Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 2 potx

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT

II.1. QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH HỌC
II.1.1.Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh
II.1.1.1.Những vấn đề cần lưu ý khi quan sát bệnh lý thủy sản
Thông tin về dấu hiệu bệnh, mô học và tế bào học của mẫu bệnh phẩm thực hiện khi giải
phẫu là phần rất quan trọng cho các chẩn đoán có liên quan nhằm cung cấp thông tin cho
một chẩn đoán đầy
đủ. Trong đa số các trường hợp, kết quả chẩn đoán đòi hỏi phải có
những bằng chứng cho thấy sự liên quan giữa mầm bệnh và những tổn thương của cơ thể
do mầm bệnh đó gây nên. Ngoài vai trò xác định tương quan giữa mầm bệnh và vật chủ,
những thông tin từ kết quả quan sát còn giúp xác định/phân biệt những yếu tố tham gia
gây bệnh khác.
Những biến
đổi về hình thái của mô và tế bào phải được xác định và phân ra thành các
nhóm ví dụ như những biểu hiện của vật chủ với sự tấn công của mầm bệnh nhằm có
những biện pháp chẩn đoán khác nhau để có kết quả xác định do cơ thể có rất nhiều loại
mô và chúng có những biểu hiện khác nhau về mặt bệnh lý.
Để có thể lựa chọn phương pháp chẩn đoán hợp lý, ng
ười làm công tác chẩn đoán phải
thu thập, ghi nhận hoặc phải đuợc cung cấp những thông tin sau:
1. Vị trí xuất hiện của những dấu hiệu bệnh lý trên cơ thể, các nội quan và mô cũng
như những những thay đổi trong thời gian gần nhất được phán đoán thông qua: (i)
quá trình diễn biến bệnh (Đã chết hay đang bị bệnh nặng; Tình trạng bệnh: số còn
sống, s
ố khỏe, số bệnh và số đã chết) ; (ii) báo cáo chi tiết về quan sát lâm sàng;
(iii) mẫu mô bệnh và (iv) kết quả xét nghiệm mô bệnh học trên nhiều tiêu bản mô.
2. Kết quả chẩn đoán lâm sàng trước và sau khi tử vong
3. Những thông tin liên quan đến khả năng bị nhiễm độc tố
4. Chấn thương hoặc những thông tin liên quan đến tình trạng kiệt sức
5. Các điều kiện về

dinh dưỡng, sinh sản, mật độ và môi trường nuôi.
6. Thông tin về biện pháp phòng bệnh được áp dụng như loại thuốc hay vắc xin được
sử dụng, thời gian và phương thức sử dụng.
7. Thông tin về kết quả các chẩn đoán trước đây (nếu có).
Những xáo trộn về mặt sinh lý hay trao đổi chất của cơ thể thường không thấy được
qua phân tích mô bệnh học mà chỉ có thể
bằng các quan sát những tổn thương hay
những thay đổi về mặt hình thể do những xáo trộn có liên quan gây ra.
Mẫu được thu để phục vụ cho việc chẩn đoán để định dạng mầm bệnh, xác định tác
nhân gây bệnh hay cung cấp thông tin cho việc xác định nguyên nhân gây bệnh tùy

19
thuộc vào việc chọn lựa phương pháp chẩn đoán như đã nêu ở trên. Chi tiết các bước
thu mẫu được trình bày ở phụ lục 1.
II.1.1.2. Quan sát bệnh lý ở tôm
Việc phát hiện ra bệnh ở tôm rất khó khăn, trừ khi có hiện tượng tôm chết hàng loạt. Dấu
hiệu bệnh thường xuất hiện ở một số ít cá thể trong ao nuôi do vậy cần phải quan sát tôm
nuôi thường xuyên nhằm xác định đượ
c bệnh ở giai đoạn sớm nhất. Trong hầu hết các
trường hợp, biểu hiện bên ngoài thường giống nhau mặc dù tác nhân gây bệnh khác nhau.
Nếu phiêu sinh vật phát triển, chất lượng nước và tôm đều ở trong điều kiện tốt thì kể từ
tuần lễ nuôi thứ ba sẽ không thể nhìn thấy tôm nữa. Khi tôm bị những tác động do môi
trường xấu hoặc bị bệnh chúng thường nổi lên mặt n
ước hoặc tập trung ven bờ. Khi thấy
tôm xuất hiện ở ven bờ hay trên mặt ao thì đó là dấu hiệu nghiêm trọng. Vì thế cần phát
hiện sớm những dấu hiệu khác thường qua sàn ăn hoặc chài. Tôm thường thích lên mặt
ao hay ven bờ vì nước ở đó có hàm lượng oxy cao. Trong nhiều trường hợp cũng có thể
là để tránh hàm lượng chất độc cao ở đáy ao. Kiểm tra các ao nuôi vào ban đêm và lúc
sáng sớm là rất quan trọng vì tôm bệnh s
ẽ nổi lên mặt nước hoặc ven bờ rất nhiều vào

những lúc này. Khi thấy tôm tập trung ven bờ thì nên kiểm tra đáy ao để biết số tôm chết,
nhất là ở khu vực đặt máy sục khí, ở giữa ao nơi tích cặn bã và quanh cống thoát.
Trong hầu hết các trường hợp, không thể xác định bệnh trong ao nuôi qua một lần thu mẫu
cho dù có phân tích nhiều chỉ tiêu đi nữa thì ý nghĩa của nó rất nhỏ. Điều cầ
n thiết ở đây là
cần theo dõi đàn tôm trong suốt quá trình nuôi. Phát hiện được bệnh ở giai đoạn sớm
thường dựa vào những dấu hiệu xuất hiện trên tôm, chất lượng nước và những ghi nhận
trong sản xuất bao gồm thức ăn tôm sử dụng và quá trình sinh trưởng. Điều này chỉ có thể
thực hiện được ở những trại có các số liệu theo dõi đầy đủ về xu h
ướng phát triển, tỉ lệ
sống, tình trạng sức khỏe, sinh khối và tỉ lệ chuyển hóa thức ăn ở mỗi thời điểm thu mẫu.
Mật độ thả nuôi ảnh hưởng rất lớn đến quá trình phát triển của tôm trong ao. Mật độ thả
quá dày chắc chắn sẽ gặp trở ngại, vì tôm sẽ cạnh tranh nhau về thức ăn và môi trường
sống. Mật độ thả
phù hợp cho từng ao tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: điều kiện về thổ
nhưỡng, chất lượng nước, khí hậu ở vùng nuôi; kiểu thiết kế và cấu trúc ao nuôi; trang
thiết bị; cỡ tôm thu hoạch dự kiến và kinh nghiệm của người quản lý.
Thiết kế ao tốt có thể bù đắp cho một số trở ngại về môi trường và cỡ tôm thu hoạch có
thể bị giới h
ạn bởi môi trường xấu. Khi chất lượng nước tại chỗ xấu hoặc quá thay đổi thì
thả tôm với mật độ cao thường không có hiệu quả. Những thay đổi về thời tiết và chất
lượng nước theo mùa có ảnh hưởng đến tôm nuôi. Thời gian chuẩn bị ao và thả giống
phù hợp cho việc nuôi tôm cũng phải được xem xét.
Các thông tin về môi trường và quản lý ao nuôi cần lưu ý bao gồm: chất lượng nướ
c đặc
biệt là hàm lượng oxy hòa tan, pH và nhiệt độ; những biến động về thời tiết như mưa lớn;
tình trạng đáy ao; sự phát triển của tảo và hình thức quản lý nước.
Sự xấu đi của nền đáy ao có thể dẫn đến chất lượng nước kém và gây bệnh cho tôm, tuy
nhiên nó cũng gây ra các ảnh hưởng trực tiếp. Chế độ sục khí trong ao ảnh hưởng đến sự
tích tụ chất thải ở đáy ao. Nếu như phần diện tích sạch ở đáy ao giảm sẽ làm tăng số

lượng tôm đến sàn ăn và tôm ăn hết thức ăn nhanh hơn. Cũng có thể có trường hợp ngược
lại, nếu các sàn ăn đặt ở nơi dơ bẩn trong ao thì số tôm đến sàn ăn cũng sẽ giảm. Thường

20
có nhiều dấu hiệu khác xuất hiện trên tôm cũng cho biết chất lượng nước xấu như màu
sắc bất thường ở mang, vỏ bẩn, phồng đuôi, ăn lẫn nhau và phụ bộ bị thương. Nếu có
nghi ngờ về sự xấu đi của nền đáy ao thì nên lội khắp ao để xem lượng chất thải tích tụ và
sự phân bổ của chúng ra sao.
Mặc dù tảo phát tri
ển tốt thường có lợi cho ao nuôi, nhưng trong ao nuôi thay nước ít có
thể gặp rắc rối do tảo phát triển quá mức vì các chất dinh dưỡng tích lũy trong ao.
Phương thức quản lý và xử lý nước cần phải được lưu tâm đặc biệt. Mục đích của giai
đoạn lấy nước, xử lý nước và bón phân là để thúc đẩy phiêu sinh vật phát triển tốt và
ngăn ngừa các sinh vật khác vào ao nuôi, trong đó có các sinh vật gây bệnh và sinh vật
mang mầ
m bệnh. Các sinh vật này bao gồm các loài cá, giáp xác và các động vật không
xương sống khác. Các sinh vật này có thể cạnh tranh hoặc giết hại tôm và chúng có thể
mang mầm bệnh vào ao nuôi như các mầm bệnh vi-rut rất nguy hiểm.
Những dấu hiệu bệnh lý bên ngoài cơ thể tôm nuôi thường không cung cấp những thông
tin nhất định nào về tác nhân gây bệnh. Phức tạp hơn là dấu hiệu bệnh lý do nhiều tác
nhân cùng gây ra cộng với những biến đổi bất lợ
i về các yếu tố môi trường. Việc chẩn
đoán bệnh nếu chỉ đơn thuần dựa vào dấu hiệu bên ngoài sẽ không chính xác mà cần phải
được thực hiện cùng với phương pháp phân tích mô bệnh học hay các phương pháp chẩn
đoán khác. Dấu hiệu bệnh được tiến hành qua các bước như sau:
1. Quan sát hoạt động của tôm
2. Quan sát màu sắc cơ thể như:
- Hiện tượng đỏ thân hay đỏ
phụ bộ
- Sự xuất hiện những đốm trắng trên vỏ

- Hiện tượng vỏ tôm có màu xanh
- Hiện tượng đầu vàng
- Thịt tôm có màu trắng đục
3. Quan sát màu sắc mang như:
- Hiện tượng mang tôm có màu hơi nâu hay đen
- Hiện tượng mang tôm có màu xanh
4. Phụ bộ
5. Lớp biểu bì
6. Cơ
7. Túi tinh
8.
Tăng trưởng chậm hay tôm bị còi

21
9. Dị dạng
10. Mềm vỏ
11. Màu sắc và độ đầy của ruột
12. Màu sắc của phân
Thông tin chi tiết về phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh trên cơ thể tôm được trình bày
trong phần bệnh tôm, giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005). Các dấu hiệu
bệnh thường gặp ở tôm được trình bày ở phụ lục 2.
II.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý ở cá
II.1.1.3.1. Quan sát hoạt động của cá
Hoạt động của cá phải được quan sát thường xuyên mới có thể phát hiện sớm những biểu
hiện bất thường. Bầt kỳ một dấu hiệu hoạt động bất thường của cá cũng cần phải được
ghi nhận và tìm hiểu nguyên nhân. Trước khi có dấu hiệu bệnh lý rõ ràng, cá thường ăn
nhiều hơn bình thường và sau đó ngừng ăn, hoặc có một số cá tách đàn khi bắt m
ồi. Sự
ghi nhận thường xuyên những thông tin về hệ số chuyển hóa thức ăn, tỉ số chiều dài/trọng
lượng cơ thể hoặc những dấu hiệu về hình dạng cơ thể sẽ giúp dự đoán/phát hiện bệnh

sắp xảy ra.
Những biểu hiện bất thường của cá như bơi gần mặt nước, chìm xuống đáy ao, mất thăng
b
ằng hoặc thiếu oxy hay có bất kỳ những dấu hiệu hoạt động bất thường nào. Sự xuất
hiện đột ngột của những hoạt động bất thường của cá thường liên quan đến tình trạng hôn
mê của cơ thể cá. Những thay đổi về hoạt động của cá thường xảy ra khi cá bị sốc. Thiếu
oxy làm cá bị ngạt thở, lờ đờ, phình bụng hay bơi lắc l
ư mất hăng bằng và thậm chí làm
ảnh hưởng xấu đến mang và máu. Những hoạt động lạ thường còn có thể do những rối
loạn về thần kinh liên quan đến bệnh (bệnh do vi-rút gây viêm não và võng mạc).
Phải theo dõi xem cá chết dưới hình thức nào và mức độ ra sao. Nếu cá cứ tiếp tục chết
dai dẳng thì phải thu mẫu gởi đến phòng thí nghiệm để thực hiện các chẩn đoán ở mức 2
và 3. Nế
u cá chết đồng loạt hoặc chết theo vùng ngẫu nhiên thì phải xem xét ngay lập tức
và các chỉ tiêu về môi trường trước và sau khi cá chết cần phải được ghi nhận và xem xét.
Cá chết lan từ vùng này sang vùng khác có thể là do tác nhân gây bệnh truyền nhiễm và
phải thu mẫu định dạng mầm bệnh ngay lập tức. Việc làm tức thời (nếu có thể) là cách ly
cá bị bệnh và cá khỏe trong thời gian xác địng nguyên nhân gây tử vong.
Tăng trưởng hàng ngày của cá cần ph
ải được ghi nhận càng đầy đủ càng tốt. Tốt nhất là
thu mẫu định kỳ hoặc ước lượng khi cho cá ăn mỗi ngày. Bên cạnh thông tin về tăng
trưởng của cá thông tin về hoạt động bắt mồi và cá chết (nếu có) cũng cần được ghi nhận
đầy đủ. Thời gian thay bể hay thay nước, vệ sinh dụng cụ/ống dẫn nước hay khử trùng
trại cũng càn được ghi chép lại. Trong nhiều tr
ường hợp, những thông tin trên rất hữu ích
để tìm ra nguyên hay xuất hiện bệnh trong trại nuôi cá.
II.1.1.3.2. Thông tin về sản xuất, môi trường và quản lý ao
Chất lượng nước và những điều kiện môi trường biến động cũng có những ảnh hưởng
đáng kể đến sức khỏe của cá có thể là ảnh hưởng trực tiếp (trong giới hạn chịu đựng về

22
mặt sinh lý) hay gián tiếp (làm tăng sự mẫn cảm của cá với mầm bệnh). Nhiệt độ, độ
mặn, độ đục, vi khuẩn gây bẩn và sự phát triển của tảo đều là những yếu tố môi trường
quan trọng. Mật độ nuôi cao trong các hệ thống nuôi thâm canh làm cho các bị sốc và gây
nên những thay đổi về môi trường tạo điều kiện cho bệnh bộc phát. Sự tích tụ chất thả
i
từ thức ăn thừa do cho ăn quá mức hay do cá giảm ăn đều sinh ra độc tố khi phân hủy
làm ảnh hưởng trực tiếp đến cá và tạo điều kiện môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát
triển. Các mầm bệnh này thường là các tác nhân gây bệnh thứ cấp. Ngoài ra các chất gây
ô nhiễm khác cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe của cá.
Thông tin vế môi trường nuôi đặc biệ
t là ở những hệ thống nuôi hở, ao, bè hay lồng rất
quan trọng khi xác định nguyên nhân gây bệnh. Các thông tin cần phải ghi nhận càng
thường xuyên càng tốt là: những thay đổi về thời tiết, nhiệt độ nước, hàm lượng oxy, pH,
độ mặn, độ trong và sự phát triển của tảo và hoạt động của con người.
II.1.1.3.3.Quan sát bề mặt cơ thể cá
Những quan sát bề mặt cơ thể cá nói chung không cung cấp nhiều thông tin liên quan đến
một sự cố về bệnh riêng lẻ nhưng những quan sát về dấu hiệu lâm sàng ở bề mặt cơ thể
cùng với những biện pháp hợp lý như loại bỏ hoặc cách ly cá bệnh với cá khỏe, thu mẫu
xét nghiệm có thể giảm đáng kể thất thoát do bệnh.
II.1.1.3.4.Quan sát trên da và vây cá
Những tổn thương trên da và vây thường là do bệnh truyền nhiễm, ví dụ như bệnh đỏ da
ở cá chép. Tuy nhiên, những vết thương trước đó do những nguyên nhân cơ học (cá cọ
vào thành bể hay do những sinh vật khác như cá dữ, chim) hay tổn thương hóa học tấn
công sẽ tạo điều kiện cho các mầm bệnh sơ cấp hay thứ cấp (ví dụ như trường hợp nhiễm
vi khuẩn Aeromonas) t
ấn công làm xấu thêm tình trạng sức khỏe của cá.
Những thay đổi ở da liên quan đến bệnh, ví dụ như bệnh đốm đỏ dù là nhỏ hay to thường
đòi hỏi phải có những động tác tích cực để xử lý. Những dấu hiệu bệnh thường xuất hiện
xung quanh các tia vi, nắp mang, hậu môn và vùng đuôi, cũng có khi dấu hiệu bệnh lan

khắp toàn thân. Những dấu hiệu như xuất huyết hoặc mất cân b
ằng thẩm thấu sẽ làm cho
da cá sậm màu đi. Những vết thương bị xuất huyết trên da dễ dẫn đến tình trạng lở loét
làm ảnh hưởng đến việc điều hòa áp suất thẩm thấu và khả năng đề kháng của cơ thể với
các mầm bệnh thứ cấp. Hiện tượng lở loét thường gặp ở phần da vùng lưng và đầu và có
thể do bệnh gây nên. Ở
một số loài cá, những chỗ da bị sưng lên là dấu hiệu của sự mất
vẩy hoặc sự tích tụ chất nhày.
Ngoại ký sinh trùng hay giun dẹp cũng cần phải được lưu ý. Khi những loài ký sinh trùng
này xuất hiện trên da cá nhiều hơn mức bình thường sẽ làm cho cá bị nhiễm những mầm
bệnh thứ cấp, là dấu hiệu của sự phát bệnh hay bị sốc. Ký sinh trùng có thể bám trên bề
mặ
t da cá hoặc ở giai đoạn ấu trùng sống trong bào nang/bào xác dưới da hay vi cá.
Những dạng bào xác ấu trùng như ấu trùng sán lá song chủ metacercariae có thể phát
hiện nhờ những đốm trắng hay đen dưới da (hoặc sâu trong mô).
Mắt của cá cũng là nơi cần được quan sát cẩn thận để phát hiện bệnh. Hình dạng, màu
sắc, tình trạng đục vẩn, bọt khí và những đốm đỏ nhỏ lấm tấm do xuất huyết đều là
những dấu hiệu cho thấy cá sắp bị bệnh hoặc đang ở trong tình trạng nhiễm bệnh. Ví dụ

23
như trường hợp mắt cá bị to và trương phồng lên còn được gọi là cá bị lồi mắt thường
liên quan đến nhiều trường hợp bệnh ở cá.
II.1.1.3.5. Quan sát mang
Mang cá là một trong số các mô dễ quan sát những thay đổi khi cá bị bệnh như mang
nhợt nhạt hay bị lở loét. Những thay đổi ở mang cá thường là có liên quan đến bệnh và
cần phải lưu tâm đặc biệt khi thấy những biểu hiện bất thường xuất hiện ở mang. Những
đốm đỏ trên mang là dấu hiệu của sự xuất huyết đã làm giảm di khả năng thực hiện các
chức n
ăng của mang. Mang bị sinh vật gây bẩn bám, tích tụ nhiều chất nhày hay ký sinh
trùng (tiêm mao trùng, sán lá đơn chủ, giáp xác chân chèo, nấm, v.v.) đều có thể làm hạn

chế bề mặt tiếp xúc của mang và là dấu hiệu ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của cá. Những
ảnh hưởng xấu ở mang có thể làm ảnh hưởng trực tiếp đến cá hoặc làm cho cá dễ mẫn
cảm với các mầm bệnh thứ cấ
p khác.
II.1.1.3.6. Quan sát trên cơ thể
Bất kỳ một thay đổi khác thường nào về mặt hình dạng của cá đều là dấu hiệu không tốt
về mặt sức khỏe. Những thay đổi về hình dạng thường gặp là “đầu nhọn” hay xảy ra ở cá
con là dấu hiệu của sự phát triển không bình thường; hiện tượng ưỡn hay vẹo cột sống là
dấu hiệu không tốt về dinh dưỡng hay môi trường. Phù cơ thể là một hi
ện tượng xuất
hiện khá phổ biến và dễ nhận thấy nhất về mặt thay đổi hình dạng cơ thể của cá. Phù cơ
thể là sự căng phồng phần bụng làm cho bụng cá trương to. Đây là dấu hiệu bệnh cho
thấy có sự sưng lên của các nội quan cá như gan, tụy hay thận, sự tích tụ dịch cơ thể do
ký sinh trùng hoặc do những nguyên nhân khác chưa rõ. Phù cơ thể là mộ
t trong những
nhân tố của khá nhiều bệnh nguy hiểm ở cá liên quan đến sự ngưng trệ hệ thống điều hòa
thẩm thấu do có nhiều tế bào máu của thận bị phá hủy.
II.1.1.3.7. Quan sát bên trong cơ thể cá
Quan sát bên trong cơ thể cá là bước tiếp sau việc quan sát những thay đổi về hoạt
động/tập tính sống của cá. Mẫu cá bệnh phải được giải phẫu dọc theo phần bụng từ họng
đến hậu môn để quan sát các nội quan và xoang cơ thể. Nên giải phẫu mẫu cá khỏe để so
sánh những sai khác của nội quan cá khoẻ và cá bệnh.
Nếu như cá khỏe mạnh và các mô cơ thể bình thường thì sẽ không thấ
y dịch cơ thể trong
khoang bụng cá, cơ rắn chắc, có thể thấy những lớp mỡ có màu trắng kem xung quanh
ruột và dạ dày. Thận có màu đỏ sẫm nằm sát phần tận cùng phía trên của khoang cơ thể
giữa tuỷ sống và bóng hơi, gan có màu đỏ, tụy và lách cũng có màu đỏ.
II.1.1.3.8. Quan sát khoang bụng và các mô
Những dấu hiệu bệnh thường thấy nhất trong khoang cơ thể là sự xuất huyết và sự tích tụ
dịch cơ thể. Những đốm máu có thể xuất hiện trong cơ vách của khoang cơ thể.Vách của

khoang cơ thể mềm nhũn, rã ra khi giải phẫu là dấu hiệu cho biết cá đã chết lâu và sẽ
không còn thích hợp cho việc chẩn đoán chính xác do sự xâm nhập rất nhanh của các vi
sinh vậ
t hoại sinh là mầm bệnh cơ hội khi sau khi cá chết.
Hiện tượng hoại cơ còn có thể do cơ bị nhiễm trùng ví dụ như ký sinh trùng nhóm thích
bào tử trùng (myxosporean). Có thể quan sát sự nhiễm trùng này bằng cách ép một mảnh

24
nhỏ mẫu mô bị nhiễm lên lam kính và quan sát bằng kính hiển vi giải phẫu để quan sát
những thể vùi dạng bào tử. Một số loài ký sinh trùng nhóm vi bào tử trùng
(microsporidian) và thích bào tử trùng có thể hình thành bào xác trong cơ của cá, mô liên
kết các nội quan và khoảng cơ thể, và những cơ quan khác. Những dạng bào xác này tập
trung thành từng cụm có hình cầu trắng và đòi hỏi thao tác định danh để xác định ký sinh
trùng thuộc nhóm nào.
Giun sán cũng có thể xuất hiện trong khoang bụng, nhóm này thườ
ng nằm cuộn lại xung
quanh các nội quan và các mô màng bụng. Sự hiện của chúng thường không gây nguy
hiểm cho cá tuy nhiên nếu chúng có quá nhiều trong khoang bụng sẽ gây chèn ép hay
chiếm chỗ các nội quan của cá.
II.1.1.3.9. Quan sát các nội quan
Bất cứ những đốm trắng xám nào xuất hiện trên một trong những cơ nội quan của cá như
gan, thận, tụy hay lách đều do bệnh vì những đốm trắng xám này là dấu hiệu của sự hoại
tử hoặc tổn thương ở mô. Ở thận hoặc lách thì đây là dấu hiệu của sự ngưng sản xuất tế
bào máu. Những vết loét trên thận còn có thể là do ảnh hưởng tr
ực tiếp của sự điều hoà
áp suất thẩm thấu. Những vết loét trên gan thì có thể do ảnh hưởng của cơ chế kháng
khuẩn và kháng độc tố. Bất kỳ một nội quan nào của cá bị sưng lên đều là dấu hiệu của
bệnh cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt. Khi ruột cá bị sưng thì phải kiểm tra xem là
do thức ăn hay do sự tích tụ dịch nhày. Sự
tích tụ dịch nhày là dấu hiệu của ngưng tiêu

hóa thức ăn, loại bỏ chất thải cũng như sự kích động ruột thường có liên quan đến những
bệnh nguy hiểm. Đây cũng có thể do sự xâm nhập cơ hội của những đoạn ruột đã bị kích
động do sự thay đổi quá nhanh về thức ăn ví dụ như do trùng roi Hexamita salmonis.
Ruột có đầy dịch nhày có thể
nhận ra qua phân kết cụm, phân kéo dài hay có dịch nhày.
Thông tin về phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh trên cơ thể cá cũng được trình bày
trong phần bệnh cá, giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005). Các dấu hiệu
bệnh thường gặp ở cá được trình bày ở phụ lục 3.

II.1.2. Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi
Quan sát mẫu giải phẫu tươi có thể được thực hiện ngay tại trại nuôi hay chỉ c
ần có kính
hiển vi và các dụng cụ tiểu phẫu đơn giản là có thể thực hiện được nhằm giúp đánh giá
tình trạng sức khỏe tôm/cá nuôi và phán đoán những nguyên nhân có thể gây bùng phát
bệnh. Những phương pháp trình bày dưới đây thường được sử dụng trong chẩn đoán
bệnh tôm. Ở cá, các kỹ thuật này cũng được áp dụng khá tương tự. Thông tin chi tiết về
các phương pháp cơ bản trong chẩn đoán bệnh cá có th
ể tham khão thêm trong tài liệu
hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản (Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease,
FAO fisheries technical paper 402/2) hoặc trong giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa
Thủy sản, 2005).
Kính phết huyết tương
Để kiểm tra hình thái của hồng cầu và sự hiện diện của vi trùng và ký sinh trùng trong
máu. Những biến đổi như nhân bị co lại thường có liên quan đến bệnh Vibrio hoặc bệnh
đầu vàng. Nhân bị vỡ và có nhiều thể vùi trong tế bào chất là biểu hiện đặc trưng của sự

25
nhiễm vi-rút gây bệnh đầu vàng (YHV). Vi khuẩn Vibrio thường phổ biến trong các
trường hợp nhiễm khuẩn. Vi bào tử trùng (Microsporidium) cũng thường được tìm thấy
trong máu. Có thể nhuộm mẫu huyết tương bằng phương pháp nhuộm Gram hay nhuộm

Heamatocyline & Eosin (H&E) (xem phụ lục 4).
Kính phết mẫu gan tụy, cơ và cơ quan sinh dục đặt lên lam cho vào một giọt dung dịch cố
định Davidson, phết đều, để khô và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E. Phương pháp này có
thể phát hiện các thể ẩn của vi-rút trong trường hợp tôm bị nhiễm nặng. Ngoài ra cũng có
thể phát hiện nhóm Vibrio và vi bào tử trùng.
Cố định mang tôm bằng dung dịch HCl Davidson và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E có thể
phát hiện vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV), YHV và vi-rút gây hoại tử cơ quan tạo máu và
cơ quan lập biểu mô (IHHNV). Vi khuẩn gây bệnh đóng rong, nguyên sinh động vật, nấm
mycosis và hiện tượng tiết hắc tố cũng được phát hiện bằng cách này (xem phụ lục 5).
Quan sát tiêu bản tươi bằng cách lấy mẫu của mang, phụ bộ, cơ quan gan tụy, cơ, cơ quan
sinh dục và ruột giữa cho vào một giọt dung dịch 2.8 % NaCl hoặc nước biển vô trùng,
đậy bằng lam và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn dạng sợi, nguyên sinh
động vật, vi khuẩn hình que có khả năng di động (thường là nhóm Vibrio), nấm mycosis,
tảo khuê, tảo lục và cả mùn bã hữu cơ. Ở những chỗ bị đen dưới v
ỏ hoặc trong cơ có thể
dùng dao tiểu phẫu để cắt mẫu và đặt mẫu lên phiến kính với một giọt dung dịch 2.8 %
NaCl và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn gây bẩn, nguyên sinh động vật
và nấm Furasium.
Một số phương pháp nhuộm nhanh hiện đang được sử dụng để phát hiện vi-rút baculo ở
tôm sú (Monodon baculovirus-MBV), YHV và WSSV (xem phụ lục 6).

II.1.3. Phương pháp mô học
Mô bệnh học là phương pháp xác định các t
ổn thương ở các mô tế bào dựa trên các thủ
thuật nhuộm tế bào và quan sát bằng kính hiển vi. Phương pháp này cho phép người phân
tích kết luận tính chất của các vùng tổn thương.
So sánh và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngoài là công việc rất cần thiết để có được
một chẩn đoán đúng. Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các
dữ kiện khác có liên quan đến cá tôm bệnh thì thường có những kết luận sai l
ầm vì những hình

thái tổn thương của vài bệnh có thể giống nhau và gây nhầm lẫn trong chẩn đoán.
Phương pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển vi và mô bệnh học là một
chuyên môn hẹp của phương thức mô học đề cập tới quá trình phát triển bệnh. Mô bệnh
học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp bệnh
chỉ có thể ch
ẩn đoán được bằng phương pháp này. Tuy nhiên, nó có những hạn chế nhất
định, chẳng hạn, thao tác tương đối chậm và trong nhiều trường hợp bệnh tôm phải được
xử lý ngay trước khi có được kết quả xét nghiệm mô học. Phương pháp mô học chỉ nên
sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm để xác định tác
nhân gây bệnh

26
Trước khi quan sát dưới kính hiển vi, mẫu phải được cố định để tránh bị hư thối, loại bỏ
thức ăn và đúc khối sáp. Cắt mẫu thành từng lát mỏng khoảng 5 micromet, rồi đặt lên lam,
nhuộm màu và đậy bằng lam kính. Thịt tôm bị phân hủy cực kỳ nhanh sau khi tôm chết, vì
thế cần phải cố định chúng. Tôm chết dù được giữ trong nước đá hay đông lạnh cũng đề
u
vô ích đối với phương pháp mô học do những biến đổi xảy ra trong cơ. Dung dịch cố định
tôm tốt nhất là dung dịch Davidson’s và formaline đệm trung tính (phụ lục 5).
II.1.3.1. Mục tiêu
- Nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào (vi thể)
- So sánh đối chiếu các tổn thương với những biểu hiện lâm sàng của vật chủ để
tìm hiểu mối quan hệ mật thiết giữa biến đổi hình thái và các r
ối loạn chức năng
làm cơ sở cho việc chẩn đoán.
II.1.3.2. Những điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp mô bệnh học:
1. Kết quả phân tích mô học có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán bệnh hiển thị
quan hệ trực tiếp giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ
2. Khi thực hiện các phân tích mô học cần phải ghi nhận và phân loại những biến đổi
về hình thái và cấu tạo ở mức tế bào. Mỗi loại mô, tế bào có những biểu hiện khác

nhau với tác nhân gây bệnh.
II.1.3.3. Phương pháp mô học bao gồm các bước:
1. Các giai đoạn tạo lát cắt tế bào (tiêu bản mô học)
- Thu mẫu (theo phương pháp của Lightner, 1996)
- Cố định mẫu (dung dịch Davidson’s). Sau đó trữ trong dung dịch 50-70 % alcohol.
- Cắt mẫu
- Tách nước
- Đúc parafin
- Cắt m
ẫu bằng microtom
- Dùng xylen để loại parafin ra khỏi lát cắt.
2. Nhuộm lát cắt bằng phương pháp nhuộm H&E
3. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi và nhận định kết quả


27
II.2. KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH
II.2.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry-IHC) cho phép phát hiện kháng
nguyên trên tiêu bản mô bằng cách sử dụng kháng thể có tính đặc hiệu với kháng nguyên
qua phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Kháng thể dùng cho phản ứng có thể được đánh
dấu bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang (kỹ thuật IFC), enzym, chất phóng xạ… để có
thể nhận biết khi quan sát dưới kính hiển vi điện, kính hiển vi huỳ
nh quang hay những
loại kính hiển vi khác (hình 2.1).

II.2.2. Ứng dụng
- Xác định tác nhân gây bệnh một cách chuyên biệt dựa trên tính nhạy và tính
chuyên biệt của phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể.
- Do khả năng phát hiện kháng nguyên trong tiêu bản mô hay tế bào nên phương

pháp này cho phép tìm hiểu khả năng gây bệnh của tác nhân gây bệnh .
- Quan sát bằng kính hiển vi điện hay kính hiển vi huỳnh quang, một vài phương
pháp đặc biệt được sử dụ
ng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử.

Hình 2.1. Nguyên lý kỹ thuật IHC (KT: kháng thể; KN: kháng nguyên)

28
II.2.3. Mẫu phân tích
Mẫu sử dụng
là mô hay dịch cơ thể còn tươi: thời gian chuẩn bị mẫu thường là khoảng 24
giờ. Sau đó mẫu được xử lý bằng một trong các phương pháp sau:
Vết bôi/kính phết: vết bôi dùng cho xét nghiệm IHC phải được gởi đến phòng thí nghiệm
trong vòng 48 giờ sau khi chuẩn bị tiêu bản. Trường hợp lâu hơn 48 giờ thì mẫu phải
được giữ trong tủ lạnh và tránh ánh sáng để kháng nguyên không bị hư. Thông tin chi tiết
về việc chuẩn bị tiêu bản phải được sự hướng dẫn của phòng thí nghiêm nhận mẫu.
Formalin: cố định mẫu (dày khoảng <1 cm) trong dung dịch đệm trung tính (10%
formalin) và đúc khối bằng paraffin trong vòng < 1 tuần. Hoặc cố định 48 giờ trong
formalin, sau đó bảo quản trong ethanol để có thể bảo quản mẫu cho việc phát hiện bằng
phương pháp mô học hoặc phương pháp miễn dịch.
Đông lạnh: ưu điểm của mẫu đông lạnh là tách được trường hợp liên kết chéo của một số
kháng nguyên với formalin làm ảnh hưởng đến sự liên kết kháng nguyên-kháng thể. Tuy
nhiên phương pháp đông lạnh làm giảm đi chi tiết về hình thái của mô và tế bào, đòi hỏi
phải có phương pháp trữ đông đặc biệt cho IHC, giới hạn việc xác định tình trạng bệnh
trước khi mô được trữ đông và thao tác th
ực hiện tiêu bản khó hơn so với tiêu bản bằng
cách đúc khuôn parafin như trong phương pháp mô bệnh học. Phương thức trữ đông tốt
nhất là sử dụng môi trường trữ mô chuyên biệt, để trong isopentane và đông lạnh bằng
nitơ lỏng hay ở –70°C.

II.2.4. Thao tác
Có nhiều phương pháp IHC được sử dụng tuỳ theo mục đích phát hiện kháng nguyên chủ
yếu dựa trên loại mẫu (vết bôi, đúc parafin hay đ
ông lạnh), dạng mẫu vật để phát hiện
bệnh và độ nhạy cần đạt được.
Những thông tin cần có khi thực hiện IHC là: (i) cách cố định mẫu; (ii) thời gian cố định;
(iii) những miêu tả đặc trưng về mẫu và (vi) loài.

II.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
II.2.5.1. Ưu điểm:
- Nhận dạng những mầm bệnh khó có thể phát hiện bằng phươ
ng pháp mô học hay
nhuộm truyền thống.
- Xác định chính xác tác nhân gây bệnh dựa vào tính chuyên biệt của kháng thể đối với
kháng nguyên.
- Có thể giúp xác định một cách trực tiếp khả năng gây bệnh của mầm bệnh qua sự
tương tác ở mức tế bào về mặt hình thái hoặc cấu tạo.


29
II.2.5.2. Nhược điểm:
- Thời gian giữ mẫu trong formalin càng lâu sẽ càng dễ gây ra hiện tượng liên kết giữa
các kháng nguyên tạo kết quả dương tính giả.
- Đòi hỏi quá trình tạo ra kháng thể chuyên biệt, kiểm tra tính ổn định của phản ứng
giữa kháng thể và kháng nguyên.
- Một số kháng thể chỉ có thể cho phản ứng có hiệu quả với mẫu đông lạnh.
-
Kết quả âm tính hay dương tính giả phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của mô được
sử dụng, phương pháp và thời gian cố định, kinh nghiệm làm việc với kháng thể của
người phân tích.

II.3. KỸ THUẬT NUÔI VI SINH VẬT
Những kỹ thuật nuôi vi sinh vật giúp cho việc chẩn đoán sơ bộ mầm bệnh vi sinh vật ở
mức họ hoặc có khi đến mức giống. Trong trường h
ợp đòi hỏi phải có chẩn đoán xác
định thì phải sử dụng những phương pháp định danh chuyên biệt tùy theo loài hoặc týp.
Tuy nhiên hạn chế của phương pháp nuôi vi sinh vật trong chẩn đoán bệnh là thường dễ
gặp trường hợp âm tính giả đối với một số mầm bệnh vi sinh đòi hỏi điều kiện nuôi cấy
đặc biệt. Mặt khác vấn đề tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấ
y rất dễ gây nên hiện tượng
dương tính giả trong chẩn đoán.

II.2.1. Nuôi vi khuẩn
II.2.1.1. Ứng dụng
Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn của loài vi khuẩn phân lập được trên mẫu bệnh phẩm
II.2.1.2. Phương pháp
Phân lập và nuôi vi khuẩn bằng môi trường chọn lọc tùy theo dạng vi khuẩn được nuôi.
Vi khuẩn thường được nuôi trong môi trường có chứa kháng sinh mà chúng kháng. Cách
làm này vừa có thể giúp kiểm soát sự phát triển của chúng, theo dõi sự thay đổi khả n
ăng
kháng thuốc trong cùng một quần thể cũng như giúp xác định loại kháng sinh có hiệu lực
với loài vi khuẩn đó. Một số môi trường chọn lọc thường được sử dụng nuôi mầm bệnh
vi khuẩn ở thủy sản như:
- Vibrio sp: TCBS
- Aeromonas sp: aeromonas agar + ampicillin, rimler short agar, ampicillin-dextrin
agar
- Flexibacter sp: Cytophaga
- Edwardsiella ictaluri: Edwardsiella ictaluri agar

30

II.2.1.3. Mẫu phân tích
Cơ, gan, thận hay máu của sinh vật bị bệnh. Trong một số trường hợp bệnh phẩm thủy
sản lở loét mẫu có thể được thu bằng cách dùnh gạc bông gòn lấy mẫu tại vết thương.
Mẫu cũng có thể được thu từ dịch cơ thể của bệnh phẩm.
II.2.1.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm: phát hiệ
n được sự hiện diện của mầm bệnh.
Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và dễ bị tạp nhiễm với các
mầm bệnh cơ hội

II.2.2. Nuôi nguyên sinh động vật
II.2.2.1. Ứng dụng
Giúp đánh giá tình trạng nhiễm nguyên sinh động vật trên mẫu bệnh phẩm
II.2.2.2. Phương pháp
Nguyên sinh động vật được nuôi trên các dòng tế bào đặc biệt có bổ sung fetal bovine
serum và kháng sinh như penicillin, streptomycin
để tránh nhiễm khuẩn.
II.2.2.3. Mẫu phân tích
Mẫu ruột, phân, máu hay các mô cơ thể. Cách tốt nhất là rửa mẫu bằng dung dịch nước
muối sinh lý có chứa kháng sinh để tránh nhiễm khuẩn, sau đó giữ trong tủ lạnh trước khi
chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.
II.2.2.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh.
Nh
ược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và sau khi thu mẫu phải được
xử lý trong vòng 24 giờ

II.2.3. Nuôi vi-rút
II.2.3.1. Ứng dụng
Việc nuôi vi-rút thường được sử dụng nhằm hỗ trợ cho các phép chẩn đoán nhiễm vi-rút.

Việc phân lập vi-rút thường gắn với các xét nghiệm phân tử như PCR nên phương pháp
thu mẫu cũng phải được thực hiện tùy theo vi-rút là DNA hay RNA vi-rút.

31
II.2.3.2. Phương pháp
Vi-rút là sinh vật sống ký sinh bắt buộc nên việc nuôi vi-rút thường được thực hiện trên
tế bào sống hoặc trong cơ thể sinh vật sống. Tế bào sống thường được nuôi trong đĩa petri
hoặc trong lọ tiệt trùng. Mẫu được nghiền và sau đó cho vào môi trường nuôi cấy và
nhiệt độ thích hợp để vi-rút phát triển.
II.2.3.3. Mẫu phân tích
Mẫu phải được thu vào thời điểm có bệnh bộc phát vì vi-rút có thể không còn hi
ện diện
trên cơ thể vật chủ khoảng 2 ngày sau khi có thấy dấu hiệu bệnh lý. Tùy theo điều kiện
thực tế mà mẫu có thể được vận chuyển sống, ướp nước đá, nước đá khô hoặc nitơ lỏng
để chuyển về phòng thí nghiệm.
Mẫu gởi đến phòng thí nghiệm phải kèm theo các thông tin về loại mẫu, loại vi-rút tình
nghi bị nhiễm và thời gian quan sát thấy dấu hiệ
u bệnh lý liên quan đến vi-rút đó. Mẫu
được thu có thể là mẫu mô hoặc dung dịch trích từ mô trong điều kiện vô trùng, mẫu máu
được thu với dung dịch chống đông.
Điều kiện vận chuyển và lưu trữ mẫu tùy theo loại vi-rút và sẽ tùy theo phòng thí nghiệm
phân tích hướng dẫn. Một số phòng thí nghiệm đòi hỏi mẫu phải được giữ trong môi
trường có bổ sung protein và kháng sinh khi vận chuyển, mẫu phải được vậ
n chuyển
trong nước đá trong vòng 24 giờ, hoặc phải giữ lạnh ở 4°C nếu vận chuyển trong vòng 5
ngày. Trường hợp lâu hơn 5 ngày phải giữ mẫu ở -70°C, v.v….
II.2.3.4. Đọc kết quả
Nhìn chung, việc phân lập vi-rút từ mô hay máu của vật chủ bị bệnh là đầy đủ làm chứng
cứ cho sự nhiễm vi-rút. Tuy nhiên, vi-rút có thể tham gia như là mầm bệnh thứ cấp chứ
không phải là tác nhân gây bệnh chủ yếu.

Điều cần thiết trong quá trình chẩn đoán là phải
có cơ sở cho thấy vi-rút có liên quan đến sự tổn thương của cơ thể vật chủ hoặc vi-rút là
tác nhân gây bệnh chủ yếu. Việc này đòi hỏi những kỹ thuật có thể xác định vai trò gây
bệnh của vi-rút như tế bào học hoặc mô bệnh học đi kèm theo bằng những phương pháp
như IHC hay hiển vi điện tử. Cầ
n phải ghi nhận rằng hiện tại qui trình PCR đã được phát
triển đối với hầu hết vi-rút gây bệnh ở thủy sản giúp cho việc sàng lọc và xác định vi-rút
mới khá hiệu quả. Tuy nhiên việc sử dụng PCR thuần túy để chẩn đoán bệnh cần phải
được thận trọng khi xác nhận quan hệ giữa vi-rút và dấu hiệu bệnh lý.


32
II.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II
1. Alday de Graindorge, V. and Flegel, T.W. (1999). Diagnosis of shrimp diseases with
emphasis on black tiger prawn, Penaeus monodon.
2. Austin, B., and Austin, D. A. (999). Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed and
wild fish 3rd Edition
3. FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. Fisheries technical paper
402/2.
4. Forbes, B. A., Sahm, D. F., and Weissfeld, A. S. (2002). Laboratory methods in basic
virology In: Diagnostic Microbiology. 11th edition.
5. Hirsh, D. C., MacLachlan, N. J., and Walker, R. L. (2004). Laboratory Diagnosis. In:
Veterinary Microbiology 2nd edition.
6. Lightner, D. V. (1996). A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic Procedures
for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp.
7. Noga, E. J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment.
8. OIE (2006). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals.
9. Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc
Hải. (2002). Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi.
10. Tonguthai, K., Chinabut, S., Somsiri,T., Chanratchakool, P., and Kanchanakhan, S.

(1999). Diagnostic Procedures for Finfish Diseases
11. Từ Thanh Dung, Đặng Thị
Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005). Giáo trình
bệnh học thủy sản.

33