Xét nghiệm phế cầu (.pneumoniae)

K Thu t xột nghi m ph c u
(Streptococcus pneumoniae)
PGS. TS. Phan Lờ Thanh Hng
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng
Mục tiêu:
Sau khoá học, học viên hiểu đợc:
- Vai trò gây bệnh và những đặc tính của phế cầu
- Cách lấy bệnh phẩm, bảo quản và vận chuyển về phòng thí
nghiệm để phân lập phế cầu khuẩn.
- Phơng pháp nuôi cấy phõn lp ph cu t cỏc loi bnh phm.
- Nhng th nghim v tiờu chun nh danh ph cu.
1. Giới thiệu chung
Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae còn đợc gọi là
Diplococcus pneumoniae), là một thành viên phổ biến của hệ vi khuẩn
chí vùng hầu họng, nhng khi gặp điều kiện thuận lợi nó trở thành một tác
nhân vi khuẩn gây nên các nhiễm trùng cấp tính nghiêm trọng ở trẻ nhỏ
và ở ngời lớn tuổi.
Phế cầu khuẩn có thể gây viêm mũi-họng (nasopharyngitis), viêm tai
giữa, viêm xoang, nặng hơn là viêm phế quản-phổi, viêm tiểu thuỳ phổi
(thờng xảy ra ở trẻ em, ngời lớn > 50 tuổi), viêm phổi thùy (thờng xảy ra
ở ngời 30-50 tuổi), nhiễm khuẩn huyết dẫn tới viêm màng não, có thể
gây viêm nội tâm mạc, viêm ngoại tâm mạc, hoặc gây apxe ở nhiều tổ
chức khác trong cơ thể.
Vỏ polysaccarit là cơ sở duy nhất cho sự phân loại và là yếu tố độc lực
duy nhất đợc biết. Ngời ta đã nhận biết đợc hơn 90 typ huyết thanh tơng
ứng với các cấu trúc vỏ của phế cầu. Vỏ của phế cầu là yếu tố độc lực
quan trọng và có tính quyết định trong bệnh sinh. Vỏ ức chế sự thực bào,
tạo điều kiện cho vi khuẩn tồn tại, nhân lên trong tổ chức vật chủ và sinh
bệnh. Vỏ kích thích tạo kháng thể đặc hiệu loài, có tính bảo vệ vật chủ
thông qua việc tăng khả năng thực bào, giết vi khuẩn ngay ở trong tế bào
bởi các bạch cầu đa nhân.

Phế cầu khuẩn (S. pneumoniae) là loại cầu khuẩn hình ngn nn
thờng nối thành đôi hình mắt kính, nên còn thuộc nhóm liên cầu, bắt màu
Gram dơng, có vỏ và không di động. ở môi trờng lỏng hay trong các tổ
chức bệnh phẩm có thể xếp thành chuỗi ngắn và hãn hữu có thể đứng
riêng rẽ một mình (thờng ở trong điều kiện và môi trờng kém dinh dỡng
hoặc có nồng độ thấp của ion Mg
++
). Hầu hết phế cầu khuẩn bắt màu
Gram dơng song đôi khi trong quá trình thay đổi nuôi cấy có thể trở
thành Gram âm, do vi khuẩn bị tự ly giải hoặc do các hoạt tính bề mặt bị
tác động bởi muối mật (sodium deoxycholate hoặc sodium
dodecylsulfat). Phế cầu khuẩn phát triển tốt trong các môi trờng lỏng và
trên các môi trờng thạch Tryptocasein soy có bổ xung 5% máu (cừu,
ngựa, thỏ) đã lấy hết tơ huyết. Trong môi trờng lỏng, phế cầu mọc có
khuynh hớng khuyếch tán và lắng cặn khi môi trờng đã ngả sang axit.
Không nên dùng máu ngời vì có thể có chất kháng sinh và các chất ức
chế sự phát triển của vi khuẩn.Trên môi trờng thạch máu 5% (cừu, thỏ),
khuẩn lạc tròn bóng ớt do vi khuẩn có vỏ, không sắc tố, có khuynh hớng
lõm ở giữa vì sự hoạt động của một enzym tự ly giải, đờng kính khuẩn
lạc 0,5-1,5mm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha (màu
xanh ve do tan huyết không hoàn toàn).
Phế cầu phát triển tốt trong khí trờng có 5% CO
2
ở 37
O
C, nếu
không có tủ ấm CO
2
có thể dùng chuông thuỷ tinh kín và đốt nến, với
cách này cũng tạo đợc khí trờng có CO

2
nhng chỉ dới 5% và vi khuẩn vẫn
phát triển đợc.
Phế cầu có thể tồn tại trong đờm khô vài ngày đến vài tháng, trong
môi trờng canh thang có 20% glycerin và ở nhiệt độ âm sâu (-70
0
) phế
cầu tồn tại 1 2 năm, nhng dễ bị diệt bởi các chất sát khuẩn thông th-
ờng v nhiệt độ 60
0
C trong 30 phút. Trong thời gian ngắn, nhiệt độ giữ
chủng thích hợp l 18 - 30
0
C.
2. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm, bảo quản và vận chuyển về phòng thí
nghiệm:
2.1. Các loại bệnh phẩm
+ Bệnh phẩm đờng hô hấp: có thể l đờm, d ch hút tỵ hầu, dịch hút
nội khí quản, tăm bông ngoáy tỵ hầu, tăm bông ngoáy họng, .
+ Bệnh phẩm từ tổ chức bị bệnh: dịch não tủy, máu
2.2. Cách lấy bệnh phẩm:
2.2.1.Chất dịch đờng hô hấp: trong những trờng hợp viêm phổi, viêm phế
quản, viêm phế quản phổi
+ Đờm: nếu là ngời lớn, đờm đợc lấy vào buổi sáng sớm, ho và
khạc sâu, đờm đợc giữ ở hộp vô khuẩn rồi chuyển về phòng thí nghiệm
trong vòng vài giờ, có thể giữ ở 4
0
C trong vòng 24 giờ .
+ Dịch tỵ hầu (mũi-họng):
Lấy bằng tăm bông: nếu bệnh nhân không khạc đợc hoặc là trẻ

nhỏ, dùng tăm bông cán thép mảnh mềm lấy chất dịch ở ngã ba mũi -
họng theo đờng mũi (dịch tỵ hầu): đa tăm bông vào sâu bằng một nửa
khoảng cách tính từ cánh mũi đến dái tai cùng phía, vê nhẹ rồi rút ra.
Chú ý, nếu cha vào đủ độ sâu đã có vật cản không đợc cố lấy mà phải
làm lại ở mũi bên kia. Tăm bông phải đảm bảo không dễ bị tụt đầu bông
vào khí quản và cán làm bằng kim loại mềm không gỉ không dễ gẫy khi
thực hiện thao tác.
Lấy bằng máy hút chân không nhẹ: cách này thay thế cho cách
ngoáy tỵ hầu ở trên. Dùng ống thông plastic nhỏ mềm đa sâu qua lỗ mũi
một khoảng cách bằng khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngoài của
bệnh nhân để hút dịch.
+ Tăm bông ngoáy họng: đè lỡi, dùng tăm bông vô khuẩn đã đợc
làm ẩm bằng nớc muối sinh lý (vô khuẩn) chà sát 2 hốc amidan, thành
sau họng (sau lỡi gà). Tránh không đợc chạm vào lỡi, răng, mặt trong má
và lỡi gà. Sau đó phải cắm tăm bông vào môi trờng vận chuyển (T-I) nu
cha cy ngay hoặc nếu phải vận chuyển
2.2.2.Dịch não tuỷ: trong trờng hợp nghi viêm màng não, dùng kim chọc
tủy sống vô khuẩn lấy ít nhất 1 ml nớc não tủy, đựng trong ống nghiệm
đã tiệt trùng.
2.2.3.Máu: trong trờng hợp bệnh nhân có sốt cao, nghi viêm màng não,
viêm phổi cấp, dùng bơm kim tiêm vô khuẩn lấy ít nhất 3ml máu tĩnh
mạch (trẻ nhỏ), 5ml đến 10ml (ngời lớn) cho ngay vào bình canh thang
não-tim (brain-heart infusion) hoặc trypticase soy có bổ xung máu động
vật 5%, chất chống hình thành áo máu 0,025% SPS (sodium polyanethole
sulfonate) và có thể thêm chất hấp phụ kháng sinh resins, đợc pha theo tỷ
lệ 1 phần máu 10 phần canh thang, hoặc sử dụng chai cấy máu do các
hãng thơng mại pha chế sẵn. Việc pha loãng máu trong canh thang nuôi
cấy theo tỷ lệ 1/10 cũng đã có tác dụng làm giảm các chất ức chế vi
khuẩn hoặc kháng sinh có trong máu bệnh nhân.
Chú ý: động tác và quá trình lấy máu, cấy máu phải đảm bảo thật

vô khuẩn trong một quy trình kín. Tốt nhất, kim lấy máu đợc nối trực tiếp
vào bình môi trờng qua một ống cao su hay plastic vô khuẩn. sát trùng vị
trí lấy máu bằng cồn iốt.
2.2.4. Các bệnh phẩm khác: mủ amiđan, mủ tai giữa, dịch chọc phổi,
chọc hút và đựng trong các ống nghiệm vô khuẩn
2.3. Vận chuyển và bảo quản
Phế cầu cũng là một vi khuẩn nhạy cảm và dễ chết ở ngoại cảnh,
vì vậy tốt nhất các bệnh phẩm nên đợc chuyển về phòng thí nghiệm trong
vòng 2 giờ, hoặc không quá 6 giờ và có thể giữ ở nhiệt độ 4-8
0
C nhng
không quá 24h. Nếu quá trình luân chuyển từ 2- 4 giờ bệnh phẩm có thể
đợc cấy ngay hoặc tăng sinh trớc trong canh thang (tryptocasein soy hoặc
hỗn hợp não tim BHI có 5% máu) 2 giờ ở 37
0
C, nếu thời gian chuyển
bệnh phẩm từ 4-8 giờ bệnh phẩm nên đợc ủ trong canh thang ít nhất là 2
giờ rồi mới cấy ra thạch máu 5%.
Chú ý: bệnh phẩm đợc lấy bằng tăm bông, nếu có điều kiện nuôi
cấy ngay, bệnh phẩm chỉ cần giữ trong nớc muối sinh lý. Nếu không có
điều kiện cấy ngay, bệnh phẩm phải đợc giữ trong môi trờng bảo quản
3. Kỹ thuật xác định phế cầu trong phòng thí nghiệm:
3.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị:
3.1.1. Môi trờng và sinh phẩm cho nuôi cấy phân lập:
+ Thạch máu cừu hoặc thỏ 5%: mua sẵn hoặc tự pha chế (phụ lục)
+ Thạch máu thỏ tơi 7%: tự pha chế (không có trên thị trờng thơng
mại)
+Canh thang giàu dinh dỡng: canh thang Trypticase soy hoặc
Brain-Heart Infusion (BHI) có 5% Fildes Enrichment (BD BBL Co.,)
hoặc có 5% máu động vật.

+ Khoanh giấy Optochin (Bio-Rad)
+ Muối mật (deoxycholate)
+ Nớc muối sinh lý (NaCl 0,85%)
+ Dung dịch Acetein (N-acetyl- L- cystine), để xử lý bệnh phẩm
đờm
+ Bộ nhuộm Gram
+ Cồn 70
0
3.1.2. Dụng cụ và trang thiết bị cho nuôi cấy phân lập
+ Que cấy dung tích 1l và 10l
+ Các loại ống nghiệm thủy tinh 15 20ml
+ ống nghiệm nhựa (cryotube và eppendorf bảo quản mẫu và ly
tâm)
+ Giá để ống nghiệm
+ ống hút nhựa 1ml (có quả bóp) dùng một lần
+ Lam kính và lamen
+ Đèn cồn
+ Kính hiển vi
+ Máy Vortex (máy trộn)
+ Máy ly tâm thờng (4000 10.000 vòng)
+ Tủ ấm CO2 hoặc tủ ấm thờng + bình kín (để đốt đợc nến)
3. 2. Xét nghiệm trực tiếp:
3.2.1. Nhuộm Gram: nói chung, theo phơng pháp thông thờng, xét
nghiệm trực tiếp các bệnh phẩm từ họng, mũi thờng ít giá trị trong việc
xác định căn nguyên gây bệnh vì lẫn nhiều loại vi khuẩn và cũng có thể
đó chỉ là vi khuẩn chí (sng cng sinh), chỉ các tiêu bản của các bệnh
phẩm là máu, dịch não tủy hay các dịch cơ thể có bản chất là vô trùng
mới có giá trị trong chẩn đoán căn nguyên phế cầu. Nhuộm Gram tiêu
bản đờm có giá trị xác định căn nguyên phế cầu khi số lợng bạch cầu đa
nhân tăng lên (nếu trên 25 bạch cầu đa nhân và dới 25 tế bào biểu mô

trên tổng số 100 tế bào ở vi trờng) và thấy có vi khuẩn phế cầu (hình lỡi
mác hay ngọn nến thờng nối đôi, cũng có thể đứng đơn lẻ, bắt màu
Gram dơng) ở bên trong hoặc cả bên ngoài tế bào bạch cầu thì có thể
định hớng chẩn đoán phế cầu là tác nhân gây viêm đờng hô hấp.
Phế cầu bắt màu Gram dơng nhng tính chất này có thể bị mất do
bệnh phẩm để quá lâu, hoặc môi trờng không đủ chất dinh dỡng hay
bệnh nhân đã dùng nhiều kháng sinh.
Nếu là đờm nên dàn tiêu bản nhuộm soi trớc khi xử lý đờm với hóa
chất làm lỏng đờm để nuôi cấy.
Ph ơng pháp nhuộm Gram
a/ Chuẩn bị thuốc nhuộm:
+ Thuốc nhuộm tím gentian:
Tím gentian, dung dịch bão hòa trong cồn 95
o
: 10 ml
Axit phenic 1 ml
Nớc cất 100 ml
Lắc đều lọc qua giấy.
+ Dung dịch lugol:
Iod 1 g
Kali Iodua 2 g
Nớc 5 ml
Nghiền tan trong cối, rồi thêm nớc cho đủ 200 ml
+ Thuốc nhuộm Fucsin kiềm:
Fucsin kiềm, dung dịch bão hòa trong cồn 95
o
C: 10 ml
Axit phenic: 5 ml
Nớc cất 100 ml
Lắc đều, lọc qua giấy.

b/ Cách nhuộm:
- Dàn tiêu bản, để khô tự nhiên. Cố định tiêu bản trên phiến kính
bằng cách hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ
vừa phải trên mu bàn tay). Chú ý: nóng quá, hoặc hơ lâu, vi khuẩn
sẽ biến dạng
- Đổ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 1 phút, rửa nớc
- Đổ dung dịch lugol lên trong 1 phút, hất bỏ đi.
- Tẩy màu bằng cồn 90
o
tới khi bạc màu
- Rửa qua nớc
- Đổ thuốc nhuộm Fucsin lên trong 1 phút
- Rửa qua nớc
- Thấm giấy hoặc để khô ở không khí
c/ Đọc kết quả:
Vi khuẩn Gram dơng: màu tím (tím gentian)
Vi khuẩn Gram âm: màu đỏ (đỏ Fucsin)
Các vi khuẩn thuộc loại Gram dơng có chất protein kiểu magic
ribonucleat. Chất này khi gặp những thuốc màu thuộc loại pararosanilin
(nh tím getian chẳng hạn) và chất iod kết lại thành một hợp chất không bị
phá hủy bởi cồn. Do đấy, khi dùng cồn để tẩy màu, những vi khuẩn Gram
dơng không bị ảnh hởng.
3.2.2. Thử nghiệm "Quellung": phản ứng Quellung dơng tính xảy ra khi
kháng thể đặc hiệu loài (type-specific antiserum) gắn với thành phần
polysaccarit của vỏ phế cầu, gây nên sự thay đổi chỉ số khúc xạ của vỏ
khi ánh sáng chiếu vào mà ta nhìn thấy dễ dàng dới dạng "phình vỏ".
Hình ảnh quan sát thấy là: tế bào vi khuẩn bắt màu xanh đen, xung quanh
tế bào có một quầng với đờng viền sắc nét, đó là gờ ngoài của vỏ (do ánh
sáng xuyên qua vỏ sáng hơn vùng tế bào phế cầu). Các vi khuẩn hoặc ở
dạng đơn, nối đôi, hoặc chuỗi ngắn đều có thể có phản ứng Quellung.

Bằng thử nghiệm này, phế cầu khuẩn có thể đợc xác định trực tiếp từ các
dịch cơ thể (dịch não tuỷ, dịch phúc mạc, dịch hút nội khí quản hoặc
đờm) hay từ 1 khuẩn lạc đơn.
Kỹ thuật đợc thực hiện nh sau: đặt một giọt nhỏ (10l) hay 1 ăng
(1-2mm) dịch cơ thể, canh thang nuôi cấy hay huyền dịch vi khuẩn
(khuẩn lạc của nuôi cấy 16-24 giờ ở 35-37
0
C/5%C02, pha trong nớc
muối sinh lý tạo độ đục tơng đơng 0,5 Mc Farland) lên phiến kính sạch.
Nhỏ tiếp 1 giọt (khoảng 10l) hay 1 ăng đầy (10l) kháng huyết thanh,
trộn kỹ. Nhỏ tiếp 1 ăng đầy (10l) dung dịch xanh methylene bão hoà,
trộn kỹ. Phủ lamen lên hỗn hợp trên, sau 10 phút, quan sát hiện tợng
phình vỏ của phế cầu bởi tác động của kháng huyết thanh đặc hiệu bằng
kính hiển vi với vật kính dầu.
Chú ý: phản ứng chỉ xảy ra khi có sự tơng quan về lợng giữa kháng
nguyên (vi khuẩn) và kháng thể (kháng huyết thanh), do đó để tránh âm
tính giả do d thừa kháng nguyên, nên chuẩn bị các phiến kính sao cho
mỗi một vi trờng chỉ chứa từ 50-100 tế bào, lợng tế bào tối u nhất để
quan sát là 25-50 tế bào vi khuẩn trong một vi trờng.
Trong thử nghiệm Quellung, phế cầu khuẩn đợc xác định với một
bộ kháng huyết thanh. Kháng huyết thanh có thể là một tập hợp của 90
loại kháng thể đặc hiệu tơng ứng với 90 loại phế cầu khuẩn có cấu trúc
vỏ khác nhau (omniserum) còn gọi là kháng huyết thanh đa giá, hoặc tập
hợp của một số kháng thể đặc hiệu loài hay nhóm và trong mỗi tập hợp
có 4-7 loại kháng huyết thanh đơn giá (58 loại trong tổng số 90 thuộc về
20 nhóm kháng huyết thanh mà mỗi nhóm bao gồm từ 2-4 loại). Hiện
nay ngời ta đã biết rõ 46 loại hay nhóm phế cầu khuẩn khác nhau và hơn
90% các chủng phế cầu phân lập đợc từ máu hay dịch não tuỷ đều thuộc
về 1 trong 23 loại hay nhóm phế cầu khác nhau mà đã đợc chọn để sản
xuất vắc xin phòng bệnh do phế cầu. Do vậy, tại một số phòng thí

nghiệm ngời ta thờng dùng 12 nhóm kháng huyết thanh (12 pooled sera)
để xác định loại hay nhóm các chủng phế cầu phân lập đợc từ máu và
dịch não tuỷ. Khi xác định typ huyết thanh hay thực hiện thử nghiệm
Quellung nên tuân theo hớng dẫn của Hãng sản xuất và theo mục đích
dịch tễ học để chọn kháng huyết thanh. Có thể có mặt các kháng thể gây
phản ứng chéo trong omniserum nên phải có sự kiểm tra hình thái học
của khuẩn lạc và vi khuẩn cũng nh tính bắt màu Gram của các chủng đợc
thử nghiệm.
3.3. Nuôi cấy phân lập:
3.3.1 Qy trình phân lập: tùy theo từng loại bệnh phẩm để có các cách xử
lý và nuôi cấy phù hợp.
+ Bệnh phẩm đờng hô hấp: nếu đặc cần làm lỏng đờm hoặc dịch đ-
ờng hô hấp bằng dung dịch Acetein (N-acetyl-L-cysteine) ở tỷ lệ
đờm/dung dịch = 5/1 và dùng máy khuấy vortex làm lỏng đờm trớc khi
nuôi cấy. Sau đó, nên pha loãng tiếp bệnh phẩm ít nhất 10 lần trong nớc
muối sinh lý trớc khi nuôi cấy. Hiệu quả nhất trong phân lập vi khuẩn
gây bệnh đờng hô hấp nếu ta sử dụng phơng pháp cấy đếm đối với các
mẫu bệnh phẩm đờng hô hấp để phát hiện và phân biệt các vi khuẩn gây
bệnh nói chung và phế cầu khuẩn nói riêng với các thành phần vi khuẩn
chí ở đờng hô hấp.
+ Dịch não tủy: nên cấy song song vào thạch máu 5%
(Tryptocasein soy hoặc thạch não tim BHI có bổ xung 5% máu đã lấy
hết sợi tơ huyết) và vào canh thang tăng sinh (bổ sung 5% máu thỏ hay
cừu) ủ 37
0
C/5% C02/16-24h. Trong trờng hợp đĩa thạch máu cấy trực tiếp
bệnh phẩm âm tính, phải cấy chuyển từ canh thang tăng sinh ra thạch
máu ở các ngày thứ 2,3 và 7. Để có thể phân lập đợc cả loại vi khuẩn khó
tính nh H. influenzae, có thể cấy bệnh phẩm lên thạch sôcôla hoặc sử
dụng thạch máu thỏ tơi 7% (ngoài phế cầu khuẩn và một số loại vi khuẩn

khác, thạch máu thỏ tơi 7% có khả năng phân lập đợc cả H. influenzae)
+ Máu: trong trờng hợp có sốt hoặc nghi nhiễm khuẩn huyết, cấy
máu theo một chu trình kín vô khuẩn. Tuỳ theo bệnh nhân là trẻ nhỏ hay
ngời lớn, lấy từ 3-10ml máu tĩnh mạch cấy vào bình canh thang não-tim
(brain-heart infusion) hoặc trypticase soy có bổ xung máu động vật 5%,
chất chống hình thành áo máu 0,025% SPS (sodium polyanethole
sulfonate) và có thể thêm chất resins (có tác dụng hấp phụ các chất diệt
khuẩn hay kháng sinh có trong máu bệnh nhân) theo tỷ lệ 1 phần máu 10
phần canh thang, sau đó ủ ở 37
0
C/5% C02/16-24 giờ, nếu dơng tính cấy
chuyển sang các môi trờng thạch (thạch máu động vật 5%, hoặc 7%).
Một số môi trờng nuôi cấy phát hiện phế cầu khuẩn:
- Thạch máu 5% có Gentamycin [5mcg/ml]: chỉ cho phế cầu
phát triển.
- Thạch máu 5% không có Gentamycin: tìm phế cầu, liên cầu, tụ
cầu và một số trực khuẩn Gram âm
- Thạch máu thỏ 7% phát hiện cả phế cầu và H. influenzae
Cỏc mụi trng nuụi cy tỡm ph cu c ấm trong khí trờng
37
0
C/5% C0
2
từ 16 - 24 giờ. Nếu không có tủ ấm CO2, đặt các hộp lồng
vào chuông thủy tinh kín và đốt 1 ngọn nến, khi nến tắt cũng tạo đợc khí
trờng có CO2, sau đó đặt chuông vào tủ ấm 37
0
C, tuy nhiờn ph cu
cng cú th phỏt trin trong iu kin khụng cú CO
2

.
Sau 16-24 giờ, quan sát trên môi trờng thạch máu thấy các khuẩn
lạc của phế cầu khuẩn có vỏ: tròn, dẹt, nhỏ (0,5-1,5mm), không màu, có
xu hớng lõm giữa, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết màu xanh
(kiểu tan huyết alpha). Nếu quan sát khuẩn lạc ở thời gian sớm hơn (
14h) có thể thấy khuẩn lạc cha bị lõm giữa mà lại có đỉnh (là đặc điểm để
phân biệt giữa phế cầu có vỏ và không có vỏ). Lấy một khuẩn lạc cấy
thuần lại trên một đĩa thạch máu khác, ủ ấm 37
0
C/5% CO2/16 giờ, ngày
tiếp theo làm thêm các thử nghiệm sau để khẳng định (nếu chỉ thấy thuần
một loại khuẩn lạc thì không cần cấy thuần mà có thể làm luôn các bớc
khẳng định).
3.3.2. Các thử nghiệm xác định:
Thử nghiệm Optochin (nhạy cảm với optochin):
Cấy dày lên một đĩa thạch máu 5% vi khuẩn nghi ngờ là phế cầu, sau
đó đặt khoanh giấy optochin d = 6mm (chứa 5àg (mcg) chất
ethylhydrocupreine) lên, ủ 35-37
O
C/5% CO
2,
Sau 16-24 giờ nếu xung
quanh khoanh giấy không có vòng vô khuẩn có nghĩa đó chỉ là viridans
streptococci, nếu có vòng vô khuẩn có đờng kính 14mm là dơng tính
(là phế cầu), nếu vòng vô khuẩn từ 9-13mm phải làm thêm thử nghiệm
tan trong muối mật.
Thử nghiệm tan trong muối mật (Bile solubility):
1/ Từ nuôi cấy thuần và mới (16-24 giờ), tạo 0,5 ml canh khuẩn trong n-
ớc muối sinh lý tơng đơng độ đục > 0,5 Mc Farland.
2/ Chia đôi canh khuẩn vào 2 ống nghiệm (0,25ml/1 ống), sau đó cho

tiếp vào 1 ống canh khuẩn 0,25ml NaCl 0,9%, ống kia cho 0,25ml muối
mật 10% (deoxycholate), lắc nhẹ, ủ 35-37
0
C/ 2 giờ.
3/ Theo dõi sự ly giải tế bào vi khuẩn trong ống có muối mật sau 2 4
giờ ủ, nếu ống có muối mật trở nên trong, hết đục là dơng tính.
Nếu thực hiện trực tiếp thử nghiệm tan trong muối mật với khuẩn lạc
nghi ngờ ở trên thạch máu, phải sử dụng dung dịch sodium deoxycholate
2-10%, đọc kết quả sau 15-20 phút nếu là phế cầu khuẩn, khuẩn lạc sẽ
biến mất hoặc dẹt hẳn xuống do bị ly giải, trong khi khuẩn lạc khác
thuộc nhóm liên cầu nhng không phải phế cầu không bị muối mật tác
động.
Thử nghiệm ng ng kết trên phiến kính:
Dựa trên nguyên lý của phản ứng kết hợp kháng nguyên vỏ của
phế cầu với kháng thể đặc hiệu tơng ứng tạo sự ngng kết. Trên thị trờng
thơng mại các sinh phẩm sử dụng cho thử nghiệm ngng kết trên phiến
kính luôn có sẵn, giúp cho việc xác định các khuẩn lạc nghi ngờ có phải
là phế cầu hay không. Ví dụ, bộ kit Slidex Pneumo của Vitek Systems
Inc. hay Pneumoslide của BBL Microbiology Systems, Cockeysville,
MD. Phải thực hiện theo đúng hớng dẫn của Nhà sản xuất.
3.3.3. Xác định typ huyết thanh:
Hiện nay đã xác định đợc 90 typ huyết thanh của các chủng phế cầu
có vỏ gây bệnh. Ngời ta đã xếp thành 9 nhóm kháng huyết thanh đa giá,
đợc ghi theo thứ tự bằng chữ cái in hoa từ A đến I, mỗi nhóm có từ 4-7
kháng huyết thanh đơn giá đặc hiệu.
+ Thử nghiệm Quellung (nh trên): xác định đợc typ huyết thanh của
phế cầu (theo nhóm, hoặc theo typ đơn).
+ Ph ơng pháp định typ huyết thanh: qua các bớc sau
Nuôi cấy phân lập, thuần nhất vi khuẩn
Thử nghiệm optochin dơng tính

Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nớc muối sinh lý (> 0,5 Mc
Farland) hay canh khuẩn trong canh thang BHI có 5% máu (ủ 35-
37
0
C/5% C02/ 4-8 giờ)
Có thể bất hoạt vi khuẩn bằng nhỏ vài giọt Formalin vào canh
khuẩn trớc khi làm phản ứng với kháng huyết thanh (hoặc tạo huyền dịch
vi khuẩn trong dung dịch 0,5% formalin)
Lấy một phiến kính sạch, đặt lên 1 ăng (10àl) kháng huyết
thanh đa giá, sau đó đặt 1 ăng canh khuẩn đã bất hoạt bằng Formalin
(10àl), trộn đều, rồi lấy 1 lá kính mỏng (lamen) đậy lên.
Quan sát dới kính hiển vi với thị kính X10 và vật kính X 40,
điều chỉnh ánh sáng để thấy rõ hiện tợng "phình" của vỏ phế cầu bởi
phản ứng với kháng huyết thanh.
Khi đã có dơng tính với kháng huyết thanh đa giá, thử lần lợt
với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm để xác định typ huyết
thanh của chủng phế cầu đợc thử.
4. Tiêu chuẩn xác định phế cầu:
+ Hình thể khuẩn lạc trên môi trờng thạch máu 5% (có hay không
có gentamycin): tròn, nhỏ, dẹt, không màu, và có xu hớng lõm ở giữa (có
đỉnh khi quan sát sớm hơn 14 giờ nuôi cấy), môi trờng nuôi cấy xung
quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha (màu xanh ve).
+ Hình thể vi khuẩn: hình lỡi mác hay ngọn nến, nối đôi giống hình
cặp kính, cũng có thể đứng đơn hay tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram d-
ơng (xanh tím) nhng phải:
+ Nhạy cảm optochin: đờng kính vòng vô khuẩn 14mm
*Hoặc: ít nhạy cảm với optochin (đờng kính vòng vô khuẩn từ 9-13mm)
nhng tan trong muối mật, cũng kết luận là phế cầu khuẩn.
Không phải là phế cầu khuẩn khi:
- Không nhạy cảm với optochin

*Hoặc có vùng ức chế phát triển bởi optochin với đờng kính nhỏ hơn
14mm nhng không tan trong muối mật.
Sơ đồ phân lập Streptococus pneumoniae
Dịch đờng hô hấp (đờm, tăm bông ngoáy họng)


Nhuộm Gram
Quan sát tế bào, vi khuẩn

Xử lý bp (làm lỏng) và pha loãng bệnh
phẩm với NaCl 0,9%)


Cấyvào (1 trong 2) Thạch máu 5%
(2)
Thạch máu 5% có
Gentamycin 5ug/ml

Cấy thuần
Thạch máu 5%


Nhuộm Gram
xem hinh thể vi khuẩn

Thử nghiệm optochin
Tan trong muối mật 10%
(+): d 14mm (khi 9 <d
optochin
<13mm)

( ): 9 < d < 13mm
ủ 37
0
C/3 -5%CO
2
/16-24h
Cõu hi lng giỏ
1. Hóy trỡnh by kỹ thuật lấy bệnh phẩm, bảo quản và vận chuyển về phòng
thí nghiệm (để phân lập phế cầu)?
2. Hóy trỡnh by phng phỏp phõn lp ph cu t các loại bnh phm?
3. Hóy trỡnh by các thử nghiệm và tiờu chun xỏc nh ph cu?
Kế hoạch bài giảng
TT Nội dung Thời
gian
(phút)
PP giảng Vật liệu
giảng
dạy
Câu hỏi
lợng giá
Giảng
viên
1 Giới thiệu về
vi sinh vật
(phế cầu) và
nội dung
thực tập
60 Powerpoin
t
Máy

tính,
hoặc
bảng, bút
Mục tiêu
1
PGS. TS.
Phan Lê
Thanh
Hơng
2 Cách lấy
mẫu bệnh
phẩm, bảo
quản và vận
chuyển
60 Mô tả, mô
hình
Các
dụng cụ
lấy mẫu
Câu 1 PGS. TS.
Phan Lê
Thanh
Hơng
3 Giới thiệu
nội dung
thực tập đã
đợc chuẩn bị
sẵn dạng
giáo cụ trực
quan (về phế

cầu)
60 Hớng dẫn
phân tích
trên các
giáo cụ đã
đợc chuẩn
bị sẵn
Tiêu bản
nhuộm
Gram,
các loại
đĩa môi
trờng có
khuẩn
lạc, các
thử
nghiệm
định
danh
Câu 3 PGS. TS.
Phan Lê
Thanh
Hơng.
Ths.
Nguyễn
T. Hiền
Anh
4 Nuôi cấy,
phân lập vi
khuẩn phế

cầu từ bệnh
phẩm hô hấp
và dịch não
tủy
120 *Hớng dẫn
thực hành.
*Phân tích
kết quả.
*Giải đáp
thắc mắc
Các loại
sinh
phẩm,
dụng cụ
tiêu hao
Câu 2,3 PGS. TS.
Phan Lê
Thanh
Hơng
Ths.
Nguyễn
T. Hiền
Anh
Tài liệu tham khảo:
1. Hoàng Thủy Long (1991). Phế cầu khuẩn. Kỹ thuật Xét nghiệm Vi sinh vật Y
học. Nhà XBVH, 54-59.
2. Keizo Matsumoto and Tsuyoshi Nagatake (1994). Identification of
Streptococcus pneumoniae. Clinical Microbiology of Respiratory Infections.
Nagasaki University, 31-32
3. World Health Organization (1999). Identification of Streptococcus

pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by
N. meningitidis, S. pneumoniae and H. influenzae. 27-30.
Phụ lục
1. Chuẩn bị môi trờng nuôi cấy, phân lập phế cầu khuẩn:
1.1. Môi trờng thạch máu 5%: TSA + 5% máu (cừu, ngựa, thỏ)
Thạch máu 5% là môi trờng cơ bản đợc dùng để nuôi cấy cũng nh xác
định các tính chất của phế cầu (thử nghiệm optochin).
Tiêu chuẩn chất lợng:
Thạch máu 5% phải đảm bảo có màu đỏ tơi, nếu có màu đỏ đen (do cho máu vào
khi thạch còn quá nóng) hoặc loãng (do tỷ lệ hồng cầu trong máu thấp), nên loại
bỏ và pha chế lại.
Sau khi pha chế phải kiểm tra chất lợng của môi trờng bằng cách cấy chủng
chuẩn hoặc chủng đã đợc xác định là phế cầu (S. pneumoniae) lên đĩa thạch.
Khuẩn lạc mọc lên có hình dạng nhỏ màu xám hoặc xám xanh đợc bao quanh
bởi quầng tan huyết kiểu alpha (màu xanh ve).
Cách pha chế môi trờng thạch máu:
+ Cân TSA (Trypticase Soy agar) theo hớng dẫn của Nhà sản xuất.
Ví dụ: chuẩn bị 500ml thạch TSA, phải cân 20g TSA hoà trong 500ml nớc cất
(dùng bình có dung tích 1lít), đun nóng để hoà tan (hoặc sử dụng lò vi sóng). Hấp
121
0
C/15-20phút, để nguội đến 50
0
C, bổ xung 5% máu động vật (cừu, ngựa, hoặc
thỏ) đã chống đông (tách hết sợi tơ huyết bằng bi thuỷ tinh) vào, lắc đều nhẹ nhàng
rồi đổ đĩa (14ml/1 đĩa có d = 90mm), Khi thạch đã cứng và bay hết hơi nớc, gói kín
bằng nylon sạch hoặc sử dụng túi nylon để đựng, giữ ở 4
0
C .
1.2. Cách pha chế môi trờng vận chuyển và bảo quản (T-I Medium):

Môi trờng T-I là môi trờng 2 pha, thờng đợc sử dụng nh môi trờng nuôi cấy ban
đầu, bảo quản và vận chuyển một số loại vi khuẩn nh phế cầu, não mô cầu và
Haemophilus influenzae , nhất là từ bệnh phẩm dịch não tủy hoặc máu.
+ Sử dụng ống nghiệm có dung tích từ 10-20ml, có nút cao su và nút
nhôm đậy ngoài
+ Chuẩn bị dung dịch đệm cho cả 2 pha (lỏng và đặc): pha 1lít đệm
0,1M MOPS pH 7,2 nh sau: 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid: cân 20,93g,
cho vào 700ml nớc cất, điều chỉnh pH 7,2 bằng NaOH. Sau đó, bổ xung nớc cất vừa
đủ 1 lít.
+ Chuẩn bị pha đặc (solid phase):
Than hoạt tính (Activated charcoal): 2,0 g
Tinh bột (soluble starch) 2,5 g
Thạch (Agar Difco) 10,0 g
Hòa tan trong 500ml đệm MOPS, sử dụng thanh nam châm và máy khuấy từ
có nhiệt để làm tan agar và tinh bột. Khi đã tạo đợc huyền dịch, vẫn giữ môi trờng
trên máy khuấy từ có nhiệt, chia 2,5 5ml huyền dịch này vào các ống nghiệm,
đậy ống nghiệm bằng giấy thiếc (aluminium foil), xếp vào lồng kim loại để hấp ớt
121
0
C/20 phút. Sau đó, nhấc cả lồng kim loại ra khỏi nồi hấp ớt, đặt nghiêng cho
đến khi nhiệt độ ống nghiệm hạ thấp và môi trờng thạch đã đông lại trong ống
nghiệm ở vị trí nghiêng.
+ Chuẩn bị pha lỏng (liquid phase):
Tryptic soy broth 30,0 g
Gelatin (Difco) 10,0 g
Đệm MOPS 500ml
Đun nóng môi trờng này để làm tan chảy gelatin và tránh sự vón cục, hấp
ớt 121
0
C/15 phút.

Nếu để cấy máu (vận chuyển bệnh phẩm là máu), khi môi trờng này đã
nguội, bổ xung thêm SPS để chống màng máu (250 mg SPS hoà tan trong 5ml
MOPS, lọc vô khuẩn bằng filter có màng lọc kích thớc 0,22
à
)
Nếu có mục đích phát hiện H. influenzae từ bệnh phẩm, bổ xung thêm 1%
thể tích của cả 2 pha yếu tố hỗ trợ phát triển là Iso VitaleX.
Chia vào mỗi ống nghiệm (đã chứa môi trờng thạch nghiêng vừa đợc chuẩn
bị ở trên) 2,5 5 ml. Đậy chặt nút cao su và vặn chặt nắp nhôm bên ngoài. Cất ở
4
0
C. Môi trờng vận chuyển và bảo quản 2 pha này có thể giữ để dùng trong 2 năm
với điều kiện vặn chặt nút và giữ ở nhiệt độ 4
0
C. Trớc khi sử dụng, cần kiểm tra
tính vô trùng của loạt môi trờng và chất lợng của môi trờng bằng cách cấy vào
(hoặc không cấy) vài ống nghiệm chủng meningococci, ủ ở 35
0
C. Nếu môi trờng
đạt cả 2 điều kiện (vô khuẩn và chủng meningococci mọc đợc), làm ấm lại môi tr-
ờng bằng ủ ở 35 -37
0
C hoặc để môi trờng đạt tới nhiệt độ phòng (25 - 30
0
C) trớc
khi cấy bệnh phẩm vào.