Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN ppt

Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN

Kỹ thuật lai ADN đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ
của nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi
các tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không
thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp
khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các kỹ thuật lai hay
định typ. Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn ADN đích một
cách nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân gene PCR.
a. Kỹ thuật nhân gene PCR (Polymerase Chain Reaction)
Việc nhân ADN cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn
nữa đối với đoạn ADN hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương pháp khác nhau để
phân tích nguồn ADN khuyếch đại theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất là
sử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xác
định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc
hiệu đã được đánh dấu. Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được
trình tự ADN và ARN của sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi
ADN sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật
nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự ADN còn cho phép xác định mối liên hệ tiến
hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật.
- Đôi nét về phản ứng chuỗi PCR:
Phản ứng chuỗi PCR nhằm khuyếch đại ADN lần đầu tiên được Saki (1985)
giới thiệu và đây được coi là một trong những tiến bộ khoa học quan trọng nhất về
sinh học trong thập kỷ 80. Phản ứng PCR sử dụng enzym chịu nhiệt tạo ra nhiều
phiên bản theo hàm số mũ. Có thể ví dụ, chỉ cần 1 sợi ADN sau vài giờ có thể
nhân lên 10
11
phiên bản ADN tương đương với 100 ng ADN. Sau khi thực hiện
phản ứng PCR thì cần tiến hành một số kỹ thuật để xác định sản phẩm, đơn giản
nhất là điện di và xác định kích thước của sản phẩm PCR. Trong các nghiên cứu
chẩn đoán thì kết quả này rất có ý nghĩa, nó chứng tỏ sự có mặt của ADN đích

trong mẫu nghiên cứu. Có thể nhận được tính đặc hiệu và độ nhạy cao hơn khi sử
dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR hoặc lai với mẫu dò đặc hiệu. Tuy nhiên,
thông tin đầy đủ nhất vẫn là kết quả xác định trình tự ADN của sản phẩm PCR.
Ngay từ khi được giới thiệu thì PCR đã được xem là phương pháp đưa lại kết
quả khá nhạy trong việc xác định và phát hiện vi sinh vật. Tính ưu việt của nó thể
hiện ở chỗ có thể chỉ cần một hạt virus hay một tế bào vi khuẩn nào đó cũng đủ
cho phản ứng xảy ra và khuyếch đại tới mức có thể phát hiện được trong thời gian
ngắn. Kỹ thuật PCR còn được dùng để nhân ADN từ khuôn RNA sau khi đã được
chuyển thành cDNA sau phản ứng phiên mã ngược (RT). Phương pháp này nhanh
chóng được chú ý và trở lên phổ biến cho các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn hay
virus ở nồng độ thấp trong các mẫu môi trường và bệnh phẩm. Ví dụ việc phát
hiện mẫu máu nhiễm HIV có nghĩa là phát hiện phần nhỏ ADN của virus trong hệ
gene người có kích thước gấp 100 000 lần. Mặt khác khi dùng kỹ thuật miễn dịch
với kháng thể thì phải cần tới 8 ngày mới có đáp ứng miễn dịch trong máu, trong
khi đó với kỹ thuật PCR thì toàn bộ quy trình phát hiện chỉ mất vài giờ (đối với
nguồn ADN hay RNA). Lợi thế của kỹ thuật PCR được tận dụng cho việc chuẩn
bị ADN làm mẫu dò với số lượng lớn cho các phép lai ADN đã trình bày ở trên.
Các mẫu dò có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hay phi phóng xạ khi tiến hành
phản ứng khuyếch đại. Mẫu dò đánh dấu với kỹ thuật PCR có ưu thế hơn các
phương pháp đánh dấu truyền thống bằng kỹ thuật tổng hợp các mạch đứt gãy
(nick translation) hay đánh dấu với mồi ngẫu nhiên (rADN random primer
labeling). Các ưu thế này có thể kể đến, cụ thể như là cần lượng nhỏ sợi ADN
khuôn, có thể tiến hành đánh dấu với các mẫu dò có kích thước ngắn, chuẩn bị
mẫu dò không cần tinh sạch ADN khuôn. Bảng 1.7. dưới đây liệt kê một số ví dụ
ứng dụng kỹ thuật PCR cho phát hiện nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau. Rất
nhiều các kết quả nghiên cứu như vậy được trình bày trong các tạp chí chuyên
ngành như: ành như: ành như: ành như: Journal of Clinical Microbiology, Applied
Environmental Microbiology.
Bảng 1.7. Một số ví dụ về ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định vi sinh vât.

Vi sinh vật Tài liệu
Acanthamoeba sp
Bordetella pertussis
Borrelia burgdorferi
Brucella sp
Candida albicans
Carnobacterium spp
Chlamydia trachomatis
Clostridium difficile
Coxiella burneti
Cryptosporidium parvum
Cytomegalovirus
Vokin et al (1992)
Houard et al (1989)
Marconi ADN Garon (1992)
Herman an Derider (1992)
Miyakawa et al (1992)
Brook et al (1992)
Hayes et al (1992)
Gumerlock et al (1991)
Stein an Raoult (1992)
Laxer et al (1991)
Gozlan et al (1991)
Dengue virus
Epstein-barr virus
Erwinia amylovora
Escherichia coli
Frankia spp
Gaeumannomyces spp

Helicobacter pylori
Hepatitis C virus
Human immunodeficiency virus
(HIV)
Influenza virus
Leptospira spp
Litsteria monocytogenees
Luteovirus
Henchal et al (1991)
Samoszuk (1991)
Bereswill etal (1992)
Jackson (1992)
Simonet et al (1990)
Henson (1992)
Claton et al (1992)
Okamoto et al (1992)
Dawood et al (1992)
Claas et al (1992)
Merien et al (1992)
Niederhauser et al (1992)
Robertson et al (1991)
Hackel et al (1990)
Mycobacterium leprae
Mycobacterium tuberculosis
Neisseria meningitis
Papillomavirus
Parvovirus
Plsmodium falciparum
Pneumocystis carini
Polio virus

Pseudomonas solanacearum
Rickettsia spp
Rotavirus
Salmonella spp
Staphylococcus spp
Toxoplasma gondii
Altamirano et al (1992)
Maiden et al(1992)
Charlotte et al (1993)
McOmish et al (1993)
Barker et al (1992)
Olsson et al (1993)
Yang et al (1991)
Seal et al (1992a)
Gage et al (1992)
Taniguchi et al (1992)
Rahn et al (1992)
Murakami et al (1991)
Vanevan et al (1991)
Grimprel et al (1991)
Treponema pallidum
Trichomonas vaginalis
Trypanosoma cruzi
Vibrio vulnificus
Yersinia

Riley et al (1992)
Breniere et al (1992)
Hill et al (1991)
Nakajima et al (1992)

Sau đây là những nét chung nhất của kỹ thuật PCR: