Một số Enzym sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử doc

1. ENZYM GIỚI HẠN (restriction enzyme,
RE)
1.1. Tên gọi các enzym giới hạn
1.2. Các loại enzym giới hạn
1.3. Các RE loại II
2. MỘT SỐ ENZYM KHÁC THƯỜNG SỬ
DỤNG TRONG KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ



Tế bào vi khuẩn bị phage phá hủy



Một số tế bào vi khuẩn không bị
phá hủy
do DNA của phage đoạn nhỏ
Enzym
(cắt)
phage
(thực
khuẩn thể)
(hiện tượng giới hạn)
phage
(thực
khuẩn thể)
Enzym giới hạn (Restriction enzyme, RE) :

có khả năng cắt DNA phage ở những vị trí nhất định

thành những đoạn ngắn.

thuộc nhóm enzym endonuclease, cắt các liên kết
phosphodieste trong phân tử DNA.
Ví dụ:

Hae III cắt DNA ở giữa 4 cặp nucleotid
GG CC
CC GG


Sma I cắt DNA bằng giữa 6 cặp nucleotid

CCC CCC
GGG GGG

EcoR I cắt DNA lệch giữa 6 cặp nucleotid

G AATTC
CTTAA G

Đặc tính của RE:

cắt DNA không đặc hiệu loài: RE tách chiết
từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động
vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí
giới hạn hay điểm giới hạn.

Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay
ngắn, tùy thuộc vào số lượng điểm giới hạn

trên phân tử DNA.

Điều kiện hoạt động :
- nhiệt độ
- dung dịch đệm thích hợp

Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế
bào prokaryote.
Chưa có hệ thống nào tương đương
được phát hiện ở eukaryote.
1.1.Tên gọi các enzym giới hạn
Tên Giống Loài Chủng Thứ tự dòng
Escherichia coli Ry13
EcoR I E co R I
EcoR V E co R V
Serratia martesens
Sma I S ma I
Hemophilus aegypticus
Hae III H ae III
3 loại (dựa vào khả năng nhận biết và cắt một
trình tự xác định trên phân tử DNA):
Loại I
nhận biết được trình tự đặc hiệu, cắt cách vị trí
giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotid cắt tại đó
và phóng thích độ vài chục nucleotid.
Loại II
nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.
Loại III
nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó
khoảng 20 nucleotid về phía trước.

1.3.1. Trình tự nhận biết

Mỗi enzym giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một
đoạn DNA có trình tự từ 4 – 6 cặp nucleotid.

Các RE khác nhau có cùng một trình tự nhận biết
được gọi là isoschisomers.

Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính
chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotid của trình tự
có thể được thay thế bởi nucleotid khác.
Ví dụ: A
NspI GGGCCC
T
Bgl I GCCNNNNNGGC


Cấu trúc palindromic
EcoR I 5’G AATT C 3’
3’C TTAA G 5’

1.3.2. Các kiểu cắt của các enzym RE loại II

Cắt tạo đầu bằng (blunt ends)
Sma I
5’…CCCGGG….3’
3’…GGGCCC….5’


5’…CCC GGG…3’

3’…GGG CCC…5’
không có khả năng tự kết hợp lại.
Để nối phải dùng enzym T4 DNA ligase

Cắt tạo đầu so le hay đầu dính (cohesive ends):
Các đầu so le có thể tự nối lại không cần DNA ligase,
được sử dụng rất nhiều trong công nghệ tái tổ hợp
1.3.3. Một số điều kiện cần lưu ý khi tạo một phản ứng thủy
giải bởi RE

Chú ý đến điều kiện nhiệt độ, pH và
dung dịch đệm thích hợp

Bảo quản ở -20
o
C RE sẽ giữ được hoạt
tính

Thể tích RE = 1/10 thể tích phản ứng
1.3.4. Ứng dụng

Nghiên cứu bộ gen của eukaryote.

Phương pháp tạo dòng (cloning)

Lập bản đồ giới hạn (restriction map)

Phân tích so sánh bộ gen ở các loài khác nhau
nhờ kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism, tính đa hình kích thước của các

trình tự giới hạn).
2.1. Các enzym polymerase
Các DNA polymerase
Các RNA polymerase
2.2. Các ligase
2.3. Các nuclease
Polymerase: enzym xúc tác sự tổng hợp DNA và sự tổng hợp
RNA.
2.1.1. Các DNA polymerase

Xúc tác sự tổng hợp DNA, theo chiều 5’ – 3’.

Cơ chất: phần lớn là DNA để làm khuôn (DNA polymerase I, T4
DNA polymerase, Taq Polymerase).

Đặc biệt Transcriptase ngược (Reverse transcriptase) : khuôn
là RNA để tổng hợp DNA.

Terminal transferase: không tổng hợp một đoạn DNA mới từ
khuôn mà chỉ thêm các nucleotid vào đầu của một phân tử
DNA có sẵn,

Các DNA polymerase khi hoạt động cần có mồi (primer)
DNA polymerase I (DNA pol I)

Hoạt tính :
- hoạt tính polymerase: tổng hợp
-hoạt tính exonuclease: thủy phân các liên kết
phosphodieste giữa các nucleotid từ đầu
phân tử DNA, phóng thích từng nucleotid theo

cả chiều 5’
→
3’ và 3’
→
5’.

Vai trò:
- xúc tác sự tổng hợp một mạch đơn DNA mới
- sửa chữa sai sót trong quá trình nhân đôi
DNA.

Ứng dụng :
- Xác định trình tự DNA bằng phương
pháp dideoxynucleotid
- Tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao
- Thiết kế các vectơ từ DNA mạch đơn
- Trong thực tế, sử dụng đoạn Klenow
(Klenow fragment) có hoạt tính
polymerase và exonuclease 3’
→
5’,
không có hoạt tính exonuclease 5’
→
3’
T4 DNA polymerase

có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli.

Hoạt tính:

- giống hệt như hoạt tính của đoạn Klenow
- nhưng do hoạt tính exonuclease 3’- 5’
mạnh hơn nên được sử dụng nhiều hơn khi
cần tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao.
Taq DNA polymerase

trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus là
một enzym chịu nhiệt nên thường
được sử dụng trong phản ứng PCR
(Polymerase Chain Reaction).

PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn
DNA đặc hiệu nhờ enzym DNA
polymerase trên máy luân nhiệt
(thermal cycler).
Transcriptase ngược (Reverse transcriptase)

do các retrovirus sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của
chúng trong tế bào ký chủ.

3’ 5’ (RNA)
RT (Reverse transcriptase)
5’ 3’ (cDNA, complementary
DNA)

Ứng dụng:

Thiết lập ngân hàng cDNA (cDNA library)

Phản ứng RT – PCR


Xác định trình tự acid nucleic bằng phương pháp sử dụng các
dideoxynucleotid.

Trên thị trường, transcriptase ngược có nguồn gốc từ AMV
(Avian Myeloblastosis Virus) và MMLV (Moloney Murine
Leukemia Virus).
Terminal transferase

ly trích từ tuyến ức của bê

xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotid vào đầu
3’- OH tự do của phân tử DNA

Gắn ngẫu nhiên nên thành phần nucleotid của
chuỗi polynucleotid mới hình thành hoàn toàn phụ
thuộc nồng độ của 4 loại nucleotid có trong phản
ứng

Ứng dụng:

Thêm đuôi polynucleotid (tailing) để tạo đầu so le
cho phân tử DNA, dùng trong kỹ thuật tạo dòng
(cloning)

Đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phương
pháp xác định trình tự acid nucleic Maxam và
Gilbert
2.1.2. Các RNA polymerase


sử dụng nhiều nhất: SP6 RNA polymerase, T3 và T7
RNA polymerase.

SP6 RNA polymerase được tách chiết từ phage xâm
nhiễm Salmonella typhimurium.

T3 và T7 RNA polymerase được tách chiết từ phage
xâm nhiễm E. coli.

Xúc tác sự tổng hợp RNA từ một mạch của một phân
tử DNA mạch đôi theo chiều 5’
→
3’.

Không cần mồi nhưng khuôn DNA phải có mang một
promoter đặc trưng của phage.

Dùng để tạo một lượng lớn RNA từ một trình tự DNA
được nối ngay sau một promoter thích hợp.