Luận văn : THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO CON SAU CAI SỮA part 5 doc

20
2.5.2. Tác dụng của chất bổ trợ
 Chất bổ trợ giúp kháng nguyên di chuyển đến các hạch lympho, tại đây chúng
đƣợc các tế bào lympho T nhận diện. Nhờ vậy mà có nhiều tế bào lympho T đƣợc
hoạt hóa để tham gia tạo kháng thể.
 Chất bổ trợ nhƣ một tác nhân bảo vệ vật lý giúp kháng nguyên kéo dài sự biểu
hiện bên trong cơ thể đƣợc tiêm vaccine. Qua đó hệ miễn dịch có thêm thời gian
để tăng cƣờng điều chỉnh tế bào lympho T và B.
 Chất bổ trợ giúp tăng sức chịu đựng tại nơi tiêm, giải tỏa những phản ứng phụ
nguy hiểm.
 Chất bổ trợ không chỉ tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mà còn tăng
cƣờng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu.
2.5.3. Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ đƣợc sử dụng
trong đề tài này)
Montanide đƣợc sản xuất bởi công ty SEPPIC (trụ sở chính công ty tại Paris,
nƣớc Pháp), là chất bổ trợ tăng cƣờng tính hiệu quả và sự ổn định của vaccine,
ngoài ra nó còn làm giảm những phản ứng phụ trên cơ thể đƣợc tiêm vaccine và rất
dễ sử dụng.
Montanide đƣợc sử dụng rộng rãi cho các vaccine thƣơng phẩm trên nhiều loài
nhƣ heo, bò, cá… và chỉ đƣợc sử dụng trong thú y.
Đặc điểm Montanide:
 Dạng dung dịch dầu hỗn hợp Anhydro mannitol ether octodecenoate.
 pH: 5 - 7
 Không mùi, có màu vàng.
 Điểm sôi: > 100
o
C.
 Điểm bốc cháy: > 100
o

C.
 Không tự bốc cháy, không tự nổ.
 Không hòa tan trong nƣớc, hòa tan trong các dung môi.
 Lƣu trữ: cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh.


21
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1. Thời gian và địa điểm
3.1.1. Thời gian: 4 tháng
3.1.2. Địa điểm
- Phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn Vi Sinh - Truyền Nhiễm, khoa
Chăn Nuôi - Thú Y, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM.
- Trại heo tƣ nhân ở Bình Dƣơng.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Heo con từ 14 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi chƣa tiêm vaccine phòng tiêu chảy do
E. coli hoặc chƣa tiến hành điều trị kháng sinh.
Số lƣợng : 16 bầy heo con.
3.2.2. Vật liệu và thiết bị
Mẫu phân đƣợc lấy từ những heo trong trại có biểu hiện tiêu chảy.
54 mẫu huyết thanh heo con thí nghiệm.


22
Nƣớc muối sinh lý.
Môi trƣờng phân lập và thử sinh hóa vi khuẩn E. coli: EMB, KIA, TSA, TSB,
môi trƣờng và thuốc thử các phản ứng IMViC.

Bộ kít huyết thanh chuẩn để định type đối với vi khuẩn E. coli (F4, F5, F6).
Chất bổ trợ Montanide
Dung dịch formol 0,3% dùng để bất hoạt vi khuẩn.
Tăm bông tiệt trùng, que cấy, ống nghiệm, đĩa petri, kính hiển vi, tủ ấm, tủ lạnh,
nhiệt kế, cylindre, máy hấp autoclave
3.3. Nội dung
- Sản xuất auto-vaccine trong phòng thí nghiệm.
- Đánh giá hiệu quả của auto-vaccine trên heo con thí nghiệm.
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
Chọn những heo có dấu hiệu tiêu chảy, chƣa sử dụng kháng sinh. Đầu tiên, dùng
bông gòn thấm cồn để sát trùng hậu môn, tiếp theo sử dụng tampon tiệt trùng đƣa
vào trong trực tràng khoảng 3cm, ngoáy một đến hai vòng rồi cắm sâu tampon vào
giữa ống nghiệm có chứa nƣớc muối sinh lý, đậy nút bông vào cẩn thận.
Mẫu đƣợc bảo quản ở 0-4
o
C trong thùng đá sau đó đem về phòng xét nghiệm để
phân lập.



Hình 3.1. Lấy mẫu phân tiêu chảy ở heo con


23
3.4.2. Nghiên cứu vi sinh vật
3.4.2.1. Nuôi cấy phân lập
Sử dụng môi trƣờng chuyên biệt EMB (Eosin Methylen Blue).
Thực hiện phân lập vi khuẩn trực tiếp từ mẫu sang môi trƣờng chuyên biệt EMB
trên đĩa petri bằng que cấy vòng. Sau đó đem ủ đĩa EMB đã đƣợc cấy vi khuẩn

trong tủ ấm ở nhiệt độ 37
o
C, 24 giờ.
Vi khuẩn E. coli trong môi trƣờng EMB cho khuẩn lạc đƣờng kính khoảng 1-
2mm, màu tím ánh kim, có vùng sậm đục ở giữa khuẩn lạc.
Để bắt E. coli, chúng tôi chỉ chọn khuẩn lạc từ những đĩa có trên 2/3 số khuẩn lạc
nghi ngờ là E. coli.








3.4.2.2. Kiểm tra sinh hóa
Từ những khuẩn lạc đặc trƣng của E. coli trên môi trƣờng EMB (hơi dẹt, bóng,
nhỏ, tím ánh kim, không nhô cao lên thạch), chúng tôi sẽ chọn 3 - 5 khuẩn lạc để
cấy chuyển sang môi trƣờng KIA (Kliger Iron Agar), ủ ở nhiệt độ 37
o
C trong vòng
24 giờ. Vi khuẩn E. coli lên men đƣờng glucose và lactose có sinh hơi.
Hình 3.2. Phân lập E. coli trên môi trƣờng EMB
Chỉ chọn
khuẩn lạc
của mẫu A
Không chọn
khuẩn lạc
của mẫu B
Khuẩn lạc nghi ngờ E. coli

24
Kết quả trên môi trƣờng KIA của vi khuẩn E. coli là cả phần nghiêng và
phần đứng của môi trƣờng đều có màu vàng, có hơi.











Từ môi trƣờng KIA, vi khuẩn đƣợc cấy truyền sang môi trƣờng TSA (Tryptone
Soya Agar) ủ ở nhiệt độ 37
o
C trong vòng 24 giờ để nhuộm Gram và thực hiện các
phản ứng sinh hóa, phản ứng huyết thanh học.
i. Nhuộm Gram: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc nhuộm Gram.
Kết quả: E. coli có màu hồng Gram âm.

Hình 3.4. Vi khuẩn E. coli hình que, màu hồng Gram âm
Hình 3.3. Vi khuẩn E. coli lên men đƣờng sinh hơi trong môi trƣờng KIA


25
ii. Xác định phản ứng sinh hóa: E. coli cho kết quả nghiệm pháp IMViC là ++
a. Phản ứng Indol: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào các ống môi trƣờng
canh tryptone, ủ 24 giờ. Sau đó, nhỏ thuốc thử Kovacs’ để thực hiện phản
ứng Indol.
Kết quả: E. coli cho phản ứng dƣơng tính có vòng đỏ xuất hiện trên bề
mặt môi trƣờng.









b. Phản ứng Methyl Red: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào môi trƣờng
canh Clark-Lubs, ủ 24 giờ. Sau đó, nhỏ thuốc thử Methyl Red để thực hiện
phản ứng.
Kết quả: E. coli có phản ứng dƣơng tính dịch nuôi cấy màu đỏ.

Hình 3.5. Phản ứng Indol
Hình 3.6. Phản ứng Methyl Red

26
c. Phản ứng Voges Proskauer: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào môi canh
trƣờng Clark-Lubs, ủ 24 giờ. Sau đó, nhỏ thuốc thử là α-naphtol và KOH
40% để thực hiện phản ứng.
Kết quả: E. coli có phản ứng âm tính môi trƣờng không có màu đỏ hồng.










d. Phản ứng Citrate: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào môi trƣờng thạch
nghiêng SCA (Simmons Citrate Agar), ủ 24 giờ.
Kết quả: E. coli có phản ứng âm tính giữ nguyên màu lục môi trƣờng.










Hình 3.7. Phản ứng Voges Proskauer

Hình 3.8. Phản ứng Citrate


27
iii. Phản ứng huyết thanh học định type kháng nguyên của vi khuẩn E. coli: bằng
phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với các kháng huyết thanh của các type F4, F5,
F6.
Tiến hành: sử dụng lame sạch, nhỏ lên lame 10µl kháng huyết thanh và 10µl nƣớc
muối sinh lý bên cạnh. Dùng que cấy vòng lấy một ít vi khuẩn trong ống TSA, trộn
vào giọt nƣớc muối sinh lý, trộn đều rồi hòa kháng huyết thanh và vi khuẩn với nhau.
Kết quả của phản ứng ngƣng kết đƣợc đọc trong vòng 30 giây sau khi vi
khuẩn và kháng huyết thanh đã đƣợc trộn lẫn.Trong trƣờng hợp vi khuẩn
có kháng nguyên phù hợp với kháng thể có trong kháng huyết thanh, trong
huyễn dịch sẽ hình thành nên các hạt ngƣng kết lớn, màu trắng đục, nhìn
thấy rất rõ bằng mắt thƣờng, phản ứng đƣợc đọc là dƣơng tính. Nếu huyễn
dịch vẫn đồng nhất, không thấy có sự xuất hiện các hạt ngƣng kết, phản
ứng đƣợc đọc là âm tính (Diagnostic Pasteur Manual. 3e ed).












Sơ đồ 3.1. Qui trình phân lập và định danh vi khuẩn E. coli (Nguyễn Ngọc Hải, 1999)

Mẫu phân
Nhuộm Gram
EMB
KIA
TSA
Thử phản ứng
ngưng kết
Thử phản ứng
sinh hóa


28
3.4.3. Điều chế auto-vaccin
Việc chọn lựa kháng nguyên sẽ theo các tiêu chí
Vi khuẩn phải có đầy đủ các tính chất về hình dạng khuẩn lạc, màu sắc
nhuộm gram, các phản ứng sinh hóa, lên men đƣờng,… nhƣ đã đề cập ở trên.
Chủng tuyển chọn đƣợc phân lập từ các heo khác nhau.
Chủng định đƣợc type kháng nguyên (F4, F5 hoặc F6), có kết quả ngƣng kết
rõ ràng.
Sau khi nhuộm Gram, thực hiện phản ứng sinh hóa và phản ứng huyết thanh định
type, chúng tôi chọn ra 5 chủng E. coli cho kết quả phản ứng định type rõ nhất. 5
chủng này đƣợc nuôi cấy tăng sinh trong môi trƣờng canh TSB, trong 5 bình thủy
tinh khác nhau, có lắc đảo trong quá trình tăng sinh.
Sau 24 giờ nuôi tăng sinh, chúng tôi trộn lẫn dịch nuôi ở 5 bình để đếm số lƣợng,
xử lý làm chết vi khuẩn và li tâm rửa.
Sau lần ly tâm cuối cùng, vi khuẩn đƣợc hòa vào một thể tích nƣớc muối sinh lý
thích hợp để đạt nồng độ 2.10
9
tế bào/ml.
Chuẩn bị auto-vaccine: dịch vi khuẩn có nồng độ 2.10

9
tế bào/ml đƣợc cho vào
các flacon đã tiệt trùng, sau đó cho chất bổ trợ Montanide vào (theo tỷ lệ 50 chất bổ
trợ và 50 dịch vi khuẩn). Bảo quản các flacon vaccine này ở 0
0
C - 4
0
C.