HPV-PCRELISA-Fulltext-Page pot

Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA lai 9 dò genotype 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11
Lê Thúy Quyên*
(1)
, Phạm Hùng Vân
(2)
, Võ Đức Xuyên An
(3)
, Lê Thị Phi Yến
(3)
, Hòang Hiếu Ngọc
(4)
Tóm tắt
Đặt vấn đề: HPV với các kiểu gen nguy cơ cao như 16, 18 là các tác nhân có tiềm năng sinh ung thư. Tại Việt Nam,
do thiếu phương tiên chẩn đóan nên có rất ít các công trình nghiên cứu về tần suất các kiểu gen HPV phát hiện được
trong các quệt cổ tử cung.
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng và phát triển kỹ thuật PCR-ELISA lai với 9 dò đặc hiệu kiểu gen là 16, 18, 31, 33,
35, 39/45 và 6/11 để phát hiện và xác định kiểu gen HPV từ các quệt cổ tử cung.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Bệnh phẩm nghiênc ứu là các quệt cổ tử cung. Để phát hiện và xác định
genotype của human papilloma virus, chúng tôi đã xây dựng kỹ thuật PCR – ELISA với nguyên tắc như sau: đầu
tiên khuếch đại 1 đoạn gen đặc hiệu dài 450 bp nằm trên vùng L1 của HPV để tạo ra những sản phẩm khuếch đại.
Những sản phẩm khuếch đại này đều được đánh dấu DIG trong quá trình thực hiện phản ứng PCR. Sau đó thực hiện
biến tính và lai sản phẩm với các đoạn dò đặc hiệu cho từng genotype đã được gắn trên các giếng ELISA. Sản phẩm
lai gắn trên giếng sẽ được phát hiện bằng cộng hợp là anti – DIG gắn HRPO. Phức hợp này sẽ được phát hiện bằng
chất hiện màu TMB.
Kết quả: Tiến hành thử nghiệm PCR-ELISA trên 84 mẫu bệnh phẩm lấy từ cổ tử cung bằng que Ayre hòa trong
dung dịch nước muối sinh lý được bệnh viện Từ Dũ và một số phòng khám phụ khoa khác gửi đến, chúng tôi ghi
nhận có 45 mẫu có DNA – HPV dương tính chiếm tỉ lệ 55%. Đây là một tỉ lệ khá cao so với các nghiên cứu trước
đây của bệnh viện Hùng Vương thực hiện trên các mẫu xét nghiệm bất kỳ. Sản phẩm PCR-ELISA của 45 mẫu này
sau đó được tiếp tục định genotype bằng kỹ thuật ELISA lai với dò đặc hiệu của 9 genotype được phủ sẵn trên giếng
là 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11; kết quả ghi nhận được như sau: type 16 chiếm 25 trường hợp (56%), các type
khác chiếm tỷ lệ lần lượt là 18 (4%), 31 (2%), 33 (7%), 35 (2%), 39/45 (2%), 6/11 (16%). Có 7 trường hợp không

phát hiện được genotype, chiếm 16%. Với các kết quả này, các tác giả nhận thấy rằng có một tỉ lệ nhiễm những
genotype HPV khác ngoài 9 type thông thường mà các tác giả đã thiết lập trong thử nghiệm ELISA và tỉ lệ này cũng
không phải là ít.
Kết luận: Từ các kết quả nghiên cứu trên, các tác giả cho là kỹ thuật PCR-ELISA là kỹ thuật thích hợp nhất để có
thể triển khai được tại các phòng thí nghiệm lâm sàng có phương tiện PCR để phát hiện và xác định genotype HPV
trong các bệnh phẩm quệt cổ tử cung
Abstract
Genotyping of HPV by PCR – ELISA hybridized 9 genotype specific probes 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 and 6/11
Background: HPV with high risk genotypes as like as 16, and 18 are the potential carcinenous pathogens for
cervical cancer. In Viet Nam, because of the lack of diagnostic tool detecting and genotyping of HPV, there were
still very few studies on the prevalence of HPV genotype detected from cervical swabs.
Aims of the study: Develop the PCR-ELISA hybridized with 9 genotype specific probes 16, 18, 31, 33, 35, 39/45
and 6/11 to detect and genotype HPV from the cervial swabs.
Methods: To detect and identify genotype of HPV, we set PCR – ELISA technique with main principle: First, a 450
bp – DNA HPV in L1 region is amplified by PCR. These PCR product were labelled with DIG in the PCR reaction,
then it will be denatured and hybrided with specific probes which are attached passively to streptavidine in ELISA
wells. Hybrided products will be detected by anti DIG – HRPO conjugate and then detected by TMB.
Results: With 84 samples received from Tu Du hospital and other gynecology clinics, after running PCR reaction,
there are 45 samples positive to DNA – HPV. These 45 PCR products, then, will be genotyped by ELISA method in
which these PCR product will be hybridized with 9 genotypic probes including 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, and 6/11.
The collected result revealed that 25 are belong to type 16 (56%), other types 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11 have 4%,
2%, 7%, 2%, 2%, 11%, respectively. There are 7 samples positive to DNA-HPV but cannot identify genotype, have
16%. Authors realize that there is an unexpected incidence of other HPV types besides 9 HPV types that set up in
ELISA.
Conclusions: In Vietnam, PCR-ELISA is the most suitable technique that can be set up in the clinical laboratories
with PCR facilities to detect and genotyping of HPV in the cervical swabs
Đặt vấn đề
Ung thư cổ tử cung là loại ung thư chiếm tỉ lệ
cao nhất hoặc nhì trong các loại ung thư ở cơ quan
sinh dục nữ, chiếm 12% các bệnh ác tính của phụ

nữ. Xuất độ ở châu Âu và Bắc Mỹ là từ 30 đến 35
ca bệnh mới hàng năm, tính trên 100.000 dân. Tại
Việt, Nam, ung thư cổ tử cung chiếm tỉ lệ 38,55%,
đa số gặp ở phụ nữ độ tuổi 40 – 49
(1)
. Kết quả điều
trị tùy thuộc hoàn toàn vào giai đọan phát triển
của ung thư được phát hiện. Nếu phát hiện và điều
1
*
Tác giả chính,
(1)
Thạc Sĩ, BM Sinh Học, Khoa Khoa Học Cơ Bản, Đại Học Y Dược TP. HCM;
(2)
TS., Bộ Môn Vi Sinh,
Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh;
(3)
Cử Nhân Sinh Học, Công ty Nam Khoa Biotek;
(4)
BS., Bộ Môn Sinh Hóa,
Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
trị khi còn là giai đọan 0, tiên lượng lành bệnh
thường là 100%
(2)
. Trước đây, người ta thấy rằng
có nhiều yếu tố thuận lợi dẫn đến ung thư cổ tử
cung trong đó có human papilloma virus nhưng
cho đến nay, người ta đã phát hiện được rằng HPV
là tác nhân gây ung thư cổ tử cung
(3-5)

. Cho đến
nay, hơn 100 genotype HPV đã được phát hiện
trong đó có khoảng 29 genotype được phân làm 3
nhóm nguy cơ lien quan đến ung thư cỏ tử cung,
đó là: nhóm nguy cơ cao với 15 genotype (16, 18,
31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 và 82) 3
genotype thuộc nhóm nguy cơ cao tiềm tàng (26,
53, 66) và 11 type thuộc nguy cơ thấp (6, 11, 40,
42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, và 81)
(3)
. Phưong pháp
tế bào học (PAP’s smear) được xem là khá hữu
hiệu để tầm soát ung thư cổ tử cung vì xem xét
được quá trình biến đổi của tế bào niêm mạc cổ tử
cung từ bình thường sang ác tính. Tuy nhiên,
phương pháp tế bào học không phải là phương
pháp duy nhất để tầm soát bệnh. Cùng với sự phát
triển của sinh học phân tử, người ta đã phát triển
những kỹ thuật mới có khả năng phát hiện những
type HPV có nguy cơ cao vơi độ nhạy và độ chính
xác cao. Từ vai trò hỗ trợ cho xét nghiệm tế bào,
những phương pháp này dần trở thành chủ yếu để
sàng lọc sớm ung thư cổ tử cung
(6-11)
. Trước khi có
kỹ thuật khuếch đại, người ta dùng kỹ thuật lai tại
chỗ với đoạn dò đặc hiệu để phát hiện và định
genotype HPV trong mẫu thử, tuy nhiên, phương
pháp này lại có độ nhạy thấp và phức tạp
(12-14)

.
Ngày nay, đã có nhiều phương pháp phát hiện và
định genotype HPV như kỹ thuật micro array sử
dụng DNA chip, lai trong pha lỏng (hybrid capture
2)
(15,16)
, phương pháp lai trên vạch (InoLiPA)
(17,18)
.
Tuy nhiên, những phương pháp này lại khá đắt
tiền, chưa phù hợp với điều kiện Việt Nam. Vì thế,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm xây dựng
phương pháp PCR – ELISA phát hiện DNA –
HPV đồng thời định genotype của HPV để góp
phần vào việc tầm soát và chẩn đoán sớm ung thư
cổ tử cung ở nước ta.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm: 84 mẫu bệnh phẩm là các mẫu
phết cổ tử cung bằng que Ayre hòa trong dung
dịch nước muối sinh lý hoặc bằng gòn được bệnh
nhân trực tiếp mang đến hoặc do một số phòng
khám hay bệnh viện Từ Dũ ở TP.Hồ Chí Minh gửi
đến phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam
Khoa trong ngày hoặc được lưu ở -20
o
C vào ngày
cuối tuần và được gửi đến công ty Nam Khoa vào
ngày thứ hai tiếp theo.
Trích biệt HPV – DNA từ các mẫu bệnh phẩm:
Đầu tiên, chúng tôi xử lý mẩu bằng dung dịch

PROKPREP tức là dung dịch proteinase
K/detergent do công ty Nam Khoa sản xuất với
mục đích dùng dung dịch này để tiêu hóa các
protein bám trên DNA của virus cũng như trong
bệnh phẩm. Sau đó, chúng tôi sử dụng phương
pháp ly trích DNA bằng phương pháp
phenol/choloform với bộ thuốc thử DNAPREP
PHCHL do công ty Nam Khoa sản xuất để trích
biệt DNA từ mẫu.
Phát hiện HPV- DNA: Dùng 10µl dịch ly trích
cho vào tube chứa sẵn HPV – ELISA mix. PCR
mix này dùng để phát hiện và định genotype của
HPV do công ty Nam Khoa sản xuất với các thành
phần chủ yếu là PCR buffer (Biorad), dNTP
(Roche), Taq polymerase (Biorad), mồi MY09 và
MY11 (Invitrogen) và dUTP có gắn DIG (Roche)
được pha với các nồng độ thích hợp để khuếch đại
môt đoạn DNA dài 450 bp trên vùng gen L1 của
HPV đồng thời sẽ tạo ra những sản phẩm PCR có
đánh dấu DIG. Sau đó chạy chương trình luân
nhiệt dành cho HPV như sau: 40
o
C trong 10 phút;
95
o
C trong 5 phút; 95
o
C trong 30giây và 70
o
C

trong 30 giây được lặp lại 20 chu kỳ; sau đó là
95
o
C trong 1 phút, 55
o
C trong 1 phút và 72
o
C
trong 1 phút được lặp lại trong 35 chu kỳ kế tiếp;
cuối cùng là 72
o
C trong 10 phút. Sản phẩm khuếch
đại được điện di trên gel agarose 2% pha trong
TBE 0.5X (dùng bộ AGE do công ty Nam Khoa
sản xuất) cùng với một giếng chứa thang DNA
chuẩn từ 100 – 1000 bp (Biorad) với mỗi băng
DNA chuẩn cách nhau 100 base. Kết quả được
cho là dương tính khi vạch khuếch đại rõ nét ở vị
trí 450 bp.
Xác định genotype của HPV: Những mẫu HPV
– DNA (+) được tiến hành xác định genotype như
sau: Chúng tôi sử dụng các giếng ELISA đã được
phủ streptavidin và đã gắn kết thụ động lần lượt
với các đoạn dò đặc hiệu cho các genotype của
HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11 trên từng
giếng tương ứng của 1 thanh ELISA.Thực hiện
biến tính sản phẩm PCR ở 95
o
C trong 10 phút, sản
phẩm sau khi biến tính phải được giữ ngay trong

đá để duy trì tình trạng biến tính. Sau đó chúng tôi
tiến hành lai những sản phẩm PCR đã được biến
tính vào các giếng ELISA, với mỗi thanh ELISA
tương ứng với 1 mẫu. Khi đó, đoạn dò sẽ tóm bắt
đặc hiệu với mỗi mạch đơn (đã được đánh dấu
DIG) tương ứng với từng genotype. Sau đó, sản
phẩm lai gắn trên giếng sẽ được phát hiện bằng
cộng hợp là anti – DIG gắn HRPO. Phức hợp này
sẽ được phát hiện bằng chất hiện màu TMB. Kết
quả sẽ được đọc ở bước sóng 450nm. Khi OD của
giếng có giá trị > 1.7 OD của giếng chứng âm và
có trị số cao nhất so với OD của các giếng khác
trong cùng một mẫu thì đó là kiểu gen của mẫu.
Nếu tất cả các giếng có OD < OD của giếng chứng
2
âm thì kết luận là mẫu dương tính với HPV nhưng
với kiểu gen khác với kiểu gen 16, 18, 31, 33, 35,
39/45, 6/11.
Kết quả
Kết quả phát hiện HPV dựa trên PCR khuếch
đại đoạn DNA dài 450bp trên gene L1: Trong
thời gian từ 15/03/2005 – 15/07/2005, chúng tôi
đã thử nghiệm được 84 mẫu bệnh phẩm. Hình 1
trình bày kết quả PCR của 84 mẫu DNA đã được
trích biệt. Kết quả cho thấy là có những mẫu
không hiện lên vạch sáng nào, điều này chứng tỏ
mẫu âm tính với DNA-HPV, có những mẫu hiện
lên vạch sáng tương ứng vạch 450bp, rõ chứng tỏ
mẫu dương tính với DNA – HPV. Trong tổng số
84 mẫu bau đầu, sau khi chạy PCR, có 45 mẫu

dương tính chiếm tỉ lệ 55% và 39 mẫu âm tính
chiếm tỉ lệ 45%.
Kết quả phát hiện genotype HPV: Với 45 mẫu
dương tính, chúng tôi tiến hành định genotype
bằng phương pháp ELISA và đã thu được kết quả
nhu sau: type 16 có 25 trường hợp, chiếm đa số (tỉ
lệ 56%), các genotype khác lần lượt chiếm tỉ lệ là
18 (4%), 31 (2%), 33(7%), 35(2%), 39/45(2%),
6/11(11%). Có 7 trường hợp (16%) không xác
định được genotype. Biểu đồ 1 dưới đây trình bày
tỷ lệ các genotype HPV phát hiện được.
Bàn luận Trong kết quả thu nhận được, chúng tôi nhận
thấy có đến 16% các trường hợp dù PCR dương
tính rất rõ với HPV nhưng vẫn không thể định
3
56%
4%
2%
7%
2%
2%
11%
16%
Genotype 16
Genotype 18
Genotype 31
Genotype 33
Genotype 35
Genotype 39/45
Genotype 6/11

Không xác đ?nh
Genotype 16
Genotype 18
Genotype 35
Genotype 33
Genotype 31
Genotype 39/45
Genotype 6/11
Không xác định
Biểu đồ 1: Số trường hợp phát hiện genotype của HPV.
Hình 1: Kết quả PCR phát hiện HPV của 84 mẫu DNA trích biệt từ quệt cổ tử cung bệnh nhận. Các số thứ tự
được đánh dấu bên bước là mã số của mẫu thử nghiệm. MK là thang DNA chuẩn từ 100 đến 1000bp với các
vạch cách nhau 100bp.
được genotype. Điều này chứng tỏ có một số
genotype mà chúng tôi chưa phủ dò đặc hiệu lên
trên giếng ELISA. Do vậy chúng tôi đã thực hiện
lai thêm sản phẩm PCR với dò của genotype 58.
Kết quả trong 7 mẫu không xác định được
genotype này có 3 mẫu dương tính với genotype
58. Còn 4 mẫu còn lại chúng tôi đã thực hiện kỹ
thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR và kết
quả cho thất có 1 là genotype 52, 1 là genotype 54,
một là genotype 62 và 1 là genotype 83 (kết quả
này được trình bày trong một bài báo tiếp theo sắp
đăng). Như vậy để có thể hòan thiện được kỹ thuật
PCR-ELISA, chúng tôi cho rằng vấn đề kỹ thuật
cần phải giải quyết đó là nên có thêm các giếng
phủ thêm các dò đặc hiệu genotype, lí tưởng nhất
là đủ 29 genotype
(3)

của đủ 3 nhóm nguy cơ cao,
tiềm tàng hay nguy cơ thấp. Tuy nhiên nấu làm
như vậy thì vấn đề phải giải quyết tiếp theo là giá
thành vì như vậy một mẫu bệnh phẩm là phải thực
hiện trên ½ bảng nhựa ELISA và 6 HPV-PCR
ELISA mix, do vậy giá thành sẽ đắt hơn 6 lần giá
củ. Chính vi vậy con đường đi thích hợp nhất là có
thêm các mẫu thử để thăm dò các genotype
thường lưu hành để xây dựng bộ thuốc thử PCR-
ELISA phát hiện HPV, và đây chính là đích nhắm
mà chúng tôi đang tiếp tục thực hiện.
Về mặt nguyên tắc, có nhiều cách để xây dựng
kỹ thuật PCR-ELISA phát hiện và định genotype
của HPV
(19)
. Chúng tôi chọn cách dùng DIG dUTP
để đánh dấu sản phâm PCR vì theo kinh nghiệm
chúng tôi thấy rằng đây là phương pháp khá nhạy,
ngòai ra chúng ta có thể chế sẵn các bản nhựa
ELISA phủ sẵn probe thông qua cầu nối
Streptavitin trên bản nhựa và Biotin trên đầu 5’
của dò đặc hiệu. Tất cả các kỹ thuật để chế tạo bản
nhựa phủ streptavidine và sau đó phủ dò đặc hiệu
chúng tôi đã có sẵn và thành thục. Đây cũng chính
là yếu tố giúp làm giảm giá thành của sản phẩm
khi chế tạo kit.
Dù với số mẫu còn giới hạn, nhưng kết quả cũng
cho thấy tỷ lệ cao (55%) nhiễm HPV của các mẫu
thử lấy từ cổ tử cung của phụ nữ gửi đến xét
nghiệm tại phòng nghiên cứu và phát triển của

công ty Nam Khoa. Sự phân bố các genotype cũng
cho thấy đa số là có mang các genotype nguy cơ
cao mà chủ yếu là genotype 16. Tuy nhiên đây chỉ
là những số liệu nhỏ chưa thể nói lên được sự
phân bố dịch tễ học của các genotype HPV lưu
hành. Việc xây dựng thành công bộ kit PCR-
ELISA thích hợp tại Việt Nam sẽ có giá trị đóng
góp lớn sau này trong các điều tra dịch tễ học như
vậy.
Kết luận.
Phát hiện và định genotype của HPV trong các
mẫu quệt cổ tử cung là xét nghiệm rất cần thiết để
chẩn đoán và tầm soát sớm ung thư cổ tử cung và
nếu xét về mặt địch tễ học thì xét nghiệm này
cũng nên được đưa vào sử dụng đại trà để xác
định được các genotype lưu hành trong các vùng
dịch tễ khác nhau đồng thời từ đó giúp tiên đoán
và đánh giá được sự hữu dụng của các phươgn
pháp phòng chống lây nhiễm cững như sự hữu
hiệu của vaccine phòng ngừa sẽ được đưa vào áp
dụng cho dân số trong tưong lai. Mặc dù phương
pháp PCR – ELISA được xem là khá hữu hiệu để
phát hiện và định genotype HPV nhưng phương
pháp này bị giới hạn số genotype HPV cần xác
định vì phụ thuộc vào đọan dò đặc hiệu cho từng
genotype cũng như bị hạn chế về số giếng cần để
thử nghiệm. Trong tương lai, chúng tôi sẽ hoàn
thiện thêm kỹ thuật ELISA bằng cách gia tăng số
genotype cần được phát hiện chứ không dừng lại ở
9 genotype như trên. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng

sẽ tích cực nghiên cứu để đưa vào một kỹ thuật
mới cũng nhằm để phục vụ cho việc xác định
genotype của HPV được chính xác và đa dạng hơn
đồng thời giúp hoàn thiện them bộ kit PCR –
ELISA hiện có.
Tài liệu tham khảo.
1. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh.
Bộ môn Ung bướu. Ung thư học lâm sàng.Ung
thư cổ tử cung: p191 - 210
2. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh.
Bộ môn Sản Phụ Khoa. Ung thư cổ tử cung: p918
– 929 (2000)
3. Munoz., N., F.X. Bosch, S. de Sanjose, R.
Herrero, X. Castellsague, K.V. Shah, P.J.
Snijders, and C.J. Meijer Epidemiologic
classification of human papillomavirus types
associated with cervical cancer. (2003) Feb
6;348(6):518-27
4. Castellsaque X, Diaz M et al, Worldwide human
papillomavirus etiology of cervical
adenocarcinoma and its cofactors: implications
for screening and prevention. J Natl Cancer Inst.
2006 Mar 1;98(5):303-15
5. Chen CA, Liu CY, Chou HH, Cho CM, Twu NF
et al. The distribution and differential risks of
human papillomavirus genotypes in cervical
preinvasive lesions: A Taiwan Cooperative
Oncologic Group Study. Int J Gynecol Cancer
(2006) Sep-Oct;16(5):1801-8.
6. Bosch, F. X., A. Lorincz, N. Munoz, C. J. Meijer,

and K. V. Shah. 2002. The causal relation
between human papillomavirus and cervical
cancer. J. Clin. Pathol. 55:244–265.
7. Bosch, F. X., and S. de Sanjose. 2003. Chapter 1:
Human papillomavirus and cervical cancer-
4
burden and assessment of causality. J. Natl.
Cancer Inst. Monogr. 31:3–13.
8. Dannecker, C., U. Siebert, C. J. Thaler, D.
Kiermeir, H. Hepp, and P. Hillemanns. 2004.
Primary cervical cancer screening by self-
sampling of human papillomavirus DNA in
internal medicine outpatient clinics. Ann. Oncol.
15:863–869.
9. Jin, X. W., K. Zanotti, and B. Yen-Lieberman.
2005. New cervical cancer screening strategy:
combined Pap and HPV testing. Cleveland Clin.
J. Med. 72:141–148.
10. Munoz, N., S. Franceschi, C. Bosetti, V. Moreno,
R. Herrero, J. S. Smith, K. V. Shah, C. J. Meijer,
and F. X. Bosch. 2002. Role of parity and human
papillomavirus in cervical cancer: the IARC
multicentric case-control study. Lancet 359:1093–
1101.
11. Nieminen, P., S. Vuorma, M. Viikki, M. Hakama,
and A. Anttila. 2004. Comparison of HPV test
versus conventional and automation-assisted Pap
screening as potential screening tools for
preventing cervical cancer. BJOG 111:842–848.
12. Melchers, W. J., P. Herbrink, W. G. Quint, J. M.

Walboomers, C. J. Meijer, and J. Lindeman. 1988.
Prevalence of genital HPV infections in a
regularly screened population in The Netherlands
in relation to cervical cytology. J. Med. Virol.
25:11-16.
13. Melchers, W. J., P. Herbrink, J. M. Walboomers,
C. J. Meijer, H. V. D. Drift, J. Lindeman, and W.
G. Quint. 1989. Optimization of human
papillomavirus genotype detection in cervical
scrapes by a modified filter in situ hybridization
test. J. Clin. Microbiol. 27:106-110.
14. Walboomers, J. M., W. J. Melchers, H. Mullink,
C. J. Meijer, A. Struyk, W. G. Quint, J. van der
Noordaa, and J. ter Schegget. 1988. Sensitivity of
in situ detection with biotinylated probes of
human papilloma virus type 16 DNA in frozen
tissue sections of squamous cell carcinomas of the
cervix. Am. J. Pathol. 131:587-594
15 Cox, J. T., A. T. Lorincz, M. H. Schiffman, M. E.
Sherman, A. Cullen, and R. J. Kurman. 1995.
Human papillomavirus testing by hybrid capture
appears to be useful in triaging women with a
cytologic diagnosis of atypical squamous cells of
undetermined significance. Am. J. Obstet.
Gynecol. 172:946-954.
16. The Atypical Squamous Cells of Undetermined
Significance/Low-Grade Squamous Intraepithelial
Lesions Triage Study (ALTS) Group. 2000.
Human papillomavirus testing for triage of
women with cytologic evidence of low-grade

squamous intraepithelial lesions: baseline data
from a randomized trial. J. Natl. Cancer Inst.
92:397-402
17. Kleter, B., L. J. Van Doorn, L. Schrauwen, A.
Molijn, S. Sastrowijoto, J. ter Schegget, J.
Lindeman, B. ter Harmsel, M. Burger, and W.
Quint. 1999. Development and clinical evaluation
of a highly sensitive PCR-reverse hybridization
line probe assay for detection and identification
of anogenital human papillomavirus. J. Clin.
Microbiol. 37:2508-2517
18. Melchers, W. J., J. M. Bakkers, J. Wang, P. C. de
Wilde, H. Boonstra, W. G. Quint, and A. G.
Hanselaar. 1999. Short fragment polymerase
chain reaction reverse hybridization line probe
assay to detect and genotype a broad spectrum of
human papillomavirus types. Clinical evaluation
and follow-up. Am. J. Pathol. 155:1473-1478.
19 Phạm Hùng Vân. 2005. PCR-ELISA and real-
time PCR – Principle and applications. Short
course focusing on the advanced PCR that
can be appied in developing countries
5