò không động dục và cần đƣợc
theo dõi cẩn thận cũng nhƣ kiểm tra lại các mẫu lấy vào thời điểm muộn hơn. Có
thể tiến hành đơn giản bằng cách giữ lại mẫu sữa vào thời điểm bò đƣợc đƣa ra để
phối tinh cho đến khoảng 2 tuần hoặc một tháng sau. Nếu nhiều hơn 10% số bò
đƣợc phối tinh vào thời điểm có hàm lƣợng progesterone cao thì có thể chứng minh
đƣợc là việc phát hiện động dục không chính xác.
Các stress với môi trƣờng có tác động rất lớn đến hiệu quả sinh sản. Đặc biệt,
stress nhiệt là nguyên nhân dẫn đến việc giảm nghiêm trọng tỷ lệ có thai, tăng tỷ lệ
chết phôi sớm, giảm độ dài và cƣờng độ của các biểu hiện động dục và làm giảm
thể trọng bé sinh ra. Ngày nay ngƣời ta đã sử dụng progesterone trong sữa để trợ
giúp cho các chƣơng trình phối giống trong điều kiện gia súc bị stress do môi
trƣờng (Chung Anh Dũng, 2002).
2.7 Nguyên lý kỹ thuật ELISA (Progesterone – Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay)
Phản ứng ELISA thƣờng kết hợp kháng nguyên – kháng thể không thể phát
hiện bằng mắt thƣờng, kỹ thuật ELISA đã lợi dụng đặc tính hấp thụ tự nhiên của
protein lên polyethylen đã gắn kháng nguyên hoặc kháng thể lên giá rồi cho kháng
nguyên hoặc kháng thể tƣơng ứng có đánh dấu enzyme và tạo phản ứng.



23
Bỏ chất đánh dấu không kết hợp, cho thêm vào hỗn hợp chất hiện màu. Cũng
nhờ hoạt tính xúc tác của enzyme giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H
2
O từ oxy hóa
hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch. Nhƣ vậy, kỹ thuật ELISA gồm có 3 thành
phần tham gia phản ứng (kháng nguyên, kháng thể và chất hiện diện màu) đồng thời
thực hiện có 2 bƣớc:

Trong phản ứng miễn dịch: là sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể.
Trong phản ứng hóa học:nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng [O] vì
chính [O] này oxi hoá chất chỉ thị màu. Chất chỉ thị thay đổi màu có nghĩa là
chứng minh sự có mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp giữa kháng
nguyên với kháng thể. Có 2 loại kỹ thuật ELISA chính: kỹ thuật ELISA trực
tiếp và kỹ thật ELISA gián tiếp.
– Kỹ thuật ELISA trực tiếp: khi kháng nguyên đƣợc gắn vào đáy giếng phản
ứng sau đó phủ lên kháng thể đặc hiệu gắn enzyme, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích
hợp. Khi rửa để loại bỏ kháng thể gắn enzyme không kết hợp với kháng nguyên và
cho vào giếng chất hiện màu. Đọc kết quả bằng phổ kế sau 10 phút.
Kết quả có 2 trƣờng hợp xảy ra:
Kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ có sự kết hợp giữa kháng
nguyên và kháng thể gắn enzyme không bị rửa trôi. Enzyme sẽ giải phóng
[O] từ H
2
O
2
để oxy hóa chất hiện màu, kết quả làm thay đổi màu hỗn dịch
trong giếng.
Kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể thì không xảy ra sự kết hợp
kháng nguyên với kháng thể, enzyme bị rửa trôi, kết quả là hỗn dịch trong
giếng phản ứng không thay đổi màu.
– Kỹ thật ELISA gián tiếp: Theo nguyên tắc kỹ thuật ELISA trực tiếp và gián
tiếp không khác nhau, nhƣng kỹ thuật gián tiếp có thêm một bƣớc phản ứng.
Conjugate trong kỹ thuật trực tiếp là kháng thể đặc hiệu gắn với enzyme,
trong khi đó, conjugate của phản ứng gián tiếp là kháng thể khác với enzyme và đọc
kết quả xảy ra 2 trƣờng hợp:

24
Nếu nhƣ kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể, sẽ có sự kết hợp kháng
nguyên – kháng thể và sự kết hợp giữa conjugate với phức hợp kháng
nguyên kháng thể, trong giếng hỗn dịch có enzyme để giải phóng [O] từ
H
2
O
2
, oxy hoá chất hiện màu làm thay đổi màu hỗn dịch (phản ứng dƣơng
tính).
Khi kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể thì không có sự kết hợp
kháng nguyên – kháng thể bị rửa trôi, đồng thời, conjugate không kết hợp
với kháng nguyên cũng bị rửa trôi, hỗn dịch không có sự kết hợp với kháng
nguyên với kháng thể, kháng thể bị rửa trôi và conjugate không kết hợp với
kháng nguyên cũng bị rửa trôi, hỗn dịch sẽ không có enzyme để giải phóng
enzyme [O] từ H
2
O
2
, chất hiện màu không bị oxy hoá, hỗn dịch không thay
đổi màu (phản ứng âm tính). (Ngô Phƣơng Nghị, 2003)



25

Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

3.1.1 Thời gian
Từ tháng 03/2007 đến tháng 07/2007.
3.1.2 Địa điểm
Đề tài thực hiện tại các hộ chăn nuôi bò sữa và Công ty Cổ Phần Bò Sữa
huyện Long Thành, tỉnh Đồng Nai. Mẫu sữa xét nghiệm đƣợc phân tích tại Trung
Tâm Phân Tích Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Đối tƣợng khảo sát
– 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) nhóm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa
1, 2, 3 và 4 sinh sản bình thƣờng.
– 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) nhóm máu 50 và 75% HF sau khi sinh
từ 90 ngày trở lên thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 không động dục hoặc phối giống nhiều
lần không đậu.
3.3 Nội dung khảo sát
Lấy mẫu sữa của bò đƣợc phân theo nhóm máu, lứa đẻ ở các ngày thứ nhất
lúc gieo tinh; ngày thứ 7, ngày thứ 14, ngày thứ 21 và ngày thứ 24 sau khi gieo tinh
để khảo sát hàm lƣợng progesterone trong sữa.
3.4 Phƣơng pháp tiến hành
Khảo sát 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) sinh sản bình thƣờng và 20
con bò sữa chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu 50 và
75% HF thuộc các lứa đẻ 1, 2, 3 và 4.



26
3.4.1 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo nhóm máu
Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò sinh sản bình
thƣờng theo nhóm máu đƣợc trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Số mẫu sữa khảo sát trên bò sinh sản bình thƣờng
Nhóm máu
Số bò (n)

Số mẫu sữa thu thập (N)
50%

10
40
75%

10
40
Tổng cộng
20
80

Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò chậm động
dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu đƣợc trình bày ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Số mẫu sữa khảo sát trên bò chậm động dục
Nhóm máu
Số bò (n)
Số mẫu sữa thu thập (N)
50%

10
40
75%

10
40
Tổng cộng
20
80

3.4.2 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo các lứa đẻ
Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò sinh sản bình
thƣờng theo lứa đẻ đƣợc trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3 Số mẫu sữa khảo sát theo lứa đẻ ở bò sinh sản bình thƣờng
Lứa đẻ
Số bò (n)
Số mẫu thu thập (N)
1
4
16
2
7
28
3
4
16
4
5
20
Tổng cộng
20
80




27
Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò chậm động
dục hoặc phối nhiều lần không dậu theo lứa đẻ đƣợc trình bày ở Bảng 3.4.

Bảng 3.4 Số mẫu sữa khảo sát theo lứa đẻ ở bò chậm động dục
Lứa đẻ
Số bò (n)
Số mẫu thu thập (N)
1
4
16
2
7
28
3
4
16
4
5
20
Tổng cộng
20
80

3.4.3 Lấy mẫu sữa và ly tâm
3.4.3.1 Lấy mẫu
Vệ sinh lọ đựng sữa có thể tích khoảng 50 ml. Rửa sạch và lau khô bầu và
núm vú của bò sữa. Vắt sữa bò bình thƣờng đƣợc khoảng vài lít, sau đó hứng sữa
cho vào lọ để đạt thể tích khoảng 50 ml.
Sữa đƣợc lấy vào buổi chiều đối với cả hai nhóm bò sinh sản bình thƣờng và
bò chậm sinh.
3.4.3.2 Ly tâm và trữ mẫu
Mẫu sữa đƣợc ly tâm 3000 vòng/phút. Phần màu vàng đục và đặc ở trên là
béo và phần cặn sữa ở dƣới đáy ống nghiệm phải đƣợc loại bỏ. Sử dụng kim chích

đâm xuyên qua phần béo rồi hút phần sữa trong bên dƣới cho vào ống đựng mẫu ghi
số hiệu và bảo quản trong tủ đông -30
0
C.
3.4.4 Kỹ thuật ELISA
Chuẩn bị xét nghiệm: Bộ kít progesterone (Bovine progesterone ELISA Test.
Endocrine technologies, INC. USA ) đƣợc bảo quản ở 2 đến 8
0
C nếu không sử
dụng. Tuyệt đối không trữ đông, các mẫu sữa xét nghiệm đƣợc đƣa về nhiệt độ
phòng để chuẩn bị pha dung dịch pha loãng và TBM theo tỷ lệ 1A/1B trong một
ống nghiệm sạch trƣớc khi xét nghiệm từ 5 đến 10 phút. Những chất xét nghiệm dƣ
phải đƣợc loại bỏ.



28
3.4.4.1 Thành phần bộ kít
– 96 lỗ giếng đƣợc phủ sẵn kháng thể IgG của thỏ.
– Nồng độ progesterone chuẩn: 0; 0,5; 3,0; 10; 25 và 50 ng/ml chất lỏng pha
sẵn, mỗi chai là 0,5 ml.
– Dung dịch pha loãng mẫu, 25 ml.
– Thuốc thử màu TMB, 12 ml.
– Dung dịch chuẩn độ (2N HCL), 6 ml.
– Chất đệm rửa 20 X, 20 ml.
– Stop Solution (3N HCL): 10 ml.
3.4.4.2 Dụng cụ thực hiện
– Máy ly tâm 3000 vòng/phút.
– Ống nghiệm bằng nhựa (5 ml).
– Bông thấm nƣớc.

– Thùng đá bảo quản mẫu.
– Pipette chính xác hút đƣợc 25, 50, 100, 200 μl và 1 ml
– Nƣớc cất.
– Ống nghiệm bằng thủy tinh để pha chất nền màu A, B.
– Giấy thấm.
– Băng keo trong.
– Máy đọc đĩa vi chuẩn độ.
– Giấy vẽ đồ thị tuyến tính.
– Tủ sấy 37
0
C.
– Parafine để bịt kín đĩa.
– Đầu hút gắn vào pipette sử dụng một lần.



29
3.4.4.3 Các bƣớc xét nghiệm
– Trƣớc khi xét nghiệm lấy các mẫu sữa ra, để rã đông ở nhiệt độ phòng rồi
mới tiến hành xét nghiệm.
– Tất cả thuốc thử phải đạt tới nhiệt độ phòng 18
0
C đến 25
0
C trƣớc khi sử
dụng.
– Lấy pipette chuẩn độ 50 μl hút mẫu vật xét nghiệm và mẫu đối chứng vào
các lỗ giếng thích hợp.
– Lấy 100 μl dung dịch kết hợp enzyme progesterone vào mỗi lỗ giếng (ngoại
trừ những lỗ giếng để trống, lắc lỗ giếng 30 giây, ủ ở 37

0
C trong 1giờ. Nên dùng
parafin để che những lỗ giếng hoặc sử dụng túi thích hợp để cất giữ những đĩa trong
suốt quá trình ủ ấm.
– Bỏ những chất còn tồn đọng bên trong lỗ giếng và rửa đĩa 5 lần với dung
dịch rửa (250 đến 300 μl/giếng). Lật ngƣợc đĩa, kiểm tra bằng giấy thấm để lấy đi
nƣớc ẩm còn xót lại.
– Thêm 100 μl dung dịch TMB vào tất cả các giếng theo thứ tự.
– Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng từ 18 đến 28
0
C trong 10 phút, không đƣợc di chuyển.
– Dừng phản ứng bằng cách cho thêm 50 μl chất chuẩn độ vào các giếng theo
thứ tự giống nhau để cơ chất thêm vào tác động từ từ.
– Đọc bƣớc sóng hấp thu ở 450 nm với máy đọc vi lƣợng.
Chú ý: Ủ cơ chất phải đƣợc giữ trong nhiệt độ từ 25 đến 28
0
C. Nếu ngoài nhiệt độ
giới hạn này, thời gian ủ ấm phải đƣợc tính lại cho đúng.
3.4.4.4 Tính toán kết quả
– Tính độ hấp thu trung bình mỗi loại: Mẫu chuẩn, mẫu đối chứng, mẫu sữa
xét nghiệm.
– Vẽ đƣờng cong chuẩn trên giấy vẽ đồ thị tuyến tính. Độ hấp thu của chuẩn
để ở trục tung (Y). Nồng độ chuẩn tƣơng ứng ở trục hoành (X).
– Tính toán nồng độ progesterone của mẫu sữa dựa vào đƣờng cong chuẩn
trên.



30
3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu

– Số liệu đƣợc trình bày dƣới dạng trung bình và sai số của mẫu (
X
± SE).
– Trung bình cộng:
N
X XX

N2 1
X

Trong đó: X
1
, X
2
, … X
N
là hàm lƣợng progesterone của mẫu sữa khảo sát
N: là số mẫu sữa khảo sát
– Độ lệch chuẩn: S
X
=
1 - N
x( -
i
22
)
i
x