CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM DÙNG ĐỂ ĐỊNH TÊN NẤM MEN – PHẦN 1 pot

CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM DÙNG
ĐỂ ĐỊNH TÊN NẤM MEN – PHẦN 1


1. Quan sát hình thái tế bào nấm men và đo kích thước
Khi xác định hình thái và kích thước tế bào nấm men người ta thường nuôi cấy
nấm men trong môi trường thạch - mạch nha và môi trường mạch nha dịch thể.
Nếu sử dụng các môi trường khác thì hình thái và kích thước tế bào nấm men có
thể thay đổi, không phù hợp với hình thái và kích thước tiêu chuẩn đã được ghi
trong bảng phân loại.
- Môi trường mạch nha: Lấy lúa đại mạch đã ủ cho nảy mầm (loại nhập
khẩu dùng để làm bia), đem phơi khô rồi xay nhỏ thành bột. Cân 1kg bột này,
thêm 3 lít nước, giữ ở 60
0
C để đường hoá cho đến khi hết tinh bột (thử với dịch
Lugol không thấy có màu xanh lam). Lọc lấy dịch trong có thể thêm 3 lòng trắng
trứng rồi trộn đều, đun sôi rồi lọc lấy dịch trong. Điều chỉnh bằng nước để có nồng
độ đường đạt 6
o
Baume.
Phân vào các dụng cụ thuỷ tinh đã khử trùng. Nếu làm môi trường đặc thì thêm
2% thạch. Tốt nhất là dùng mầm đại mạch, nếu không thì có thể dùng mầm lúa.
Nồng độ thích hợp để nuôi cấy nấm men dùng khi phân loại là 5,7
o
Baume. Có tài
liệu lại sử dụng nồng độ 5-8
0
Baume. Nấm men được nuôi cấy trong các ống
nghiệm thạch nghiêng hoặc các ống nghiệm đựng 3 ml môi trường dịch thể. Nuôi
cấy ở 25-30
0

C trong 3 ngày, sau đó lấy ra làm tiêu bản và quan sát. Muốn đo kích
thước tế bào nấm men người ta thường sử dụng trắc vi thị kính). Số tế bào nấm
men được đo không ít hơn 20. Chú ý là phải đo các tế bào trưởng thành chứ không
đo các chồi mới nảy sinh. Tế bào nấm men có hình thái và kích thước khác nhau
tuỳ loài, tuỳ chi. Chúng có thể có hình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình quả
chanh châu Âu, hình ống v.v Khi quan sát tế bào nấm men dưới kính hiển vi có
thể phân biệt được thành tế bào, tế bào chất, không bào (vacuole) và các hạt dị
nhiễm (metachromatic granules). Thành tế bào nấm men thẫm hơn so với nguyên
sinh chất, còn không bào thường có hình tròn, màu nhạt hơn. Các hạt dị nhiễm
thường bắt ánh sáng mạnh hơn, chúng lắc lư trong nguyên sinh chất theo chuyển
động Brown. Kích thước của tế bào nấm men khác nhau rất nhiều tuỳ loài thuỳ
chi, tuỳ điều kiện sinh trưởng và có thể thay đổi trong khoảng 1-5 x 5-30àm hay có
khi dài hơn nữa. Kích thước tế bào của các loại nấm men thông thường vào
khoảng 4-5àm.

2. Nhuộm màu tế bào nấm men:
Muốn quan sát tế bào nấm men một cách tỷ mỷ hơn người ta thường sử dụng các
loại thuốc nhuộm để nhuộm cả tế bào hoặc một số phần tế bào nấm men. Có thể
dùng một trong những loại dung dịch thuốc nhuộm sau đây:
- Dung dịch Lugol:
Iot 2g
Iodua Kali 4g
Nước cất 100ml
(Nghiền nhỏ I và KI trong cối sứ rồi sau đó dùng nước hoà tan dần).
- Dung dịch xanh methylen (methylene blue)
Xanh methylen 1g
Nước cất 1000ml
(Có thể pha thành dung dịch 1% sau đó lọc rồi dùng nước cất pha loãng thêm 10
lần nữa).
- Dung dịch fuchsin cacbolic:

Fuchsin kiềm (basic fuchsin) 0,1g
Cồn 90
0
10ml
Dung dịch phenol 3% 90ml
(Hoà tan fuchsin trong cồn, sau đó trộn đều vào dung dịch phenol).
Có thể dùng que cấy, phết dịch nuôi cấy nấm men thành một lớp mỏng trên
phiến kính sau đó làm khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh methylen hay
fuchsin cacbolic như khi nhuộm tiêu bản vi khuẩn. Thường người ta dùng lamelle
(lá kính mỏng) để quan sát tế bào nấm men. Lấy một phiến kính sạch nhỏ lên đó
một giọt thuốc nhuộm (xanh methylen chẳng hạn). Giọt thuốc nhuộm không nên
to quá (về sau sẽ tràn khỏi lamelle), cũng không nên nhỏ quá (tạo thành nhiều bọt
khí khi đậy lamelle). Lấy một ít nấm men đã nuôi cấy 2-3 ngày hoà vào giọt thuốc
nhuộm. Đặt một cạnh của lamelle sát vào phía ngoài giọt mẫu rồi hạ từ từ lamelle
xuống cho giọt mẫu tràn đều khắp lamelle. Nếu tràn ra ngoài thì dùng giấy lọc
thấm bớt. Soi ở vật kính nhỏ trước, sau đó chuyển sang vật kính lớn. Có thể căn cứ
vào mức độ bắt màu đậm nhạt để phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. Muốn
quan sát các hạt glycogen trong tế bào nấm men thì nhuộm bằng dung dịch Lugol.
Tế bào sẽ có màu vàng nhạt còn các hạt glicogen có màu đỏ nâu. Muốn quan sát
các giọt mỡ trong tế bào nấm men có thể làm tiêu bản như sau:
Rỏ một giọt formalin lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít nấm men đã
nuôi cấy 48-72 giờ hoà vào giọt formalin. Để yên 5 phút sau đó thêm một giọt
dung dịch thuốc nhuộm xanh methylen, lại thêm một giọt thuốc nhuộm soudan III.
Đặt lamelle dưới kính hiển vi rồi quan sát ta sẽ thấy nguyên sinh chất của tế bào
nấm men bắt màu lam nhạt, không bào không bắt màu còn các giọt mỡ có màu đỏ
hồng.
- Thuốc nhuộm soudan III:
Soudan III 0,05g
Cồn 90% 100ml
Cũng có thể nhuộm các giọt mỡ bằng phương pháp sau đây: Lấy thuốc

nhuộm đen Soudan B (Soudan black B) cho vào ống nghiệm. Dùng que cấy lấy
một ít nấm men hoà vào dịch thuốc nhuộm này. Giữ 20 phút. Lấy khoảng 2 vòng
que cấy dịch thuốc nhuộm có nấm men phết lên phiến kính. Làm khô tự nhiên.
Nhuộm tiêu bản trong 30 giây bằng dịch thuốc nhuộm safranin. Rửa nước, đợi khô
rồi soi kính. Nguyên sinh chất của tế bào nấm men sẽ có màu đỏ nhạt còn các giọt
mỡ có màu đen lam.
- Thuốc nhuộm đen Soudan B (theo Burdon):
Soudan black B 0,3g
Cồn 70% 100ml
(Trộn đều, để 24 giờ rồi mới sử dụng. Dùng trong vòng một tháng).
- Thuốc nhuộm safranin:
Dịch safranin 2,5% (trong cồn 95%) 10ml
Nước cất 100ml
Muốn nhuộm nhân của tế bào nấm men có thể sử dụng phương pháp sau đây:
Lấy một giọt nước đặt lên 1 phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít nấm men hoà vào
giọt nước đó rồi dàn thành vết mỏng. Làm khô tự nhiên. Thêm vài giọt dung dịch
picroformol, giữ vài phút sau đó rửa bằng cồn 70%. Ngâm tiêu bản vào trong dung
dịch FeNH
4
(SO
4
).12H
2
O 3% trong 4-7 giờ. Lấy tiêu bản ra dùng nước rửa sạch
sau đó lại ngâm vào dịch thuốc nhuộm hematoxilin 10% trong 24 giờ. Lấy ra rửa
nước rồi lại ngâm vào dịch FeNH
4
(SO
4
).12H

2
O cho đến khi vừa mất màu thì lấy
ra rửa sạch bằng nước, làm khô rồi soi kính. Nguyên sinh chất của tế bào nấm men
có màu tro còn nhân tế bào có màu đen.
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào:
+ Dung dịch picroformol:
Dung dịch acid picric bão hoà 75 phần
Axetit acetic glacial 5 phần
Dung dịch fomol loãng 20 phần
+ Dung dịch ngâm FeNH
4
(SO
4
)
2
.12H
2
O
FeNH
4
(SO
4
)
2
.12H
2
O 3g
Nước 100ml
+ Dung dịch thuốc nhuộm hematoxilin
Hematoxilin 1g

Cồn 10ml
Nước 90ml
Hoà tan hematoxilin trong cồn, sau đó thêm nước, đậy nút bông rồi để 1 tháng sau
mới sử dụng.
Để quan sát tế bào nấm men có thể dùng dung dịch nigrozin 5%. Khi đó tế bào sẽ
không bắt màu, có thể phân biệt rõ trên một nền màu lam đen.
Để quan sát bào tử túi (tránh lầm với các không bào) có thể sử dụng một số các
phương pháp nhuộm bào tử đã được giới thiệu trong chương IV (phương pháp
nghiên cứu vi sinh vật học tập 1 NXB KHKT 1971). Cũng có thể nhuộm bào tử túi
bằng phương pháp sau đây: Rỏ 1 giọt nước lên phiến kính. Dùng que cấy lấy một
ít nấm men trộn vào giọt nước, dàn thành vết mỏng, để khô tự nhiên.
Cố định trên ngọn lửa bằng đèn cồn, nhuộm bằng dung dịch lục malachit. Nhuộm
2 phút, thường xuyên hơ trên ngọn lửa cho bốc hơi (không được đun sôi). Rửa
nước nhẹ, nhuộm thêm 30 giây bằng dung dịch safranin 0,5% trong nước. Nang
bào tử sẽ bắt màu xanh lục còn tế bào dinh dưỡng có màu hồng.
- Dung dịch lục malachit:
Lục malachit (malachite green) 1g
Nước 100ml (không đun nóng)