Kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm pcr

KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẦM PCR


TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Xét nghiệm HCV genotype là xét nghiệm mà các bác sĩ lâm sàng cần
xác định trước khi bắt đầu điều trị bệnh nhân nhiễm HCV để có thể quyết định
thời gian điều trị. Có nhiều phương pháp để xác định genotype HCV, tuy nhiên
tiêu chuẩn nhất và hữu dụng lâm sàng nhất vẫn là giải trình tự vùng 5’-NC.
Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện xét nghiệm giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR
khuếch đại một đoạn DNA trên vùng 5’-NC của HCV, phân tích các kết quả và rút
ra các kinh nghiệm chủ yếu.
Vật liệu và phương pháp: Các mẫu huyết thanh sau khi thu thập sẽ được tách
chiết RNA cùng với RNA chứng nội tại được cho vào mẫu và tổng hợp thành
cDNA từ dịch ly trích này. Thực hiện phản ứng real-time PCR dùng mồi và các
đoạn dò Taqman đặc hiệu định lượng HCV có trong mẫu ban đầu. Tiến hành giải
trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại này, so sánh với ngân hàng gene để định
các subtype của HCV. Phân tích các kết quả và rút các kinh nghiệm chủ yếu.
Kết quả: Từ tháng 1/2007 đến tháng 5/2008, tác giả đã áp dụng kỹ thuật này để
định kiểu gene HCV cho 2000 trường hợp với kết quả ghi nhận được: 58% thuộc
subtype 1b, 8% thuộc subtype 1a, 5% thuộc subtype 1c, 10% thuộc subtype 2a,
0,4% thuộc subtype 2b và 17% thuộc subtype 6a.
Kết luận: Từ kết quả trên chúng ta nhận thấy các bệnh nhân nhiễm HCV ở Việt
Nam hầu hết đều tập trung vào subtype 1b và 6a. Trong nghiên cứu này, tác giả đã
đưa ra được kỹ thuật tốt nhất để vừa định lượng, vừa định type trên cùng một sản
phẩm khuếch đại có chứa hỗn hợp DNA đích và DNA chứng nội tại, đồng thời
chứa cả hệ thống chống ngoại nhiễm mà không làm ảnh hưởng đến kết quả cuối
cùng của xét nghiệm. Một ưu điểm nữa của phương pháp giải trình tự là có thể cho
kết quả phân biệt được từng loại subtype trong khi các phương pháp khác sẽ có
một tỉ lệ không cho subtype hay thậm chí không phân biệt được subtype.
ABSTRACT
APPLY THE DIRECT SEQUENCING OF THE QPCR PRODUCTS

TO DO THE HCV GENOTYPING.
Nguyen Thanh Bao, Pham Hung Van
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 13 - Supplement of No 1 - 2009: 243 - 248
Background: HCV genotyping is one of the testing that the physicians need to indicate
before dicide the specific treatment on the HCV infected patients. There are many
methods for HCV genotyping, however, the most effective and sensitive is the direct
sequencing of the PCR product specific the 5’-NC of the virus.
Objective: Set up the techniques for genotyping of HCV by direct sequencing the
qPCR product specific to 5’-NC of viral genome, and carry out the analysis of the
results and the outcome experiences.
Materials and methods: The collected patients sera were added with the RNA-
internal control and then were extracted the total RNA which were carried out the
cDNA synthesis. The qPCR using specific primers and taqman probes were done
to quantify the RNA-HCV copies in the samples. The qPCR products were
sequenced and the collected sequences were aligned to the library of HCV
genotype sequences to get the results of HCV genotyping.
Results: From 1/2007 to 5/2008, authors applied these techniques on 2000
samples and the analysed results revealed that: 58% were belong to subtype 1b,
8% belong to subtype 1a, 5% belong to subtype 1c, 10% belong to subtype 2a,
0.4% belong to subtype 2b and 17% belong to subtype 6a.
Conclusions: The received results demonstrated that most of the HCV infected patients
in Viet Nam are infected with genotype 1b and 6a. In this study, the authors have
proved that this testing will not only do the quantity but also do the genotyping of the
HCV by direct sequencing of the qPCR products which contain the target sequence
DNA. Another advantage of this testing is the internal control products and build-in
contamination system did not influence to the sequencing results. Besides that,
sequencing always results the subtype while other methods will give a low ratio or even
can not differentiate the subtype of HCV.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trước khi chỉ định điều trị đặc hiệu, xét nghiệm định lượng và định kiểu gene

virus viêm gan C mà bệnh nhân đang nhiễm là một xét nghiệm tối cần thiết mà
bác sĩ phải chỉ định cho bệnh nhân
(Error! Reference source not found.)
. Phương pháp lai trên
vạch dò đặc hiệu genotype C (HCV-InoLIPA)
(Error! Reference source not found.)
và
phương pháp giải trình tự với hệ thống giải trình tự kín của Trugene
(Error! Reference
source not found.)
là hai phương pháp được nhiều nhà lâm sàng chấp nhận để xác định
kiểu gene HCV dùng trong chẩn đoán. Tuy nhiên, do giá thành khá cao nên xét
nghiệm xác định kiểu gene HCV chưa được chỉ định rộng rãi dù tại Việt Nam tỷ lệ
lưu hành HCV là khá cao trên thế giới (5 - 8% người bình thường có nhiễm
HCV)
(Error! Reference source not found.)
và dĩ nhiên nguy cơ dẫn đến một tỷ lệ khá cao bị
xơ gan và ung thư gan (4%)
(Error! Reference source not found.)
. Trong các nghiên cứu trước
đây, chúng tôi đã xây dựng thành công kỹ thuật xác định kiểu gene HCV bằng kỹ
thuật giải trình tự sản phẩm PCR định lượng nhắm vào vùng 5’-NC. Nghiên cứu
lần này nhắm đến mục đích phân tích kết quả và đúc kết các kinh nghiệm của việc
triển khai xét nghiệm này trên 2000 mẫu định kiểu gene HCV được thực hiện vừa
qua.
VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đây là nghiên cứu tiền cứu cắt ngang với đối tượng là các mẫu huyết thanh được
đã xác định dương tính HCV qua xét nghiệm HCV-RNA (+). Các mẫu này được
nhiều phòng thí nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh gửi đến phòng thí nghiệm NK-
Biotek với yêu cầu định lượng và định kiểu gene HCV. Để phát hiện và định

lượng được HCV-RNA, phòng thí nghiệm sử dụng bộ thử nghiệm RT TQ real-
time PCR (reverse transcriptase real-time PCR dùng taqman probe) do công ty
Nam Khoa sản xuất theo các thuốc thử và qui trình đã được chúng tôi nêu trong
các nghiên cứu trước
(Error! Reference source not found.)
. Thử nghiệm real-time PCR được
thực hiện trên máy IQ5 của Biorad. Sản phẩm real-time PCR cho kết quả real-time
PCR (+) được làm tinh sạch để thu nhận sản phẩm PCR với bộ thử nghiệm tinh
sạch sản phẩm PCR (PCR clean-up kit) do Promega sản xuất (Cat. #A9281). Sản
phẩm PCR sau khi tinh sạch được điện di và định lượng nồng độ DNA bằng máy
Gentquant của Pharmacia và sau này được chúng tôi định lượng bằng điện di trên
chíp điện di và thiết bị điện di chip bio-analyzer của Agilent. Sau đó, thực hiện
phản ứng giải trình tự sản phẩm PCR đã tinh sạch bằng kit và thiết bị CEQ8000
của Becman Coulter và sau này chúng tôi còn thực hiện thêm trên kit và thiết bị
ABI 3130XL. Kết quả giải trình tự được lên NCBI blast qua internet để so sánh
với gene bank và lên local blast của phần mềm miễn phí bio-edit để so sánh với
thư viện HCV genotype mà chúng tôi tự tạo để có được kết quả genotype.
KẾT QUẢ
Trong thời gian từ 17/01/07 đến 17/07/08, có tất cả 2000 mẫu huyết thanh dương
tính HCV-RNA được làm xét nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman
probe đặc hiệu 5’-NC theo qui trình trên. Tất cả 2000 mẫu HCV-RNA dương tính
này cũng đã được chúng tôi đồng thời xác định genotype của HCV bằng giải trình