ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN T Ử

Chương 4: ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ

Tóm tắt: Enzyme là những protein hoạt tính sinh học vả dựa vào loại phản ứng
xúc tác mà trong sinh học phân tử có thể chia enzyme thành 6 nhóm khác nhau.
Trong đó các nhóm enzyme giới hạn, enzyme polimerase, enzyme nối, các
enzyme nuclease được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực của
sinh học phân tử và kĩ thuật di truyền. Enzyme được sử dụng trong các kĩ thuật
sinh học phân tử như RFLP, PCR, tách dòng phân tử.........
Nội dung của chương gồm 3 vấn đề cơ bản: (1). Enzyme giới hạn, (2). các
nhóm enzyme khác; (3). Enzyme nuctease.

Hệ thống enzyme có thể chia thành 6 nhóm tuỳ theo loại hình phản ứng
mà các enzyme này xúc tác. Nhóm enzyme nuclease có tác dụng cắt và phá huỷ
ADN, nhóm ADN-ligase có chức năng nối các trình tự ADN lại. nhóm enzyme
ADN-polimerase tham gia tổng hợp chuỗi polinucleotit, nhóm enzyme ADN-
polimerase sửa chữa có chức năng sửa chữa những sai sót trong phân tử ADN,
nhóm enzyme topoisommerase tác dụng mở xoắn ADN, nhóm enzyme phiên mã
ngược reverse-transcriptase xúc tác cho quá trình phiên mã ngược từ ARN thành
cADN. Các nhóm enzyme trên có vai trò hết sức quan trọng trong các thao tác
với ADN và trong công nghệ ADN tái tổ hợp. Trong số đó có các nhóm enzyme
giới hạn, enzyme sửa chữa ADN, ADN-polimease, ADN-ligase....

§1. ENYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME HOẶC ENZYME CẮT
HẠN CHẾ (RESTRICTION ENDONUCLEASE - RE)
1.1. Khái niệm
Nhóm enzyme nuclease gồm DN-ase và RN-ase có khả năng bẻ gãy liên
kết phosphodiester kết quả là phân huỷ phân tử ADN hoặc ARN.
Nhóm enzyme ADN-ase gồm 2 loại: Exonuclease (enzyme cắt ADN
ngoại bào) có tác dụng cắt từng cặp nucleotit từ hai đầu của đoạn ADN đi dần
vào bên trong (hình 4.1). Enzyme exonuclease có thể cắt tỉa từng cặp nucleotit ở

cả hai mạch (cắt kép) hoặc cắt từng nucleotit trên một sợi ADN (cắt đơn).
Endonuclease (enzyme cắt ADN nội bào) có tác dụng cắt rời ADN tại những
vùng xác định gồm vài cặp nucleotit nằm cạnh nhau định vị trong phân tử ADN,
tạo thành những phân đoạn ADN nhỏ hơn. Enzyme endonuclease có thể cắt đơn

50
hoặc cắt kép (hình 4.1).

Hình 4.1. Đặc điểm cắt của exonuclease và endonuclease
Một loại enzyme endonuclease có thể nhận biết vị trí nhất định bên trong
phân tử ADN và cắt đặc hiệu, cắt một lần tại một điểm đó. Những kết luận trên
đã được phát hiện trong thập kỉ 60 của thế kỉ XX. Trong những thí nghiệm ở vi
khuẩn người ta đã phát hiện một nhóm các enzyme có thể nhận biết và phân cắt
phân tử ADN của phagơ khi ADN ngoại lai này bảo vệ tế bào chủ xâm nhập.
Các enzyme này bảo vệ tế bào chủ khỏi bị nhiễm phagơ - đó là các enzyme giới
hạn.
Enzyme cắt hạn chế (enzyme giới hạn) là loại enzyme nuclease có khả
năng nhận biết được điểm cắt và cắt tại điểm xác định. Tuy nhiên vấn đề đặt ra
là, liệu enzyme giới hạn cắt ADN của chính tế bào chủ? Những nghiên cứu cho
thấy các enzyme giới hạn phân huỷ bất kì ADN ngoại lai nào xâm nhập vào tế
bào; trong tế bào hệ thống enzyme sửa đổi (methylase) sửa đổi ADN tế bào chủ
bằng cách methyl hoá các bazơ xác định của đoạn trình tự nhận biết, nhờ vậy
ngăn cản enzyme giới hạn cắt vào ADN của tế bào chủ.
Những enzyme này là đại diện của một trong các nhóm enzyme quan trọng nhất

51
dùng trong thao tác ADN.
1.2. Các nhóm enzyme giới hạn
Các enzyme giới hạn có ba nhóm I, II, III và các enzyme giới hạn được
dùng phổ biến ngày nay thuộc nhóm II. Enzyme giới hạn nhóm II có cơ chế tác

động đơn giản nhất, chúng là các nuclease, và vì chúng cắt tại một vị trí nằm bên
trong sợi ADN và không phân huỷ ADN từ hai đầu, nên gọi là endonuclease.
Bảng 4.1. Đặc điểm của các loại enzyme giới hạn
Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III
Điểm cắt Xa điểm nhận biết
hơn 1000 bp
Nằm trong điểm
nhận biết
Nằm ngoài điểm
nhận biết nhận biết
Khả năng methy hóa gốc
Adenine
Có Không Có
Điều kiện để cắt ATP,Mg
++
, Mg
++

S-AdoMet
Mg
++
hoặc Mn
++
Mg
++
, S-AdoMet
Cấu trúc của enzyme (số
chuỗi polipeptide)
Khác nhau Giống nhau Khác nhau

Hình 4.2. Quá trình methyl hoá bởi enzyme methylase
Cách gọi tên các enzyme giới hạn dựa trên các quy ước quốc tế. Tên chi
và tên loài của sinh vật, mà ở đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần

52
đầu của tên enzyme, phần đó gồm chữ thứ nhất của tên chi và hai chữ đầu của
tên loài. Chẳng hạn enzyme tách chiết được từ một nòi của Escherichia coli thì
đặt tên là Eco, còn enzyme tách từ Bacillus amiloliquefaciens thì gọi là Bam...
Hai loại enzyme được sử dụng rộng rãi được tách ra từ các vi khuẩn nói trên là
EcoRI và BamHI.
Ví dụ: EcoRI: RE tách từ vi khuẩn E. coli, dòng R, nhóm I.
HindIII: RE tách từ vi khuẩn Heamophilus influenzae, dòng d, nhóm III.
Enzyme giới hạn có tính đặc hiệu, mỗi enzyme cụ thể nhận biết một đoạn
trình tự đặc thù các bazơ trên ADN, đoạn nhận biết phổ biến nhất có chiều dài từ
4 - 6 bp. Nếu một trình tự ADN có 4 bp thì cứ 4
4
= 256 bp lặp lại một lần, trình
tự có 5 bp thì cứ 4
5
= 1024 bp lặp lại, trình tự có 6 bp thì cứ 4
6
= 4096 bp mới
lặp lại. Chẳng hạn, một enzyme nhận biết trình tự có 4 bp sẽ tạo ra đoạn ngắn
hơn so với trình tự có 6 bp.
Loại hình của các đoạn ADN do một enzyme cụ thể tạo ra tuỳ thuộc vào
trình tự nhận biết và vào vị trí của điểm cắt trong trình tự này. Như chúng ta đã
thấy, chiều dài của đoạn này phụ thuộc vào tần số lặp lại của trình tự nhận biết.
Điểm cắt thực tế của enzyme quyết định hình dạng của đầu bị cắt. Hình dạng
này rất quan trọng đối với việc thao tác tiếp ADN. Có hai kiểu hình dạng các

đoạn có thể sinh ra: (1) Các đoạn đầu bằng (blunt ends); (2) Các đoạn đầu dính
(so le) với 2 kiểu: đoạn có đầu 3' nhô ra; và đoạn có đầu 5' nhô ra.

Hình 4.3. Các kiểu cắt của RE nhóm II
Các enzyme như PstI và EcoRI tạo ra các đoạn ADN có đầu dính, chúng
có thể bắt cặp bazơ với trình tự bổ sung cũng do chính enzyme đó tạo ra. Như
vậy, bằng cách cắt hai mẫu ADN khác nhau bởi cùng một enzyme và trộn các

53
đoạn đó với nhau có thể tạo ra ADN tái tổ hợp. Bằng cách này các đoạn ADN
nguồn khác nhau có thể nối lại với nhau nếu chúng có các đầu dính do enzyme
giới hạn sinh ra. Khi các vùng bổ trợ ghép với nhau thì bộ khung photphodiester
được gắn lại bằng ADN ligase.
Trong thực nghiệm, người ta trộn một lượng thích hợp enzyme với ADN
caanf nghiên cứu trong dung dịch đệm, cho phản ứng diễn ra ở 37
0
C. Hoạt tính
enzymc được do bằng đơn vị tương đương với lượng enzyme cần thiết để một
microgam ADN trong một giờ ở 37
0
C.
1.3. Lập bản đồ cắt giới hạn
Phần lớn các đoạn ADN đều có các điểm nhận biết đối với nhiều enzyme
giới hạn khác nhauvà nếu biết được vị trí tương đối của một số điểm này thì có
thể lập được bản đồ các điểm giới hạn. Trong kĩ thuật này, người ta sử dụng các
enzyme giới hạn để cắt một đoạn ADN, sau đó điện di trên agrose, chụp ảnh
phân tích được kích thước các đoạn ADN bị cắt. Từ các kết quả phân tích có thể
xác định được vị trí tương đối của các điểm được cắt trên phân tử ADN.

Hình 4.4. Kiểu cắt của một số loại enzyme

Giả sử chúng ta muốn lập bản đồ các điểm cắt của các enzyme BamHI,
EcoRI và Psd đối với đoạn ADN có chiều dài 15kb, kết quả thu được như sau:
Nếu chỉ sử dụng riêng lẻ một loại enzyme thì đoạn ADN dài 15 kb sẽ bị
cắt thành 2 đoạn có kích thước khác nhau.
BamHI cắt đoạn ADN thành 2 đoạn với kích thước 14 kb và 1 kb
EcoRI cắt đoạn ADN thành 2 đoạn với kích thước 12 kb và 3 kb

PstI cắt đoạn ADN thành 2 đoạn với kích thước 8 kb và 7 kb

54