Tiểu luận sự tinh chế và đặc điểm của serin protease từ khuẩn bacillus laterosporus AK1 kiềm,chịu nhiệt

Sự tinh chế và đặc điểm của
Sự tinh chế và đặc điểm của
serin protease từ khuẩn
serin protease từ khuẩn
Bacillus Laterosporus AK1
Bacillus Laterosporus AK1
kiềm,
kiềm,
chịu nhiệt
chịu nhiệt



Tóm tắt.
Tóm tắt.






Một loại protease kiềm , chịu nhiệt , ngoại bào phân lập từ Bacillus
Một loại protease kiềm , chịu nhiệt , ngoại bào phân lập từ Bacillus
Laterosporus _ AK1 được làm sạch bởi phương pháp lọc gel G – 200 và những
Laterosporus _ AK1 được làm sạch bởi phương pháp lọc gel G – 200 và những
kĩ thuật của phép sắc ký trao đổi ion cenlulo DEAE.
kĩ thuật của phép sắc ký trao đổi ion cenlulo DEAE.
Chế phẩm protease thể hiện độ hoạt động tương đối lớn 100% trong chất
Chế phẩm protease thể hiện độ hoạt động tương đối lớn 100% trong chất
nền cozein và xuất hiện như một vạch đơn dựa vào kĩ thuật điện di với phân tử

nền cozein và xuất hiện như một vạch đơn dựa vào kĩ thuật điện di với phân tử
khối 86.29 KDA. Hiệu suất thu hồi enzym protease đã được tinh sạch đến 11.1
khối 86.29 KDA. Hiệu suất thu hồi enzym protease đã được tinh sạch đến 11.1
lần đạt được 34.3%.
lần đạt được 34.3%.
Khoa nghiên cứu men chất lỏng cũng đã phát hiện ra một vùng thủy
phân hoàn toàn nhờ vào sự hoạt động phân giải protein. Điều này phù hợp với
vạch đơn đã thu được bằng phương pháp điện di.
Enzym protease có PH = 9 và thể hiện độ hoạt động mạnh nhất ở 75
0
C.
Khả năng hoạt động của enzym dễ bị ảnh hưởng bởi chất ức chế protease serin
đặc trưng PHSF khi có sự có mặt của protease serin cặn bả tại nơi hoạt động .Hoạt
động của enzyme mạnh lên khi có mặt các ion kim loại Ca
2+
và Mg
2+
và enzyme
này thích hợp với màng lọc sạch giữ ổn định 75% thậm chí 1 giờ trước khi vi
khuẩn phát triển.Chế phẩm protease chuyển sang màu đỏ máu hoàn toàn khi sử
dụng với chất tẩy rửa Wheel.

GIỚI THIỆU
Vi sinh vật ẩn dấu một sự đa dạng của enzym phân giải protein thuộc lớp thứ
tư .Nó cũng được tìm thấy trên cơ thể động vật có vú.
Protease có tính kiềm được sản xuất bởi Bacillus kiềm , chịu nhệt có thể
chịu đưng với nhiệt độ cao, pH, tác nhân làm biến tính hoá học và môi trường
không có nước.

Vài tác giả có báo cáo (cho rằng) sự sản xuất của protease kiềm ,chịu nhiệt bởi

khuẩn que Bacillus kiềm và trung tính thoe phương pháp tổ hợp trung gian.
Tuy nhiên có một vài báo cáo dựa trên sản phẩm của protease có tính kiềm bởi
khuẩn que Bacillus trong phương pháp nhân tạo.
Protease của vi khuẩn tiêu biểu cho một trong những lớp lớn nhất của những enzym
công nghiệp, khoản 40% tổng enzym bán ra trên thế giới . Vi khuẩn thể hiện tốt nhất
nguồn gốc của enzym bởi những nét đắc trưng của nó.

Ví dụ:
Ví dụ:




Sự rộng lớn hay tính đa dạng của hóa sinh, phát triển nhanh ,yêu cầu về không
Sự rộng lớn hay tính đa dạng của hóa sinh, phát triển nhanh ,yêu cầu về không
gian nuôi cấy hạn chế. Như là sự không ràng buộc nơi enzym có thể di truyền
gian nuôi cấy hạn chế. Như là sự không ràng buộc nơi enzym có thể di truyền
nguồn gốc để sinh sản ra enzym mới cho những ứng dụng khác nhau.
nguồn gốc để sinh sản ra enzym mới cho những ứng dụng khác nhau.
Mặc dù, sự khác nhau của sự phân giải protein và những vi khuẩn đã biết nhưng
chỉ một vài trong chúng cung cấp độ họat động (lớn) với những thành công trong
thương mại. Bacillus được khai thác một cách rộng lớn phục vụ cho sự sản xuất
protease.
Protease kiềm đựơc ứng dụng rộng rãi trong một vài ngành công nghiệp như là
thuốc làm sạch áo quần trong tiệm giặc ủi, sự thu hồi hoặc hòa tan protein, sự làm
mềm thịt, trong công nghiệp đồ da và các cơ sở tổng hợp nhân tạo.

Nói chung, protease kiềm là tế bào ngoài tự nhiên và tham gia vào quá trình lên
Nói chung, protease kiềm là tế bào ngoài tự nhiên và tham gia vào quá trình lên
men bởi vi sinh vật. Như vậy việc đơn giản quá trình sử lý của enzym được so sánh với

men bởi vi sinh vật. Như vậy việc đơn giản quá trình sử lý của enzym được so sánh với
những protease thu được từ thực vật và động vật một protease kiềm chịu nhiệt từ B.
những protease thu được từ thực vật và động vật một protease kiềm chịu nhiệt từ B.
Clausii phát triển trong môi trường trung gian Casein đậu tương, protein kiềm được
Clausii phát triển trong môi trường trung gian Casein đậu tương, protein kiềm được
sản xuất với số lượng đáng kể (15000 Uml
sản xuất với số lượng đáng kể (15000 Uml
-1
-1
).
).
Protease kiềm có những thuộc tính bất thường như chịu nhiệt độ tối thích 80
Protease kiềm có những thuộc tính bất thường như chịu nhiệt độ tối thích 80
0
0
C,
C,
PH = 11.5 tính tưong thích và độ bền có ý nghĩa quan trọng đến những chất hoạt động
PH = 11.5 tính tưong thích và độ bền có ý nghĩa quan trọng đến những chất hoạt động
bề mặt và những chất ôxi hóa (Ganesh Kumar và cộng sự 2004).
bề mặt và những chất ôxi hóa (Ganesh Kumar và cộng sự 2004).
Tuy nhiên, giá trị kinh tế lớn của protease đã thúc đẩy quá trình tìm kiếm protease mới
với những thuộc tính mới. Protease được dùng làm chất phụ gia, thuốc tẩy nên ổn định và
tích cực khi có mặt của thành phần thuốc tẩy như chất hoạt động bề mặt, chất xây dựng, tác
nhân tẩy trắng, chất lọc, chất làm mềm cách thức tăng trưởng khác nhau.
Enzym này được sử dụng như một thành phần tích cực trong sự phát triển của sản
phẩm sinh học như kính áp tròng trong suốt và cũng có hiệu quả trong việc làm sạch. Trong
nghiên cứu, hiện tại chúng tôi đang báo cáo về sự cô lập của vi khuẩn phân giải protein
Bacillus Laterospeorus AK1 từ sự phân trộn phân lập chất cặn bả và sự tinh chế của protease
kiềm.

Vật liệu và phương pháp.
Vật liệu và phương pháp.
Sephadex G – 200, DEAE là những chất ức chế enzym xenluloza và protease
Sephadex G – 200, DEAE là những chất ức chế enzym xenluloza và protease
được mua từ sigma của Mĩ và là phân tử đánh dấu cho sự phân tích điện di đạt
được mua từ sigma của Mĩ và là phân tử đánh dấu cho sự phân tích điện di đạt
được từ Genei Banglore, India. Tất cả các hóa chất khác cần thiết trong những
được từ Genei Banglore, India. Tất cả các hóa chất khác cần thiết trong những
bước phân lập.
bước phân lập.
Sự phân lập Bacillus Laterosporus – AK1.

Những mẫu đất thu thập được từ sự phân hủy chất hữu cơ tại Ariyalur, Tamiler Nadu,
ẤnĐộ ,được pha loãng trong dung dịch muối vô trùng. Những mẫu đã pha loãng được
đặt ở trong môi trường thạch sữa bao gồm: dung dịch protein 0.1% dung dịch Nacl
0.5%, ván sữa 10% và thạch sữa 2.0%. Những đĩa đó được ủ ở nhệt độ 600
o
C trong
vòng 24h.
Khi sữa đã thủy phân hoàn toàn thì bổ sung thêm enzym protease đã được xác
định là sản phẩm của cơ thể sinh vật. Dựa vào vùng phát quang, một dòng vi khuẩn sẽ
được chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.Dòng vi khuẩn phân giải protein là một bào
tử có dạng Gram dương được xác định như loài B .laterosporus và nó có cấu trúc như B.
laterosporus- AK1( Holt và cộng sự 1994.).



Sản xuất enzyme
Sản xuất enzyme

.
.


Qúa trình sản xuất enzym protease bởi Bacillus Laterosporus được thực hiện
Qúa trình sản xuất enzym protease bởi Bacillus Laterosporus được thực hiện
trong môi trường trung gian chứa các chất sau: dung dịch Glucoza 0.5% dung dịch
trong môi trường trung gian chứa các chất sau: dung dịch Glucoza 0.5% dung dịch
sucrose 1.0% dung dịch K
sucrose 1.0% dung dịch K
2
2
HPO
HPO
4
4
0.05%, dung dịch MgSO
0.05%, dung dịch MgSO
4.
4.
7H
7H
2
2
O 0.05%, dung dịch
O 0.05%, dung dịch
Nacl 0.02% dung dịch CaCl
Nacl 0.02% dung dịch CaCl

2.
2.
H
H
2
2
O 0.05% với PH = 9 và duy trì ở nhiệt độ 37
O 0.05% với PH = 9 và duy trì ở nhiệt độ 37
0
0
C trong
C trong
48h trong tủ định ôn (120rpm). Sau khi hoàn thành quá trình lên men toàn bộ men
48h trong tủ định ôn (120rpm). Sau khi hoàn thành quá trình lên men toàn bộ men
cho li tâm ở 1000g tại 4
cho li tâm ở 1000g tại 4
0
0
C và dịch nỗi lên trên bề mặt được thu lại và sử dụng như
C và dịch nỗi lên trên bề mặt được thu lại và sử dụng như
một nguồn enzym.
một nguồn enzym.
Sự phân tích enzyme và xác định protein.
Sự hoạt động của enzym protease kiềm được xác định bằng phương pháp
củaTruchia và công sự (1986). Mỗi lần hoạt động của enzym protease được định nghĩa
bằng một lượng enzym cần thiết để phân giải một μ mol tryrosine trong 30 phút ở nhiệt
độ 45
0
C. Hoạt động đặc biệt này được mô tả bằng những đơn vị/mg protein. Số lượng
protein của mẫu được xác định bằng phương pháp nhuộm liên kết của Brad –for (1976)

sử dụng huyết thanh gia súc làm tiêu chuẩn chuẩn.
Trong những bước lọc sắc kí hàm lượng protein xác định bởi sự hấp thụ ánh
sáng tại bước sóng 280nm.


Sự kết tủa
Sự kết tủa
aceton
aceton
Như đã mô tả ở trên, khuẩn Bacillus Laterosporus AK1 lớn lên trong khoảng
Như đã mô tả ở trên, khuẩn Bacillus Laterosporus AK1 lớn lên trong khoảng
36h và những tế bào của nó đựợc tách ra bởi phép li tâm (10.000 x g, 15 phút).
36h và những tế bào của nó đựợc tách ra bởi phép li tâm (10.000 x g, 15 phút).
Protease nỗi lên trên mặt được kết tủa với 70% axêton. Tất cả những bước kế tiếp của
Protease nỗi lên trên mặt được kết tủa với 70% axêton. Tất cả những bước kế tiếp của
quá trình tinh chế đều xảy ra ở nhiệt độ 4
quá trình tinh chế đều xảy ra ở nhiệt độ 4
0
0
C. Protein được tách lơ lững trong 0.05M hệ
C. Protein được tách lơ lững trong 0.05M hệ
đệm Tris HCl, độ PH = 0.9 và được thẩm tách ngược lại qua cùng một hệ đệm.
đệm Tris HCl, độ PH = 0.9 và được thẩm tách ngược lại qua cùng một hệ đệm.
Phép lọc sắc ký chất Gel sephadex G – 200
Protein đã kết tủa sẽ được chuyền đến một cột lọc chất làm đông có chứa chất
Gel sephadex G – 200 (1.5x24cm) và được cân bằng với bộ đệm Tris – HCl. Cột này được
tách rửa với tốc độ chảy 40ml/h với cùng một bộ đệm.
Từ những mô tả sơ lược về phép tách rửa, người ta quan sát được rằng chất protease bị
tách rửa ra như một đỉnh riêng lẻ. Những phần hoạt động được tổ hợp, thẩm tích và cô đặc
lại bằng phương pháp đông khô.

Mẫu enzym đã cô đặc được đưa lên một cột phản ứng trao đổi ion của xenluloza.
DEAE (2.5cm x 22cm),được cân bằng với 50 M Tris HCl, độ PH = 9 và được làm sạch cùng
với cùng một bộ đệm.
.
Tinh chế enzyme

Phương pháp điện di chất Gel SDS –
Phương pháp điện di chất Gel SDS –
polyacrylamide.
polyacrylamide.
Theo phương pháp của laemmh (1970) SDS – PAGE được thực hiện trên một
Theo phương pháp của laemmh (1970) SDS – PAGE được thực hiện trên một
tấm Gel đặc quánh chứa 8% (W/v) polyacrylamide. Theo phương pháp của Davis
tấm Gel đặc quánh chứa 8% (W/v) polyacrylamide. Theo phương pháp của Davis
(1964), PAGE tự nhiên được thực hiện trong chất Gel đặc quánh chứa 8% (W/v)
(1964), PAGE tự nhiên được thực hiện trong chất Gel đặc quánh chứa 8% (W/v)
polyacrylamide với bộ đệm Tris/Glyxin, độ Ph = 8.3.
polyacrylamide với bộ đệm Tris/Glyxin, độ Ph = 8.3.
Theo mô tả của Heusen và Dowdle (1980): protein được phát hiện có màu bạc
việc nghiên cứu Gel genlatin được thực hiện trong một tấm Gel đặc quánh polyacrylamide
chứa SDS và genlatin (0.1%) như một chất được trùng hợp hóa (như sự mô tả của Heusen
và Dowdle). Sau khi điện di chất Gel đặc quánh sẽ được làm trong Triton X – 100 (2.5%
v/v) trong 1 giờ ở nhiệt độ 40C để loại SDS và được ủ trong 0.05M bộ đệm Tris – HCl, độ
Ph = 9 trong 5 giờ ở nhiệt độ 50
0
C. Sau đó chúng được nhuộm màu xanh Coomass rực rỡ.
Nhóm những phần hoạt động được quan sát như một vùng genlatin không
màu,trong suốt nỗi bật trên nền màu xanh.
Enzyme được tách rửa như một đường thẳng tuyến tính của 0 – 0.5M NaCl trong
cùng một bộ đệm. Mỗi phần 3ml được tập hợp lại với tốc độ chảy 30ml/h bằng cách

dùng một máy tổng hợp từng phần tự động (máy tổng hợp từng phần LKB 7000
U/tra). Hàm lượng protein của một phần được đọc ở 280nm. Những phần protease
hoạt động sẽ được tổng hợp, thẩm tách và cô đặc lại bằng phương pháp đông khô và
được sử dụng cho những phân tích sâu hơn về sau



Đặc điểm của enzyme
Đặc điểm của enzyme


protease
protease


Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme
.
.


Nhiệt độ tối thích dành cho hoạt độ của chế phẩm protease được xác
Nhiệt độ tối thích dành cho hoạt độ của chế phẩm protease được xác
định bằng thí nghiệm nuôi cấy enzyme ở những nhiệt độ khác nhau trong
định bằng thí nghiệm nuôi cấy enzyme ở những nhiệt độ khác nhau trong
khoảng từ 40 đến 100 trong môi trường dung dịch đệm 50mM Tri-HCl trong
khoảng từ 40 đến 100 trong môi trường dung dịch đệm 50mM Tri-HCl trong
thời gian 30 phút.khả năng chịu nhiệt của enzyme được duy trì ổn định khi nuôi
thời gian 30 phút.khả năng chịu nhiệt của enzyme được duy trì ổn định khi nuôi
cấy trong môi trường có cùng dung dịch đệm,trong 30 phút, ở các nhiệt độ khác

cấy trong môi trường có cùng dung dịch đệm,trong 30 phút, ở các nhiệt độ khác
nhau (40-100
nhau (40-100
o
o
C).
C).
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme.
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme.


Ảnh hưởng của ph đến hoạt tính của enzyme protease được xác dịnh bằng
Ảnh hưởng của ph đến hoạt tính của enzyme protease được xác dịnh bằng
phương pháp nuôi cấy enzyme tại 40 trong 30 phút tại các giá trị ph khác nhau.
phương pháp nuôi cấy enzyme tại 40 trong 30 phút tại các giá trị ph khác nhau.
để làm môi trường nuôi cấy người ta sử dụng các hệ đệm (nồng độ 0.05)
để làm môi trường nuôi cấy người ta sử dụng các hệ đệm (nồng độ 0.05)
sau:phosphate (ph 5.0-7.0),Tri-Hcl (ph 8.0-10.0) và glycine-NaOH (ph 11-12).
sau:phosphate (ph 5.0-7.0),Tri-Hcl (ph 8.0-10.0) và glycine-NaOH (ph 11-12).


hoạt động của enzyme được duy trì ổn định khi nuôi cấy trong 30 phút,trong các
hoạt động của enzyme được duy trì ổn định khi nuôi cấy trong 30 phút,trong các
dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau (5.0-12.0) tại 40
dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau (5.0-12.0) tại 40
o
o
C .
C .

Ảnh hưởng của ion kim loại và chất ức chế hoạt tính của enzyme.
Ảnh hưởng của ion kim loại và chất ức chế hoạt tính của enzyme.


Ảnh hưởng của các ion kim loại như: Ca
Ảnh hưởng của các ion kim loại như: Ca
2+
2+
, Na
, Na
2+
2+
, Hg
, Hg
2+
2+
và EDTA được khảo sát
và EDTA được khảo sát


khi trộn chúng lại thành một lượng 5mM và ủ ở nhiệt độ 40
khi trộn chúng lại thành một lượng 5mM và ủ ở nhiệt độ 40
o
o
C,thời gian 30 phút
C,thời gian 30 phút
dưới điều kiện chuẩn của thí nghiệm.Sự ảnh hưởng của 2mM chất ức chế protease
dưới điều kiện chuẩn của thí nghiệm.Sự ảnh hưởng của 2mM chất ức chế protease

khác nhau như: phenyl methyl sulphonyl flouride (PMSF),ethylene diamine tetra
khác nhau như: phenyl methyl sulphonyl flouride (PMSF),ethylene diamine tetra
acetic acid (EDTA), 2-mercaptoethanol và idoacetate được xác định bằng phương
acetic acid (EDTA), 2-mercaptoethanol và idoacetate được xác định bằng phương
pháp nuôi cấy enzyme trong 30 phút ở 40
pháp nuôi cấy enzyme trong 30 phút ở 40
o
o
C trước khi thêm chất nền.Hoạt động
C trước khi thêm chất nền.Hoạt động
liên quan được xác định dưới điều kiện chuẩn của thí nghiệm.
liên quan được xác định dưới điều kiện chuẩn của thí nghiệm.
Tính chất đặc trưng của chất nền.
Hoạt tính của protease với chất nền protein khác như: casein, Azocasein, BSA,
Egg albumin và Galatin được phân tích bởi sự pha trộn 10µg Của enzyme và 200µl của
phép phân tích hệ đệm có chứa chất nền (2mg /ml) . Phản ứng của hỗn hợp được xảy ra
ở 40oC trong 30 phút dưới điều kiện chuẩn của phép phân tích.

Độ bền của chất tẩy rửa.
Độ bền của chất tẩy rửa.


Chất tẩy rửa được pha loãng đến nồng độ 8mg/ml phù hợp với điều kiện tẩy
Chất tẩy rửa được pha loãng đến nồng độ 8mg/ml phù hợp với điều kiện tẩy
rửa của Phadtare và cộng sự (1993). Sự tương thích của protease được kiểm tra
rửa của Phadtare và cộng sự (1993). Sự tương thích của protease được kiểm tra
với các chất tẩy rửa trong nghành thương mại đó là: ariel, Surf Excel, Tide và
với các chất tẩy rửa trong nghành thương mại đó là: ariel, Surf Excel, Tide và
Hekô .Chế phẩm protease có nồng độ 0,04mg/ ml được ủ ở 60
Hekô .Chế phẩm protease có nồng độ 0,04mg/ ml được ủ ở 60

o
o
C trong những
C trong những
chất tẩy rửa thương mại khác nhau với mỗi giai đoạn là 60 phút. Trong khoảng
chất tẩy rửa thương mại khác nhau với mỗi giai đoạn là 60 phút. Trong khoảng
10 phút thì hoạt tính của protease được xác định. Không phải chất tẩy rửa nào
10 phút thì hoạt tính của protease được xác định. Không phải chất tẩy rửa nào
cũng được ủ ở cùng điều kiện .
cũng được ủ ở cùng điều kiện .
Kiểm tra việc tẩy rửa với protease đã được chuẩn bị
Kiểm tra việc tẩy rửa với protease đã được chuẩn bị


Hiệu qủa của chế phẩm protease (3,000U/ml) được xem xét bởi sự pha trộn
Hiệu qủa của chế phẩm protease (3,000U/ml) được xem xét bởi sự pha trộn
với chất tẩy rửa thương mại như Wheel và nó được sử dụng trong loại vải cotton
với chất tẩy rửa thương mại như Wheel và nó được sử dụng trong loại vải cotton
trắng cỡ (4 × 4cm) được nhuộm với màu đỏ máu.
trắng cỡ (4 × 4cm) được nhuộm với màu đỏ máu.


Chúng được ngâm trong: (a) nước cất 100ml, (b) 100ml nước cất + 1ml chất
Chúng được ngâm trong: (a) nước cất 100ml, (b) 100ml nước cất + 1ml chất
tẩy rửa có nồng độ 7mg/ml, + ml enzyme hoà tan. Sau đó mẫu được ủ ở 60
tẩy rửa có nồng độ 7mg/ml, + ml enzyme hoà tan. Sau đó mẫu được ủ ở 60
o
o
C
C

trong 15 phút và được rửa bằng nước sạch một cách kĩ lưỡng với nước cất và
trong 15 phút và được rửa bằng nước sạch một cách kĩ lưỡng với nước cất và
được sấy khô . Xem xét kĩ bằng mắt những mẫu khác nhau đã làm.
được sấy khô . Xem xét kĩ bằng mắt những mẫu khác nhau đã làm.



Những kết quả và thảo luận.
Những kết quả và thảo luận.
Khuẩn que Laterosporus –AK1 cho thấy sự phát
Khuẩn que Laterosporus –AK1 cho thấy sự phát
triển cực đại và sự sản xuất enzyme lớn nhất
triển cực đại và sự sản xuất enzyme lớn nhất


trong 36 giờ . Khi cho vào môi trường
trong 36 giờ . Khi cho vào môi trường
trung gian ở nhiệt độ phòng . Vi khuẩn này
trung gian ở nhiệt độ phòng . Vi khuẩn này
có mặt trong khu vực thuỷ phân trong
có mặt trong khu vực thuỷ phân trong
.môi trường trung gian thạch sữa.
.môi trường trung gian thạch sữa.
Sự tinh chế protease ngoại bào
Sự tinh chế protease ngoại bào
của B. Laterosporus- AK1.
của B. Laterosporus- AK1.
Tóm tắt các bước tinh chế tiếp theo
Tóm tắt các bước tinh chế tiếp theo
của protease kiềm

của protease kiềm


t hời gian ủ bệnh
t hời gian ủ bệnh


từ B. laterosposus- AK1
từ B. laterosposus- AK1


Fig1
Fig1
:Thời gian xảy ra của quá trình sản xuất protease
:Thời gian xảy ra của quá trình sản xuất protease
và
và
được
được


thể hiện ở bảng dưới
thể hiện ở bảng dưới
quá trình phát triển của B. laterosporus .
quá trình phát triển của B. laterosporus .
.
.

.
.

Bảng 1
Bảng 1
. Tóm tắt qúa trình tinh chế của protease kiềm từ B. Laterosporus-
. Tóm tắt qúa trình tinh chế của protease kiềm từ B. Laterosporus-
AK1.
AK1.
Sno các bước tổng độ tổng số hoạt động tinhchế Kết quả
Sno các bước tổng độ tổng số hoạt động tinhchế Kết quả


hoạt động đặc trưng
hoạt động đặc trưng


tinh chế tuyệt đối (U) protein(mg) (U/mg protein) fold được
tinh chế tuyệt đối (U) protein(mg) (U/mg protein) fold được
đạt
đạt
1.Nuôi cấy bề mặt 32400 452 71,6 1 100
1.Nuôi cấy bề mặt 32400 452 71,6 1 100
2.Kết tủa axeton 24230 120 201,9 2,8 74,7
2.Kết tủa axeton 24230 120 201,9 2,8 74,7
3. Sephadex 200 17840 32 557,6 7,7 55,0
3. Sephadex 200 17840 32 557,6 7,7 55,0
4. DEAE cellulose 11145 14 796,0 11,1 34,3
4. DEAE cellulose 11145 14 796,0 11,1 34,3



Xấp xỉ 11,1 folds của sự tinh chế được thực hiện từ sự nuôi cấy vi khuẩn

Xấp xỉ 11,1 folds của sự tinh chế được thực hiện từ sự nuôi cấy vi khuẩn
ban đầu với mức cuối cùng là 34,4%. Độ hoạt động đặc trưng của chế phẩm
ban đầu với mức cuối cùng là 34,4%. Độ hoạt động đặc trưng của chế phẩm
enzyme là 796 U/mg .
enzyme là 796 U/mg .
SDS-PAGE của chế phẩm protease từ B. AK1.
SDS-PAGE của chế phẩm protease từ B. AK1.


Chế phẩm protease được biểu hiện bằng một vạch đơn xuyên qua SDS-
Chế phẩm protease được biểu hiện bằng một vạch đơn xuyên qua SDS-
PAGE là dấu hiệu của sự chuẩn bị đồng nhất . Khối lượng phân tử của protease
PAGE là dấu hiệu của sự chuẩn bị đồng nhất . Khối lượng phân tử của protease
được xác định bởi sự so sánh khoảng di chuyển với mốc chuẩn.Khối lượng phân
được xác định bởi sự so sánh khoảng di chuyển với mốc chuẩn.Khối lượng phân
tử của protease bằng 86,29 Kda vầ việc nghiên cứum hoạt động tạo màucũng đã
tử của protease bằng 86,29 Kda vầ việc nghiên cứum hoạt động tạo màucũng đã
phát hiện một phần thuỷ phân hoàn toàn của hoạt động phân giải lại protein
phát hiện một phần thuỷ phân hoàn toàn của hoạt động phân giải lại protein
trên nền màu xanh.(fig2). Tuy nhiên Nagano và To (2000) báo cáo rằng có một
trên nền màu xanh.(fig2). Tuy nhiên Nagano và To (2000) báo cáo rằng có một
collagenolytic từ B. FS2 có phân tử khối 125 KDa
collagenolytic từ B. FS2 có phân tử khối 125 KDa


Fig2
Fig2
:
:
SDS- PAGE và việc nghiên cứu của chế phẩm protease

SDS- PAGE và việc nghiên cứu của chế phẩm protease


Vạch1: chế phẩm protease
Vạch1: chế phẩm protease


Vạch 2: phân tử khối chuẩn .
Vạch 2: phân tử khối chuẩn .


Vạch 3:nghiên cứu hoạt tính chế phẩmenzyme
Vạch 3:nghiên cứu hoạt tính chế phẩmenzyme

Tính chất đặc trưng của chế phẩm
Tính chất đặc trưng của chế phẩm
enzyme
enzyme
Nhiệt độ tối thích và độ bền:
Nhiệt độ tối thích và độ bền:


Protease thể hiện độ hoạt động cực đại ở 75
Protease thể hiện độ hoạt động cực đại ở 75
o
o
C
C

Ngược lại, Bacillus clussi thể hiện
Ngược lại, Bacillus clussi thể hiện
độ hoạt động cực đại ở 80
độ hoạt động cực đại ở 80
o
o
C vì
C vì
nó là protease kiềm tính chịu nhiệt và
nó là protease kiềm tính chịu nhiệt và
Bacillus sp B21-2 thể hiện độ hoạt động
Bacillus sp B21-2 thể hiện độ hoạt động
tối thích ở 60
tối thích ở 60
o
o
C(Granesh Kumar và cộng sự, 2004.
C(Granesh Kumar và cộng sự, 2004.
Fujiwara và Yamamoto, 1987). Protease bền
Fujiwara và Yamamoto, 1987). Protease bền


trong khoảng rộng từ 55
trong khoảng rộng từ 55
o
o
C-80
C-80
o
o

C, nhưng nhanh chóng
C, nhưng nhanh chóng
giảm ở nhiệt độ cao hơn, độ bền này cao hơn một ít
giảm ở nhiệt độ cao hơn, độ bền này cao hơn một ít


so với protease kiềm tính. TheoKahayashi nhiệt độ (
so với protease kiềm tính. TheoKahayashi nhiệt độ (
o
o
C)
C)
và cộng sự : một protease kiềm tính từ
và cộng sự : một protease kiềm tính từ


Fig3
Fig3


Ảnh
Ảnh


hưởng của nhiệt
hưởng của nhiệt


độ khác nhau
độ khác nhau

BacilusspKSM- K16
BacilusspKSM- K16
đên
đên


độ hoạt động và độ bền của protease
độ hoạt động và độ bền của protease






thể hiện độ bền ở 50
thể hiện độ bền ở 50
o
o
C.
C.

PH tối thích và độ bền
PH tối thích và độ bền
PH tối thích để chế phẩm protease hoạt động
PH tối thích để chế phẩm protease hoạt động


cực đại là pH=9

cực đại là pH=9
Một và báo cáo chỉ ra rằng pH tối thích cho,
Một và báo cáo chỉ ra rằng pH tối thích cho,
protease thu dược từ Xanthononas maltophila
protease thu dược từ Xanthononas maltophila


vibrio metscnikovii
vibrio metscnikovii


là10,0 – 10,5, protease tương đối bền trong khoảng
là10,0 – 10,5, protease tương đối bền trong khoảng


pH :7,0- 12,0.Enzyme thô thể hiện độ hoạt động
pH :7,0- 12,0.Enzyme thô thể hiện độ hoạt động


tương đối giống với chế phẩm enzyme độ pH
tương đối giống với chế phẩm enzyme độ pH
khi nhìn ở khía cạnh pH
khi nhìn ở khía cạnh pH




Fig 4:
Fig 4:
Ảnh hưởng của pH khác

Ảnh hưởng của pH khác
.
.
nhau lên độ
nhau lên độ


hoạt động và độ bền của
hoạt động và độ bền của
protease
protease
Tác động của ion kim loại và những chất ức chế.
Hầu hết các ion kim loại được thử nghiệm có tác động kích thích hoặc tác động ức chế
nhẹ lên hoạt động của enzyme. Những ion kim loại như Ca2+ , Mg2+ làm tăng và làm ổn
định hoạt động của protease .Điều này xảy ra được là nhờ sự kích thích hoạt động của các
ion kim loại này. Ngược lại những ion kim loại khác như: Na2+, Mg2+ và EDTA ức chế
nhẹ đến độ hoạt động của enzyme.Những cation làm tăng tính bền nhiệt của protease thu
được từ khuẩn que. Những kết quả này chỉ ra rằng những ion kim loại bảo vệ enzyme
chống lại sự biến tính do nhiệt và đóng một vai trò thiết yếu trog việc duy trì hoạt động ổn
định của enzyme ở nhiệt độ cao.( Pan và Lin; Steele và cộng sư 1992 ).



Nghiên cứu sự ức chế mang lại những hiểu biết sâu sắc
Nghiên cứu sự ức chế mang lại những hiểu biết sâu sắc


về bản chất của enzyme, về những điều kiện cần thiết
về bản chất của enzyme, về những điều kiện cần thiết
Ion kim loại nồng độ tỉ lệ hoạt

Ion kim loại nồng độ tỉ lệ hoạt
động
động


và chất ức chế của enzyme
và chất ức chế của enzyme
của nhóm ngoại và về bảnchất
của nhóm ngoại và về bảnchất
của trung tâm hoạt động . Trong những chất ức chế
của trung tâm hoạt động . Trong những chất ức chế
khác nhau thì iodoacetate gây
khác nhau thì iodoacetate gây


ức chế mạnh nhất đến độ hoạt động của enzyme.
ức chế mạnh nhất đến độ hoạt động của enzyme.
Kế đến là 2-mercaptoethanol và EDTA (bảng 2).
Kế đến là 2-mercaptoethanol và EDTA (bảng 2).
Tuy nhiên PMSM cũng gây ức chế hoàn toàn .
Tuy nhiên PMSM cũng gây ức chế hoàn toàn .
Sự hoạt động của enzyme, nó đặc trưng cho hệ
Sự hoạt động của enzyme, nó đặc trưng cho hệ
Enzyme- cơ chất Serin protease. Điều này đã được
Enzyme- cơ chất Serin protease. Điều này đã được
nhận xét bởi Adinrayana và Ellaiah(2003) , North (1982),
nhận xét bởi Adinrayana và Ellaiah(2003) , North (1982),
Uchida và cộng sự (2004).
Uchida và cộng sự (2004).
Sự thuỷ phân của chất nền protein

Sự thuỷ phân của chất nền protein




Chất nền đặc trưng của protease được tìm thấy với số lượng lớn khi
Chất nền đặc trưng của protease được tìm thấy với số lượng lớn khi
casein được sử dụng làm chất nền . Tiếp theo là Azocasein (85%), albumin của trứng
casein được sử dụng làm chất nền . Tiếp theo là Azocasein (85%), albumin của trứng
(58%), BAS (52%) và gelatin (22%) tương ứng.Tương tự protease kiềm thu được từ
(58%), BAS (52%) và gelatin (22%) tương ứng.Tương tự protease kiềm thu được từ
B. stearothermophilus F1 và Bcillus sp K5M-K16 được công bố từ độ hoạt động cao
B. stearothermophilus F1 và Bcillus sp K5M-K16 được công bố từ độ hoạt động cao
nhất về casein (theo Kobayashi và cộng sự 1995 ).
nhất về casein (theo Kobayashi và cộng sự 1995 ).

Tính tương thích với thuốc tẩy.
Độ phân giải protein của B. laterosporus-AK1
được khảo sát khi có mặt của những chất tẩy rửa
thương mại khác nhau ở pH =9 và tại nhiệt độ
60oCtrong 60 phút . Cứ 10 phút khảo sát một lần .
Protein thích hợp với tất cả các loại thuốc tẩy .
Tuy nhiên , khả năng hoạt động của protease thời gian ủ bệnh
giữa những chất tẩy rửa khác nhau thay đổi Fig5: Mối tương thích của protease
kiềm
ở từng giai đoạn.Độ hoạt động của Ariel với chất tẩy rửa thương mại ở pH =9
được giữ lại 75% , của Henko 63% Surfexcel 43% vàTide38%Anwar và Mohammed
(2000) cũng tìm thấy protease kiềm từ Spilosoma obliqua, thể hiện hoạt tính đến 70% khi
có mặt chất tẩy rửa thương mại. Protease được sản xuất bởi sự phân lập V. laterosporus-
AK1 ổn định trong khoảng pH và nhiệt độ lớn và thể hiện tính tương thích với các chất tẩy

rửa thương mại khác nhau được kiểm nghiệm .Sự bổ sung của enzyme trong chất tẩy rửa
Wheel đã cải thiện khả năng làm sạch vết đỏ máu (fig6) .

Những báo cáo ban đầu được làm trên sự bổ sung của enzyme với chất tẩy Wheelcó
Những báo cáo ban đầu được làm trên sự bổ sung của enzyme với chất tẩy Wheelcó
ý nhĩa cải thiện việc làm sạch và loại bỏ vết đỏ máu ( theo Adinarayanavaf cộng
ý nhĩa cải thiện việc làm sạch và loại bỏ vết đỏ máu ( theo Adinarayanavaf cộng
sự 2003).
sự 2003).




Fig6
Fig6
:
:
Khả năng của protease được tăng lên với chất tẩy rửa Wheel trong việc
Khả năng của protease được tăng lên với chất tẩy rửa Wheel trong việc
làm sạch
làm sạch
.
.


(A). Vết đỏ máu trên áo quần được làm sạch với nước
(A). Vết đỏ máu trên áo quần được làm sạch với nước


(B).Vết đỏ máu trên áo quần được làm sạch với chất tẩy rửa.

(B).Vết đỏ máu trên áo quần được làm sạch với chất tẩy rửa.


(C). Vết đỏ máu trên áo quần được làm sạch với sự kết hợp giữa chất tẩy
(C). Vết đỏ máu trên áo quần được làm sạch với sự kết hợp giữa chất tẩy
rửa
rửa


Wheel và enzyme
Wheel và enzyme









Kết luận
Kết luận




Protease kiềm được phân lập từ B. laterosporus-AK1 là một
Protease kiềm được phân lập từ B. laterosporus-AK1 là một
protease chịu nhiệt . Nó có những thuộc tính mong muốn như: Sự ổn
protease chịu nhiệt . Nó có những thuộc tính mong muốn như: Sự ổn

định tại pH kiềm , nhiệt độ cao , loại chất nền lớn và tính tương thích vơí
định tại pH kiềm , nhiệt độ cao , loại chất nền lớn và tính tương thích vơí
chất tẩy rửa thương mại . Những thuộc tính này cho biết công dụng của
chất tẩy rửa thương mại . Những thuộc tính này cho biết công dụng của
protease trong công nghiệp tẩy rửa .
protease trong công nghiệp tẩy rửa .
Lời cảm ơn
Lời cảm ơn


Chúng tôi xin chân thành cám ơn: Giáo sư N. Anand, D. Sc.,
Chúng tôi xin chân thành cám ơn: Giáo sư N. Anand, D. Sc.,


giám đốcCAS trường đại học Thực vật học Madras đã cung cấpcho
giám đốcCAS trường đại học Thực vật học Madras đã cung cấpcho
phòng thí nghiệm những phương tiện cho sự nghiên cưú này .
phòng thí nghiệm những phương tiện cho sự nghiên cưú này .