Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương việt nam

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ABA Abcisis acid
DNA Deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
ATP Adenozin triphosphata
ATP-ase Enzym phân giải ATP
cDNA Sợi DNA bổ sung được tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym
phiên mã ngược (Complementary DNA)
AS Acetosyringone
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
BAP 6-benzyladenine
bar gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase
bp Base pair
CCM Cocultivation medium -
DEPC Diethyl pyrocarbonate
đtg đồng tác giả
dNTP deoxynucleoside triphosphate
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
E. coli Escherichia coli
GA
3
Gibberellic acid
GM Germination medium – môi trường nảy mầm hạt
GUS β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase
HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)
IAA Indoleacetic acid
IBA Indole-3-butyric acid
IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside
kb kilo base
LB Luria Bertani
LSD Least significant difference = độ lệch chuẩn

LEA Late embryogenesis abundant
MES 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid
MS Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
NAA α-Naphthaleneacetic acid
nptII Neomycin phosphotransferase gene
OD Optical density
P5CS pyroline-5-carboxylate synthetase
P5CDH Pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase
P5CR Pyrroline 5 carboxylate reductase
PDH Pyrroline dehydrogenase

1

rd29A Responsive Dehydration
PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase
RM Rooting medium – môi trường ra rễ
SDS Sodium dodecylsulfat
SIM Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi
SEM Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi
Taq Thermus aquaticus DNA
T-DNA Transfer –DNA = đoạn ADN được chuyển
Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u
TBE Tris - Boric acid - EDTA
TAE Tris - Acetate - EDTA
TE Tris - EDTA
v/p vòng/phút
X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase
YEP Yeast extract peptone

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 0
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ
GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học 4
1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương 5
1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 6
1.2. CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA
CÂY ĐẬU TƯƠNG 10
1.2.1. Khả năng thích nghi của bộ rễ trong điều kiện hạn 11
1.2.1.1.Sự phát triển của bộ rễ 11
1.2.1.2. Khả năng cố định nitơ của cây đậu tương trong điều kiện hạn 13
1.2.2. Các tính trạng liên quan đến sự thích ứng của lá cây đậu tương trong điều kiện
hạn 14
1.2.2.1. Cường độ thoát hơi nước của khí khổng 14
1.2.2.2. Cường độ thoát hơi nước của biểu bì 15
1.2.2.3. Mật độ lông tơ của lá 16
1.2.2.4. Hiệu quả sử dụng nước 17
1.2.3. Đáp ứng về phương diện hóa sinh của cây đậu tương trong điều kiện hạn 18
1.2.4. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn 19
1.3. PROLIN VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME P5CS TRONG CON ĐƯỜNG SINH
TỔNG HỢP PROLIN 21
1.3.1. Quá trình sinh tổng hợp prolin 21
1.3.2. Điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật 23
1.3.3. Vai trò của sự tích lũy prolin đối với tính chống chịu của cây 25

1.3.4. Vai trò của enzym pyrroline-5-carboxylate synthetase đối với tính chống chịu của cây trồng
27
1.4. PROMOTER VÀ VAI TRÒ ĐIỀU KHIỂN HOẠT ĐỘNG CỦA GEN
DƯỚI ĐIỀU KIỆN KHÔ HẠN 29
1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter 29

1

1.4.2. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học 30
1.4.3. Promoter rd29A 32
1.5. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU
TƯƠNG 32
1.5.1. Nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực
nghiệm 32
1.5.2. Sử dụng công nghệ tế bào thực vật trong chọn dòng đậu tương chịu hạn 33
1.5.3. Sử dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương
35
1.5.3.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật 35
1.5.3.2. Tiềm năng của phương pháp chuyển gen ở thực vật trong nghiên cứu tạo cây
đậu tương chịu hạn 37
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 38
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39
2.2.1. Phương pháp sinh lý, hoá sinh 39
2.2.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn 39
2.2.1.2. Định lượng protein, lipit, hàm lượng và thành phần axit amin trong hạt 39
2.2.1.3. Xác định hàm lượng prolin 40
2.2.1.4. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 40
2.2.2. Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro 40
2.2.2.1. Arabidopsis 40

2.2.2.2. Thuốc lá 40
2.2.2.3. Đậu tương 41
2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử 44
2.2.3.1. Thiết kế mồi 44
2.2.3.2. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA 44
2.2.3.3. Phương pháp tổng hợp cDNA 45
2.2.3.4. Phản ứng PCR 45
2.2.3.5. Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention) 46
2.2.3.6. Phương pháp tách dòng 46
2.2.3.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 49
2.2.2.8. Thiết kế cấu trúc rd29A::GUS và rd29A::P5CSM……… ……………49

2.2.3.9. Các phương pháp phân tích cây biến nạp 52

2

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53
3.1. KẾT QUẢ SƯU TẬP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA
PHƯƠNG CỦA TỈNH SƠN LA 53
3.1.1. Đặc điểm hình thái, hóa sinh của hạt đậu tương 53
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu 55
3.2. PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƯỢC 58
3.2.1. Kết quả phân lập gen P5CS 58
3.2.2. Kết quả khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen P5CS 58
3.2.3. Tạo đột biến điểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược P5CS phân lập từ cây đậu tương 69
3.3. PHÂN LẬP VÀ KIỂM TRA HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CẢM ỨNG
KHÔ HẠN rd29A 72
3.3.1. Phân lập promoter rd29A 72
3.3.2. Phân tích trình tự promoter rd29A 73
3.3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A 75

3.3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS 75
3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY THUỐC LÁ
CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC rd29A::P5CSM 78
3.4.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM 78
3.4.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM 81
3.4.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen 82
3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN 84
3.5.1. Kết quả tái sinh tạo đa chồi ở giống đậu tương DT84 84
3.5.1.1. Tối ưu thời gian khử trùng hạt 84
3.5.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi từ lá mầm hạt chín 87
3.5.1.3. Ảnh hưởng của hocmon sinh trưởng GA
3
tới khả năng kéo dài chồi 89
3.5.1.4. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả tạo rễ 91
3.5.1.5. Xác định giá thể thích hợp cho ra cây in vitro 93
3.5.2. Kết quả bước đầu chuyển gen GUS vào cây đậu tương DT84 94
3.5.3. Kết quả chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào đậu tương 96
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO 102




3

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Diện tích sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 7
Bảng 1.2 Sản lượng đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 7
Bảng 1.3 Năng suất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 8

Bảng 1.4 Sản lượng đậu tương tại các tỉnh và thành phố 9
Bảng 1.5 Cây chuyển gen mang gen P5CS 29
Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết 45
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 46
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng OE -PCR 46
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng 47
Bảng 2.5 Thành phần hoá chất tách plasmid 48
Bảng 2.6 Thành phần phản ứng colony - PCR 49
Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt rd29A và vector pBI 101 bằng
BamHI và HindII
50
Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A :: pBI 101 50
Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt rd29A:: P5CSM bằng BamHI và SacI 50
Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A:: pBI 101 51
Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid rd29A :: pBI101 ::P5CSM 52
Bảng 3.1 Các giống đậu tương địa phương sưu tập tại tỉnh Sơn La 53
Bảng 3.2 Chỉ số chịu hạn và tỷ lệ tăng hàm lượng prolin của 7 giống đậu
tương nghiên cứu
57
Bảng 3.3 Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi đặc hiệu gen P5CS 58
Bảng 3.4 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống
đậu tương
64
Bảng 3.5 Vị trí sai khác trong trình tự axit amin của gen P5CS ở 3 giống
đậu tương
65
Bảng 3.6 Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi đặc hiệu gen P5CS 69
Bảng 3.7 Hàm lượng prolin tích lũy trong các dòng thuốc lá nghiên cứu
(µmol/g)
82

4

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến khả năng
nảy mầm đậu tương DT84
85
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí clo đến khả năng
nảy mầm đậu tương DT84
86
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo đa chồi 88
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của GA
3
đến khả năng kéo dài chồi 90
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 92
Bảng 3.13 Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu qua các giai đoạn 97

5

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Chu trình sinh tổng hợp prolin ở thực vật bậc cao 22
Hình 1.2 Cơ chế và các tác nhân điều hòa quá trình trao đổi prolin ở
thực vật
23
Hình 1.3 Vai trò của prolin đối với tính chống chịu của cây 25
Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tái sinh cây đậu tương 42
Hình 2.2
Hình 2.3
Sơ đồ chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm
Tạo vector chuyển gen mang promoter rd 29A
43
49
Hình 3.1

Đồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn tương đối của một số giống
đậu tương địa phương và giống DT84
56
Hình 3.2 Sản phẩm tách RNA 59
Hình 3.3 Kết quả nhân hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84

và SL5
59
Hình 3.4 Kết quả PCR ghép nối hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu
tương DT84 và SL5
60
Hình 3.5 Kết quả tách dòng gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và
SL5
62
Hình 3.6 Trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống đậu tương 64
Hình 3.7 Trình tự axit amin của Protein do gen P5CS mã hóa ở 3 giống
đậu tương
67
Hình 3.8 Mức độ tương đồng của các axit amin gen P5CS mã hóa của
các giống đậu tương.
68
Hình 3.9 Sơ đồ cây phát sinh chủng loại so sánh mức độ tương đồng
của các axit amin của protein do gen P5CS của các giống đậu
68
Hình 3.10

Điện di sản phẩm PCR 70
Hình 3.11

Phản ứng nối hai đoạn gen theo phương pháp OE-PCR với
cặp mồi BamHI-P5CS và Sacl -P5CS
70
Hình 3.12

Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới
hạn BamHI

71
Hình 3.13

Phân tích, so sánh trình tự nucleotid và phát hiện đột biến tại
vị trí nucleotid 374 của gen P5CS
71


6

Hình 3.14

Kết quả nuôi cấy invitro cây Arabidopsis thaliana 72
Hình 3.15

Điện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBT/rd29A 73
Hình 3.16

Phân tích trình tự promoter rd29A 74
Hình 3.17

Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A 75
Hình 3.18

Điện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBI101/rd29A 75
Hình 3.19

Một số hình ảnh chuyển cấu trúc promoter rd29A vào thuốc lá 76
Hình 3.20

Biểu hiện gen GUS trên cây chuyển gen 77
Hình 2.21

Hoạt tính của enzym GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen
mang promoter rd29A dưới điều kiện hạn nhân tạo

78
Hình 3.22

Các sản phẩm cắt đồng thời bằng enzym BamHI và SacI 79
Hình 3.23

Điện di sản phẩm cloning PCR và cắt hạn chế vector pBT
rd29A::/P5CSM
80
Hình 3.24

Kết quả colny PCR chọn dòng trong A. tumefaciens 81
Hình 3.25

Kết quả PCR các dòng chuyển gen bằng cặp mồi rd29A
for/rd29Arev
82
Hình 3.26

Hàm lượng prolin tích lũy trong các thời gian gây hạn nhân tạo

83
Hình 3.27

Các dòng cây thuốc lá sau 20 ngày hạn nhân tạo (A) và sau
phục hồi (B)
84
Hình 3.28

Hạt nảy mầm bằng các phương pháp khử trùng khác nhau 87
Hình 3.29

Cụm chồi hình thành trên môi trường có nồng độ BAP khác nhau 89
Hình 3.30

Chồi kéo dài trên môi trường có nồng độ GA
3
khác nhau 90
Hình 3.31

Ảnh hưởng của IBA tới việc hình thành rễ cây in vitro 93
Hình 3.32

Huấn luyện cây, trồng ở nhà lưới và thu hoạch quả 94
Hình 3.33

Hình 3.34

Biểu hiện của gen GUS
Sơ đồ hoàn chỉnh chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá
mầm
95
96
Hình 3.35

Hình ảnh minh họa quá trình chuyển gen 97
Hình 3.36

Kiểm tra cây đậu tương T0 chuyển gen bằng PCR 98
Hình 3.37

Cây đậu tương T0 chuyển gen 98



1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Cây đậu tương (Glycine max L. Merrill) là một trong những cây trồng quan trọng
không chỉ ở Việt Nam mà còn đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Hạt đậu tương có
thể được dùng làm nguồn thức ăn giàu đạm cho con người và là nguồn nguyên liệu
quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến. Đậu tương là loại cây trồng ngắn
ngày, có giá trị kinh tế cao khi sử dụng làm thương phẩm, và được sử dụng cho mục
đích cải tạo đất. Bên cạnh đó, đậu tương rất dễ canh tác, có khả năng thích nghi với
nhiều vùng sinh thái, khí hậu khác nhau và được trồng ở nhiều vùng quốc gia và vùng
lãnh thổ với sản lượng năm 2009 là trên 222 triệu tấn [107].
Tại Việt Nam, cây đậu tương cũng giữ vai trò rất quan trọng trong cơ cấu cây
trồng ở nhiều địa phương, với sản lượng trung bình từ 2001 - 2009 là 239,1 nghìn tấn.
Theo thống kê năm 2009 cho thấy, cây đậu tương được canh tác có hệ thống trên diện
tích là 146,2 nghìn ha ở 28 tỉnh thành trải đều từ Bắc vào Nam, nhưng tập trung chủ
yếu vẫn là ở miền Bắc với sản lượng của cả nước là 213,6 nghìn tấn [107]. Trong khu
vực ASEAN, năng suất đậu tương năm 2009 của Việt Nam đứng thứ 3 trong số 6 nước

trồng đậu tương là Campuchia, Lào, Myanmar, Philipin, Thái Lan và Việt Nam. Tuy
nhiên so với các trung tâm sản xuất đậu tương của thế giới là Argentina, Brazil và Hoa
Kỳ thì sản lượng đậu tương của nước ta còn khá thấp [107]. Vì thế, để đáp ứng đủ nhu
cầu trong nước nên chúng ta phải nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn từ các quốc
gia bên ngoài đặc biệt là Hoa Kỳ.
Tình trạng hạn hán ảnh hưởng tới tình hình sản xuất đậu tương không chỉ ở
Việt Nam mà ngay cả những nước sản xuất đậu tương hàng đầu thế giới như
Argentina. Thống kê cho thấy, sản lượng đậu tương của Argentina vào vụ mùa năm
2009 giảm từ 34,5 triệu tấn so với cùng thời điểm năm 2008 là 46,2 triệu tấn. Ở Việt
Nam, tình hình thiếu nước trầm trọng tại các địa phương làm cho sản lượng đậu tương
của năm 2009 giảm xuống chỉ còn 213,6 nghìn tấn so với năm 2007 là 275,2 nghìn tấn
và năm 2008 là 267,6 nghìn tấn [106]. Đậu tương là cây trồng thuộc nhóm cây có khả

2

năng chịu hạn kém. Chính vì vậy nghiên cứu tạo giống đậu tương có khả năng sống
trong điều kiện bất lợi về nước đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm của các
nhà chọn giống. Ở Việt Nam, nhiều giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn đã
được chọn tạo thành công và đang được triển khai canh tác ở một số địa phương. Có
thể kể đến các giống DT96, DT2008 do các nhà khoa học tại Viện Di truyền Nông
nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo. Dòng đậu tương ML48,
ML61 do tác giả Chu Hoàng Mậu chọn tạo có khả năng chịu hạn cao [15]. Tuy nhiên
các phương pháp chọn giống truyền thống tốn nhiều thời gian, phức tạp và cần phải có
quần thể đủ lớn và không ổn định. Những nhược điểm của phương pháp truyền thống
có thể được khắc phục bằng việc áp dụng các kỹ thuật mới của công nghệ sinh học. Kỹ
thuật chuyển gen ở thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được
các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng và đạt được những kết quả rất có triển vọng
trên cây đậu tương. Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa tại Viện
nghiên cứu lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã thành công trong việc tạo ra các giống
đậu tương mới mang tính kháng sâu bệnh [9]. Tuy nhiên, cho đến nay công trình

nghiên cứu về chuyển gen chịu hạn vào cây đậu tương vẫn chưa được quan tâm đúng
mức. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ là: “Phân
lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm
chuyển vào cây đậu tương Việt Nam”
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. So sánh trình tự gen mã hóa P5CS của giống địa phương thuộc nhóm chịu hạn tốt
và giống đậu tương DT84. Tạo được đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bởi
prolin.
2.2. Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu
tương.
2.3. Tạo cây đậu tương mang cấu trúc gen liên quan đến đặc tính chịu hạn.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân tích đặc điểm sinh lý, hóa sinh của một số giống đậu tương trồng tại khu vực
miền Bắc.

3

3.2. Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa enzyme pyroline-5 carboxylate synthetase
(P5CS).
3.3. Tạo đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi (feedback inhibition) bởi prolin
bằng phương pháp tạo đột biến điểm.
3.4. Phân lập promoter cảm ứng dưới điều kiện khô hạn rd29A từ cây Arabidopsis
thaliana. Phân tích hoạt động của promoter dựa vào hoạt động của gen GUS ở các
dòng cây thuốc lá chuyển gen.
3.5. Thiết kế cấu trúc mang gen P5CS đột biến được điều khiển bởi promoter rd29A và
chuyển cấu trúc này vào cây thuốc lá.
3.6. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh và khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá
trong điều kiện gây hạn nhân tạo.
3.7. Biến nạp cấu trúc mang gen P5CS vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Phân tích sự có mặt của gen biến nạp.

4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX L. MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ
VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây đậu tương là một trong những loài cây trồng được biết đến từ rất sớm.
Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng đậu tương có nguồn
gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ở
Trung Quốc vào khoảng thế kỉ XVII trước công nguyên. Cây đậu tương được
truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ VIII, du nhập vào nhiều nước Châu
Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau đó.
Cây đậu tương được trồng ở Châu Âu vào thế kỷ XVII và ở Hoa Kỳ thế kỷ XVIII .
Cây đậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm
Papilionoideae, chi Glycine với tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill. Tuy nhiên
theo Hymowit và Newell (1984) thì ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja. Chi
Glycine được chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài
đậu tương trồng Glycine max L. Merrill (Ngô Thế Dân và đtg, 1999) [6], (Trần Văn
Điền, 2007) [8].
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Đậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn
non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt. Màu sắc của thân cây
cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ có màu trắng, nếu thân
có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3 - 1m tùy theo
giống.
Cây đậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép. Mỗi lá kép thường có 3
thuỳ (lá chét), lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lông tơ. Hình dạng của lá thay

đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt, nhưng cho năng suất thấp,
những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng cũng chịu hạn kém hơn.

5

Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa mọc
thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3 - 5 hoa. Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây tự
thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5 - 1%.
Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2 - 7cm. Mỗi quả thường có 2 - 3
hạt. Hạt đậu tương có hình tròn, bầu dục…, những giống có hạt màu vàng có giá trị
thương phẩm cao. Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 - 200g. Hình dạng
và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống.
Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết
quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt sần có thể dài
1cm, đường kính 5 - 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt
nhất nốt sần có màu hồng. Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0 - 20cm, có
vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng đạm cung cấp
cho cây khoảng 30 - 60 kg/ha.
Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia thành các loại: chín rất
sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90 - 100 ngày; chín trung
bình: thu hoạch sau 100 - 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110 - 120
ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130 - 140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140 -
150 ngày (Ngô Thế Dân và đtg, 1999) [6], (Trần Văn Điền, 2007) [8].
1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương
Đậu tương là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm của nó được
dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp,
làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt. Đậu tương được xem là ông
hoàng trong các cây họ đậu vì giá trị rất toàn diện của nó (Trần Văn Điền, 2007) [8].
Giá trị về mặt thực phẩm: Hàm lượng protein trong đậu tương cao hơn trong cá, thịt và
cao gấp 2 lần các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng 35 - 50% (phụ

thuộc vào giống và điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và không có thành phần
tạo cholesteron. Đậu tương còn được xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng,
lipit đậu tương chứa thành phần các axit béo không no cao, tổng số chất béo chiếm
khoảng 18%. Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin, đáng kể là các vitamin

6

nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và
các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa.
Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, đậu tương là cây đứng đầu về cung
cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% dầu thực vật, dầu đậu tương
khô chậm, chỉ số iốt cao 120 - 127, nhiệt độ ngưng tụ -15 đến -18
0
C và từ dầu người ta
có thể làm nến, xà phòng, nilon,…Đậu tương còn là nguyên liệu của nhiều ngành công
nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt
lỏng,…
Giá trị về mặt nông nghiệp: Toàn bộ cây đậu tương cả khi tươi và khô đều có thể dùng
làm thức ăn cho gia súc. Đậu tương có vai trò quan trọng trong cải tạo đất trồng, một ha
đậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ để lại trong đất 30 - 60 kg nitơ, thân và lá
với hàm lượng đạm cao có thể dùng để bón cho đất thay cho phân hữu cơ. Việc luân
canh đậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp cải tạo đất trồng hữu hiệu.
1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
Trên thế giới: Với những giá trị kinh tế và sử dụng của cây đậu tương nên đây được
xem là một trong những loại cây trồng chiến lược ở nhiều quốc gia với vị trí chỉ đứng
sau lúa, ngô và lúa mì. Do có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và
sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập trung
nhiều nhất ở Châu Mỹ, tiếp đến là Châu Á. Theo thống kê của tổ chức Lương thực và
Nông nghiệp Liên hiệp quốc, diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới tăng khoảng
3,6 triệu ha trong vòng 4 năm trở lại đây (năm 2006 là 95,2 triệu ha và năm 2009 là

98,8 triệu ha) [107].
Trong đó, Hoa Kỳ là quốc gia có diện tích gieo trồng cây đậu tương lớn nhất là
30,91 triệu ha tiếp đến là quốc gia Brazil (21,76 triệu ha) và Argentina (16,77 triệu ha)
vào năm 2009 (Bảng 1.1) trong khi đó Việt Nam chỉ có 0,15 triệu ha.
Mặc dù diện tích gieo trồng cây đậu tương tăng lên đáng kể trong các năm trở
lại đây tuy nhiên sản lượng đậu tương của cả thế giới lại có những biến động khác
nhau giữa các năm. Năm 2006 sản xuất đậu tương của cả thế giới đạt 221,9 triệu tấn,
năm 2007 giảm xuống còn 219,5 triệu tấn, tăng lên vào năm 2008 là 230,5 triệu tấn
nhưng năm 2009 chỉ còn 222,2 triệu tấn.

7

Bảng 1.1. Diện tích sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới
Diện tích gieo trồng (triệu ha)*
Quốc gia
Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009
Argentina 15,13 15,98 16,39 16,77
Brazil 22,05 20,57 21,06 21,76
Trung Quốc 9,30 8,75 9,13 8,80
Ấn Độ 8,33 8,88 9,52 9,60
Indonesia 0,58 0,46 0,59 0,72
Thái Lan 0,14 0,13 0,12 0,11
Hoa Kỳ 30,19 25,96 30,22 30,91
Việt Nam 0,19 0,19 0,19 0,15
* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO)
[107].

Năm 2009, Hoa Kỳ là quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới với 91,42 triệu tấn,
tiếp theo là Brazil với 56,96 triệu tấn và Argentina là 30,99 triệu tấn [107] (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Sản lượng đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

Sản lượng (triệu tấn)*
Quốc gia
Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009
Argentina 40,54 47,48 46,24 30,99
Brazil 52,46 57,86 59,24 56,96
Trung Quốc 15,50 12,73 15.55 14,50
Ấn Độ 8,86 10,97 9,91 10,22
Indonesia 0,75 0,59 0,78 0,97
Thái Lan 0,21 0,20 0,19 0,19
Hoa Kỳ 87,00 72,86 80,75 91,42
Việt Nam 0,26 0,28 0,27 0,21
* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO)
[107].
Trong bốn năm trở lại đây năng suất cao nhất đạt được vào năm 2007 là 24,3 tạ/ha
và thấp nhất là năm 2009 là 22,4 tạ/ha. Trong số các quốc gia trồng cây đậu tương hàng
đầu thế giới chỉ duy nhất Hoa Kỳ vẫn duy trì được năng suất cây đậu tương thậm chí có

8

phần tăng vào năm 2009 so với các năm 2006, 2007 và 2008 (Bảng 1.3). Argentina là
nước có năng suất đậu tương giảm mạnh nhất vào năm 2009 chỉ còn 18,48 tạ/ha so với
các năm trước trung bình đạt khoảng 27 tạ/ha (Bảng 1.3).
Bảng 1.3. Năng suất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới
Năng suất (tạ/ha)*
Quốc gia
Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009
Argentina 26,79 29,71 28,22 18,48
Brazil 23,80 28,13 28,13 26,18
Trung Quốc 16,66 14,54 17,03 16,48
Ấn Độ 10,63 12,35 10,40 10,64

Indonesia 12,88 12,91 13,12 13,48
Thái Lan 15,60 15,93 15,99 16,33
Hoa Kỳ 28,82 28,07 26,72 29,58
Việt Nam 13,91 14,70 14,03 14,61
* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO)
[107].
Có thể kể đến nhiều nguyên nhân làm cho năng suất và sản lượng đậu tương
không ổn định trong một vài năm trở lại đây ở trên thế giới và tại các quốc gia trồng
đậu tương là do dịch bệnh, kỹ thuật canh tác nhưng đáng chú ý nhất phải kể đến là do
tình hình biến đổi khí hậu và hạn là một yếu tố có ảnh hưởng không nhỏ đến sản xuất
đậu tương trên thế giới. Hạn hán hay vấn đề không chủ động được nguồn nước làm
giảm tới 40% phần năng suất của cây đậu tương. Theo thống kê của cơ quan nông
nghiệp Hoa Kỳ thì sản lượng đậu tương của Argentina hơn 10 triệu tấn vào năm 2009,
trong đó năng suất khoảng 10 tạ/ha. Nguyên nhân gây ra tình trạng này chính là do
tình trạng hạn hán tại một số nước Châu Mỹ Latinh trong đó có Argentina (Bảng 1.3).
Do sự suy giảm năng suất và sản lượng tại hai quốc gia hàng đầu về sản xuất đậu
tương là Brazil và Argentina nên đã ảnh hưởng đến sản lượng đậu tương của cả thế
giới (Bảng 1.3).
Ở Việt Nam: Đậu tương được gieo trồng từ lâu đời, trước cây đậu xanh và đậu đen.
Tuy nhiên, với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống có năng suất thấp,
sản xuất nhỏ lẻ, giá thành đậu tương trong nước không có khả năng cạnh tranh với đậu
tương nhập khẩu là lý do khiến cho nông dân không mặn mà với cây đậu tương. Diện
tích trồng đậu tương tăng qua các năm nhưng vẫn chỉ chiếm một tỉ lệ nhỏ (1,5 - 1,6%
tổng diện tích cây nông nghiệp).

9

Bảng 1.4. Sản lượng sản xuất đậu tương tại các tỉnh và thành phố
Sản lượng các địa phương (nghìn tấn)*
Các địa phương

2006 2007 2008 2009
Hà Nội 2,1 2,1 43,9 11,8
Hà Tây 47,7 51,7
Vĩnh Phúc 10,2 6,4 10,5 4,2
Bắc Ninh 2,9 3,2 4,0 4,1
Quảng Ninh 1,1 1,1 1,1 1,3
Hải Dương 2,9 2,5 2,3 2,7
Hưng Yên 8,4 7,9 6,9 5,8
Thái Bình 12,4 13,8 14,0 16,8
Hà Nam 11,1 12,0 13,0 2,1
Nam Định 5,3 5,6 5,4 4,0
Hà Giang 14,1 14,1 20,4 23,7
Cao Bằng 4,4 5,2 5,1 4,1
Bắc Kạn 2,9 2,8 3,6 4,0
Tuyên Quang 3,2 4,1 4,5 3,9
Lào Cai 4,7 5,4 4,9 5,3
Thái Nguyên 3,6 3,1 2,8 2,5
Lạng Sơn 2,0 3,0 2,7 2,2
Bắc Giang 4,5 3,4 3,1 3,0
Điện Biên 10,7 11,2 13,0 11,7
Lai Châu 1,7 1,8 2,1 2,4
Sơn La 11,1 11,5 10,0 9,8
Hoà Bình 3,4 4,3 3,6 1,9
Thanh Hóa 6,6 7,6 6,3 7,4
Đắk Lắk 10,4 11,3 11,2 10,4
Đắk Nông 26,7 30,3 30,5 33,2
Đồng Nai 3,2 3,2 2,1 1,5
Đồng Tháp 14,0 16,6 13,7 10,7
An Giang 2,8 3,1 2,0 1,6
* Theo số liệu của Tổng Cục Thống kê [107].

Mặc dù chưa có những số liệu thống kê cụ thể thiệt hại do hạn hán gây ra đối
với sản xuất đậu tương ở Việt Nam. Tuy nhiên, khi nhìn vào số liệu thống kê sản

10

lượng đậu tương tại các tỉnh và thành phố của Việt Nam có thể thấy rằng tại nhiều khu
vực sản lượng sản xuất đậu tương giảm đáng kể so với những năm trước đây, thêm vào
đó kết hợp với những thông tin về tình hình thời tiết bất thường trong vòng 3 năm trở
lại đây có thể thấy rằng bên cạnh những yếu tố bất lợi sinh học và phi sinh học khác
thì hạn hán cũng đã ảnh hưởng không nhỏ tới sản lượng đậu tương ở một số tỉnh thành
nói riêng và do đó ảnh hưởng đến sản lượng sản xuất đậu tương của cả nước nói
chung.
Kết hợp với những số liệu thống kê cụ thể về sản lượng đậu tương ở các quốc
gia trên thế giới và đánh giá tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam trong vòng 4
năm trở lại đây có thể khẳng định rằng, vấn đề nâng cao khả năng kháng hạn trở nên
cấp thiết đối với cây đậu tương. Thêm vào đó những nghiên cứu này hoàn toàn mới
đối với tình hình nghiên cứu cây đậu tương tại Việt Nam và phù hợp với xu thế chung
trên thế giới.
1.2. CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU
TƯƠNG
Khi gặp các điều kiện bất lợi về nước, thực vật có những phản ứng để có thể
thích ứng, sinh trưởng và phát triển. Các cơ chế này khá đa dạng nhưng có thể chia
thành ba cơ chế chủ đạo bao gồm: cơ chế trốn thoát điều kiện hạn (drought escape),
cơ chế tránh hạn (drought avoiandgce) và cơ chế chống chịu hạn (drought tolerance).
Cơ chế trốn thoát điều kiện hạn cho phép cây có thể hoàn thành chu kì sống của mình
trong giai đoạn được cung cấp đủ nước trước khi hạn xảy ra. Các giống đậu tương
ngắn ngày được trồng khá phổ biến ở khu vực Nam Mỹ chủ yếu sử dụng cơ chế này
để thích ứng với các điều kiện bất lợi về nước. Các giống này có tính chín sớm và bắt
đầu nở hoa vào cuối tháng 4 và tạo quả trong tháng 5, chính vì thế mà các giống này
có thể hoàn thành chu kì sinh sản của mình trước khi tình trạng khan hiếm về nước

xảy ra từ tháng 6 tới tháng 8. Đối với cơ chế tránh hạn thì các giống đậu tương sẽ có
các cơ chế để duy trì lượng nước trong cơ thể trong giai đoạn hạn thông qua việc
tăng khả năng hấp thu nước từ rễ hoặc giảm quá trình thoát hơi nước ở các bộ phận
khác nhau của cây. Ở các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, thì cây có
thể duy trì sức căng của các mô và tế bào, chính vì thế các quá trình trao đổi chất có

11

thể diễn ra bình thường trong điều kiện lượng nước bên ngoài môi trường xuống rất
thấp. Sức căng của các mô và tế bào của cây được duy trì thông qua việc tổng hợp
mạnh các chất chống áp suất thẩm thấu, các chất trao đổi (Nguyen và đtg, 2007) [68].
1.2.1. Khả năng thích nghi của bộ rễ trong điều kiện hạn
1.2.1.1.Sự phát triển của bộ rễ
Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy
nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Ở cây đậu
tương sự thích nghi với các điều kiện hạn hán chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ
để có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp đất sâu (Taylor và đtg, 1978) [93]. Bên
cạnh đó hệ thống rễ sợi phát triển cũng giúp cho cây có thể vươn tới các lớp đất có độ
ẩm cao và tìm kiếm các chất dinh dưỡng. Một trong những nhân tố chính ảnh hưởng
đến độ sâu của rễ đậu tương là tỉ số kéo dài rễ trụ (taproot elongation rate). Do rễ trụ
được hình thành đầu tiên ở đậu tương, chính vì thế việc xác định các giống đậu tương
có đặc tính kéo dài rễ trụ nhanh sẽ cho phép xác định khả năng đâm sâu của rễ. Sự
khác nhau về tính trạng kéo dài bộ rễ ở các giống đậu tương đã được nghiên cứu khá
chi tiết ở trong điều kiện nhà lưới (Kaspar và đtg, 1984) [54]. đã đánh giá 105 giống
đậu tương khác nhau cho thấy tỉ số kéo dài rễ trụ khác nhau giữa các giống vào khoảng
1,3cm/ngày. Những nghiên cứu tiếp theo trên các giống có tỉ số kéo dài rễ trụ cao cho
thấy những giống này có thể lấy nước ở chiều sâu trên 120cm so với các giống còn lại.
Một vài nghiên cứu cũng đã được thực hiện đối với hệ thống rễ nhánh của cây đậu
tương cho thấy trong điều kiện hạn số lượng rễ nhánh trên đơn vị chiều dài rễ trụ tăng
đáng kể, nhưng chiều dài và đường kính rễ trụ không thay đổi. Hạn chế về nước ở cây

đậu tương thường làm tăng sinh khối của rễ, từ đó làm tăng tỉ lễ rễ : thân. Ở cây đậu
tương không được tưới nước thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn ở cây đậu tương được tưới
nước (Huck và đtg, 1983) [47]. Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương
quan rất chặt chẽ đối với nhiều tính trạng rễ như khối lượng khô, chiều dài tổng số, cấu
trúc và số lượng rễ nhánh ở các giống chịu hạn. Những tính trạng này thường được
dùng như các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tương có
tính chịu hạn. Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương được chia thành
hai giai đoạn là sinh trưởng sinh dưỡng (V) và sinh trưởng sinh sản (R). Giai đoạn V

12

được chia thành VE đến VN, trong giai đoạn VN đỉnh sinh trưởng xuất hiện và các
giai đoạn VN được đánh số phụ thuộc số lượng lá bánh tẻ xuất hiện. Giai đoạn R được
chia thành các giai đoạn từ R1 đến R8. Trong hai giai đoạn đầu R1 và R2 hình thành
hoa, giai đoạn R3 và R4 là sự hình thành quả đậu tương, các giai đoạn chín và làm
chắc hạt là từ R5 tới R8. Ở cây đậu tương, khi hạn hán xảy ra ở các giai đoạn sớm hay
muộn của giai đoạn sinh trưởng sinh sản làm tăng mạnh sự phát triển bộ rễ, đặc biệt là
hệ thống rễ ở các lớp đất sâu. Khả năng phát triển bộ rễ không quá bị ảnh hưởng khi
hạn hán xảy ra ở giai đoạn R4 và R5 (Hoogenboom và đtg, 1987) [43]. Trong một
nghiên cứu khác cho thấy cây đậu tương khi bị xử lý hạn ở giai đoạn trước khi ra hoa
sẽ cho năng suất hạn cao những cây đậu tương bị xử lý hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa,
điều này được giải thích là do chúng đã phát triển bộ rễ đầy đủ để thích ứng với điều
kiện hạn trước khi nở hoa (Hirasawa và đtg, 1994) [39]. Các kết quả này cho thấy nếu
khi cây đậu tương phát triển bộ rễ lớn ở những giai đoạn sớm của quá trình sinh trưởng
sinh dưỡng sẽ giúp cho cây có thể thích ứng tốt trong các điều kiện hạn.
Các kết quả từ các nghiên cứu được trình bày trên đây cho thấy những tính
trạng bộ rễ có thể sử dụng để cải thiện tính chịu hạn ở cây đậu tương bằng các phương
pháp nhân giống thông thường. Tuy nhiên, các phương pháp đo đạc các tính trạng liên
quan đến bộ rễ thường rất khó thực hiện. Thay vào đó các phương pháp phân tử sẽ là
công cụ hỗ trợ cho các phương pháp truyền thống để nghiên cứu các tính trạng về rễ.

Quá trình chọn lọc các gen liên quan đến các tính trạng về rễ bao gồm các nghiên cứu
sàng lọc gen từ các cơ sở dữ liệu, thiết kế mồi để nhân bản gen, xác định sự đa dạng,
phát triển phương pháp phân tích hệ gen, xác định quần thể nghiên cứu. Phương pháp
này đã thành công trong việc xác định nhiều gen quý quy định các tính trạng rễ ở lúa
trong điều kiện hạn (Valliyodan và đtg, 2006) [98]. Thêm vào đó, việc hiểu biết các cơ
chế sinh lý và quá trình điều hòa di truyền của sự thích nghi của bộ rễ dưới điều kiện
hạn sẽ giúp ích cho việc xác định các gen đặc hiệu, các quá trình chuyển hóa để sử
dụng cho việc nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp sử
dụng chỉ thị gen hoặc kỹ thuật chuyển gen.

13

1.2.1.2. Khả năng cố định nitơ của cây đậu tương trong điều kiện hạn
Khả năng cố định nitơ ở các loài cây họ đậu thường rất nhạy cảm đối với tình
trạng nước ở trong đất. Trong điều kiện hạn, cây đậu tương không chỉ giảm khả năng
cố định CO
2
, giảm sự phát triển lá mà khả năng cố định nitơ cũng bị ảnh hưởng
nghiêm trọng. Kết quả này làm giảm sinh tổng hợp protein (Purcell và King, 1996)
[75]. Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố định nitơ trong điều kiện hạn đã được xác
định ở cây đậu tương bao gồm khả năng sử dụng O
2
giảm, nguồn carbon tới các nốt
sần giảm, hoạt tính của enzym sucrose synthase giảm, hàm lượng ure và axit amin tự
do tăng (King và Purcell, 2005) [56]. Đặc biệt, mối quan hệ về thế năng nước của lá và
nốt sần đã được xác định ở cây đậu tương trong điều kiện hạn. Hoạt tính của enzym
nitrogenase giảm 70% trong 4 ngày đầu tiên khi cây gặp hạn, trong khi đó quá trình
quang hợp giảm khoảng 5%. Ngoài ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực tiếp
đến hoạt tính của nốt sần thông qua sự tăng cường tính kháng đối với khả năng
khuyếch tán oxy. Tình trạng thiếu nước ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá

của cây đậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt
sần.
Sự thay đổi về di truyền cũng được xác định ở các cá thể nhạy cảm với khả
năng cố định nitơ trong điều kiện hạn. Khi so sánh các giống đậu tương có hoặc không
có khả năng duy trì tính căng mô (tissue turgidity) dưới điều kiện hạn ở giai đoạn sinh
trưởng sinh sản cho thấy, giống có khả năng duy trì tính căng mô tốt hơn có năng suất
hạt tốt hơn với những giống còn lại (Hàm lượng ure ở cuống lá cũng là một trong
những chỉ tiêu để sàng lọc các dòng cây đậu tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn
trong điều kiện khô hạn. Bằng việc sàng lọc số lượng lớn (>3000) dòng đậu tương dựa
vào chỉ tiêu này, 8 dòng đậu tương có khả năng cố định nitơ tốt mang tính chịu hạn tốt
hơn. Nghiên cứu sâu hơn các dòng đậu tương này, Sinclair và đtg (2007) [86] tìm ra
rằng quá trình dị hóa ure không phụ thuộc vào Mn tồn tại ở 6 trong số 8 dòng nghiên
cứu. Giống đậu tương Jackson, giống kháng hạn và có khả năng cố định nitơ cao, đã
được dùng làm thể bố mẹ trong các cặp lai để tạo ra giống đậu tương có năng suất cao
ở các điều kiện hạn. Hai dòng con lai từ các cặp lai này là nguồn gen tốt được dùng để
cải thiện khả năng cố định nitơ và năng suất trong các điều kiện ngập úng (Sinclair và

14

đtg, 2007) [86]. Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa thể giải thích được liệu khả
năng cố định nitơ trong điều kiện hạn có được điều hòa ở mức độ cơ thể của cây đậu
tương hay không hay quá trình này chỉ tồn tại khu trú trong nốt sần. Chúng ta đã biết
rằng, tín hiệu điều hòa quá trình cố định nitơ là do cơ chế phản hồi bởi nitơ (nitrogen
feedback mechanism) bao gồm cả trạng thái nitơ ở thân và lá. King và Purcell (2005)
[56] đề xuất giả thiết là sự kết hợp ure và axit aspartic ở nốt sần và quá trình vận
chuyển một số các axit amin từ lá có thể tham gia vào cơ chế ức chế phản hồi ở cây
đậu tương. Gần đây một nghiên cứu trên hệ thống rễ phân tách ở điều kiện hạn cho
thấy hoạt tính cố định nitơ được điều khiển ở mức độ khu trú (local) hơn là ở mức độ
tín hiệu nitơ hệ thống (Marino và đtg, 2007) [64]. Nhiều nghiên cứu cũng đang được
thực hiện theo hướng này để hiểu hơn bản chất phân tử các nhân tố hạn chế và điều

hòa quá trình cố định nitơ trong điều kiện hạn ở cây đậu tương.
1.2.2. Các tính trạng liên quan đến sự thích ứng của lá cây đậu tương trong điều
kiện hạn
1.2.2.1. Cường độ thoát hơi nước của khí khổng
Cường độ thoái hơi nước của khí khổng là một trong những tính trạng sinh lý
của lá có liên quan chặt chẽ đến khả năng sử dụng nước của cơ thể thực vật khi cây
gặp điều kiện khô hạn. Khi cây gặp bất lợi về nước, cơ thể thực vật sẽ thực hiện quá
trình chuyển đổi từ pha trung hòa nước, mà trong đó việc sử dụng nước ở trong cơ thể
không tùy thuộc vào lượng nước ở bên ngoài, sang pha thứ cấp khi mà việc sử dụng
nước sẽ liên quan trực tiếp đến lượng nước ở bên ngoài (Sinclair và đtg, 1986) [85].
Quá trình chuyển hóa này liên quan đến việc giảm cường độ thoát hơi nước qua khí
khổng ở lá và có thể xảy ra ở nhiều loài cây khác nhau trong các điều kiện khác nhau.
Cường độ thoát hơi nước là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự trao đổi khí và
hơi nước ở lá. Ảnh hưởng của hạn hán đến sự sinh trưởng của lá, cường độ thoát hơi
nước và lượng nước ở trong cây được nghiên cứu khá chi tiết ở đậu tương. Chúng ta
biết rằng, hạn hán làm giảm tốc độ mở rộng của lá, cường độ thoát hơi nước của khí
khổng và sức căng của lá. Trong đó, nó làm tăng hàm lượng axit abscisic (ABA) ở lá
và xylem. Nghiên cứu này cho thấy việc giảm cường độ thoát hơi nước của khí khổng
xảy ra đồng thời với việc tăng hàm lượng ABA ở trong xylem và xảy ra trước khi có

15

những thay đổi về sức căng của lá. Điều này chỉ ra rằng các tín hiệu hóa học ABA bắt
nguồn từ rễ điều khiển hoạt động của khí khổng khi tính trạng thiếu nước tương đối ở
trong đất xảy ra (Liu và đtg, 2003) [61]. Sự khác nhau về mặt di truyền về khả năng
duy trì khí khổng mở dưới điều kiện bất lợi về nước đã được nghiên cứu ở đậu tương.
Khi so sánh các loài cây họ đậu khác với cây đậu tương cho thấy, cây đậu xanh, đậu
đen và đậu đũa có khả năng điều khiển sự đóng mở khí khổng tốt hơn khi cây bị mất
nước. Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh rất rõ ràng rằng cường độ thoát hơi
nước của khí khổng giảm tỉ lệ thuận với sự mất nước ở cây đậu tương (Liu và đtg,

2005) [62]. Khả năng điều khiển cường độ thoát hơi nước của khí khổng dưới điều
kiện hạn là một đặc tính sinh lý tốt để phát hiện các giống đậu tương chịu hạn do các
phương pháp đo đạc chính xác đã được phát triển. Tuy nhiên, khả năng di truyền tính
trạng này cũng là một yếu tố rất quan trọng cần được quan tâm.
1.2.2.2. Cường độ thoát hơi nước của biểu bì
Đặc tính sinh lý thứ hai của lá cũng có thể được sử dụng để đánh giá và xác
định khả năng chịu hạn và khả năng sinh trưởng của cây trồng trong điều kiện hạn đó
là cường độ thoát hơi nước của biểu bì của lá (Epidermal conductance). Cường độ
thoát hơi nước tổng số của lá được tính bằng tổng của cường độ thoát hơi nước của khí
khổng và của mặt biểu bì. Khi khí khổng mở, quá trình thoát hơi nước của biểu bì
thường không được tính đến khi tính toán cường độ thoát hơi nước tổng số của lá. Tuy
nhiên, khi lá bị thiếu nước hay bị bóng tối, trong các điều kiện này thì khí khổng
thường đóng, thì hệ thống thoát hơi nước ở bề mặt biểu bì có thể vượt qua cả cường độ
thoát hơi nước của khí khổng. Trong những điều kiện thiếu nước nghiêm trọng khi khí
khổng đóng hoàn toàn, cường độ thoát hơi nước của biểu bì được dùng để xác định
lượng nước mất mát của mô lá. Nhiều loại thực vật sống trong môi trường khô có
cường độ thoát hơi nước của biểu bì rất thấp (Riederer và đtg, 2001) [77], và những
loài cây trồng có cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp thường duy trì khả năng
sống tốt và dài hơn trong những điều kiện khô hạn (Jovanovi và đtg, 1996) [52].
Nghiên cứu trên 74 giống đậu tương thu thập từ các vùng sinh thái khác nhau cho thấy
sự khác nhau đáng kể về cường độ thoát hơi nước của biểu bì ở các giống này và có
quan hệ chặt chẽ với môi trường mà các giống nghiên cứu sinh sống. Điều đang quan

16

tâm đó là sự khác nhau này không liên quan đến sự khác nhau về mật độ khí khổng ở
lá. Những giống có cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp có thể cải thiện khả năng
phát triển và sinh trưởng của lá ở những điều kiện bất lợi về nước, vì thế diện tích lá
được duy trì đảm bảo sự sinh trưởng của cây sau khi bị hạn. Nghiên cứu gần đây cho
thấy mối tương quan nghịch (r = -0,74) giữa cường độ thoát hơi nước của biểu bì và

hiệu quả sử dụng nước trong điều kiện hạn, kết quả này dẫn đến một giả thiết cho rằng
cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp sẽ là một chỉ tiêu đáng tin cậy về tính chịu
hạn (Hufstetler và đtg, 2007) [48]. Giống đậu tương dại có cường độ thoát hơi nước
của biểu bì thấp hơn hẳn so với các giống đậu tương canh tác. Trong số các giống đậu
tương được gieo trồng ngày nay, các giống ở khu vực nhiệt đới có cường độ thoát hơi
nước của biểu bì thấp nhất và thế năng thẩm thấu nhỏ hơn so với các giống ở khu vực
khí hậu ôn hòa, điều này có thể là do quá trình chọn lọc tự nhiên dưới các điều kiện
môi trường (James và đtg, 2008a) [49]. Nghiên cứu trên các quần thể lai cho thấy
cường độ thoát hơi nước của biểu bì khác nhau một cách có ý nghĩa dao động từ 60 -
93% (James và đtg, 2008b) [50]. Như vậy tính trạng này có tính di truyền khá cao. Tuy
nhiên, để khẳng định tính hữu dụng của các tính trạng này trong việc tạo ra các giống
đậu tương có tính kháng hạn cần nhiều nghiên cứu sâu hơn để xác định mối quan hệ
giữa cường độ thoát hơi nước của biểu bì, khả năng duy trì sức căng của lá và sức sống
của cây.
1.2.2.3. Mật độ lông tơ của lá
Hệ thống lông tơ của lá là một đặc điểm chung của các loài thực vật chịu hạn,
cũng như một số loài cây trồng trong đó có đậu tương. Trong điều kiện hạn thì đây là
một trong những tính trạng thích nghi quan trọng của cây đậu tương. Các dòng có mật
độ lông tơ cao có sức sinh trưởng sinh dưỡng tốt hơn, mật độ rễ nhiều hơn và rễ đâm
sâu hơn. Mật độ lông tơ của lá tăng lên làm tăng tính kháng ở các lớp bề mặt của lá lên
tới 50%. Nhiệt độ của lá giảm, sự mất nước bị giới hạn và quá trình quang hợp tăng
lên do sự thâm nhập của phóng xạ thấp hơn cũng có liên quan đến mật độ lông tơ của
lá (Specht và đtg, 1985) [87]. Hơn nữa, nếu hệ lông tơ càng dày đặc thì có thể làm
giảm hiện tượng nhiễm bệnh gây ra bởi virus khảm đậu tương. Tuy nhiên, mật độ lông
tơ được điều khiển bởi hai allen là Pd1 và Pd2, tăng lên sẽ tạo ra những hiệu ứng có lợi