KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AXIT PHYTIC Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG VÀ MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA VÀ MICROSATELLITE (Nội dung chính)

1
CHƢƠNG 1
LỜI MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lƣơng thực chính nuôi
sống hơn 50% dân số thế giới. Trƣớc đây, với điều kiện vật chất còn thiếu thốn,
lƣơng thực không đủ ăn ngƣời ta chỉ có nhu cầu đƣợc ăn no. Nhƣng ngày nay mức
sống ngƣời dân ngày càng đƣợc nâng cao thì nhu cầu ăn no đã đƣợc thay đổi, việc
ăn ngon, có dinh dƣỡng cao đã dần trở nên là nhu cầu quan trọng đối với mọi
ngƣời. Trong đó, sự cân bằng dinh dƣỡng trong khẩu phần ăn là vấn đề lớn của
dân số thế giới. Ở các nƣớc đang phát triển sự thiếu dinh dƣỡng khoáng chƣa đƣợc
quan tâm nhƣ: Sắt (Fe), kẽm (Zn)..Các chất này đóng vai trò quan trọng trong cơ
thể con ngƣời, sắt là kim loại tham gia vào thành phần hóa học của hồng cầu.
Thiếu sắt sẽ dẫn đến tình trạng thiếu máu và ảnh hƣởng phần lớn đến trẻ em và
phụ nữ trong giai đoạn mang thai. Trong khi đó, kẽm cũng rất cần thiết cho cơ thể,
thiếu kẽm làm cho cơ thể suy yếu, bệnh tật, gây tử vong và gây ảnh hƣởng đến sự
sinh trƣởng và phát triển của cơ thể. Ở trẻ em, phụ nữ mang thai và phụ nữ đang
trong giai đoạn cho con bú sữa thì có nguy cơ thiếu kẽm cao vì lúc này cơ thể có
nhu cầu kẽm cao hơn cho sự phát triển, sinh sản và đề kháng với những bệnh
nhiễm trùng. Brown và Wuehler (2000) đã ƣớc tính là khoảng 95,4% (+/- 2,1) dân
số ở Nam Á và khoảng 71,2% (+/- 14,2) dân số ở Đông Nam Á đang đứng trƣớc
nguy cơ thiếu kẽm. Trong khi đó tỷ lệ này ở Mỹ và Canada chỉ chiếm khoảng 0,9
% (+/- 0,2 ).
Hạt ngũ cốc và cây họ đậu là nguồn thực phẩm tiêu thụ chính của dân số thế
giới. Nguồn thực phẩm này rất giàu axit phytic (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-
hexakisphotphate), là thành phần dự trữ photpho trong hạt. Axit phytic, phytate và
photpho đã đƣợc tìm thấy một lƣợng đáng kể trong các loại quả và hạt của cây
trồng (John N.A. Lott và ctv, 2000). Axit phytic tồn tại trong hạt thƣờng ở dạng

2
phức hợp muối phytate hay phytin của kali , magie, canxi nên có thể chứa các ion
kim loại khác nhƣ canxi (Ca), sắt (Fe) và kẽm (Zn). Ở pH sinh lý, axit phytic ở
dạng đa ion tích điện âm gây ảnh hƣởng đến các ion mang điện tích dƣơng. Khi
thức ăn đƣợc hấp thu chúng sẽ kết hợp với các kim loại khoáng quan trọng, cạnh
tranh với sự hấp thu trong thành ruột non tạo nên sự thiếu sắt và kẽm trong cơ thể
con ngƣời.
Vì vậy nghiên cứu ảnh hƣởng của axit phytic đang đƣợc đánh giá toàn diện,
nhằm giải quyết các vấn đề liên quan đến sức khỏe con ngƣời, dinh dƣỡng động
vật, quản lý dinh dƣỡng sản phẩm nông nghiệp.

1.2.Mục tiêu đề tài
Nghiên cứu và đánh giá hàm lƣợng axit phytic ở một số giống lúa địa phƣơng
và giống lúa đột biến để tìm ra các dòng có hàm lƣợng axit phytic thấp phục vụ
cho công tác chọn giống lúa giàu dinh dƣỡng.

1.3. yêu cầu
Pha đƣợc các dung dịch hóa chất cho phản ứng sinh hóa
Thành thạo ly trích DNA cây lúa
Nắm vững kỹ thuật PCR
Các thao tác nấu gel và đƣa mẫu DNA vào các giếng
Nhuộm gel và đọc bản điện di

3
CHƢƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Axit phytic.
Axit phytic là este photphate của inositol, có công thức phân tử là myo-
inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphat ( IP
6
) là thành phần chính của phopho ( P )
trong thực vật, đƣợc tích lũy trong hạt và túi phấn.


Hình 2.1.Cấu trúc của inositol . D là ký hiệu vị trí của cacbon
Inositol hay còn gọi là hexahydroxyclohexan, có 9 dạng đồng phân lập thể
giống với cấu trúc của glucose. Inositol là thành phần của nhiều photphoglycerid
tế bào. Vì inositol có mặt trong mô cơ nên còn đƣợc gọi là Meso- hay my-
oinositol, là một đồng phân quan trọng. Myo-inositol là tiền chất trong chu trình
photphatidylinositol. Inositol và dạng photphat của nó ổn định với những enzym
phân hủy ở trong cơ thể.



4

Hình 2.2 Cấu tạo lập thể của axit Phytic
Axit phytic tạo phức với những ion kim loại nhƣ : Canxi (Ca), Kẽm (Zn),
Sắt (Fe), Magie (Mg) hay tạo phức với protein thành hợp chất gọi là Phytin hay

phytate

Hình 2.3.Công thức cấu tạo của muối Phytate

2.2. Đặc điểm của axit Phytic và vai trò của nó.
Axit Phytic là một chất kiềm mạnh, đặc biệt là với những cation đa hoá trị
hơn là cation đơn hóa trị (Graf, 1986). Muối này gọi là phytate (hay phytin), thông
thƣờng chiếm khoảng 1 đến vài phần trăm trọng lƣợng khô của nhiều hạt và trong
P
P


P
P


P
P


P
P


P
P


P
P

1
2
3
4
5
6


5
vài trƣờng hợp nó chiếm khoảng 50-80% lƣợng photpho tổng của hạt (Lott,1984).
Không có hạt trƣởng thành nào mà không có phytate mặc dù nó có thể không có ở
một số mô hạt nhất định nào đó nhƣ nội nhũ chứa tinh bột của những hạt ngũ cốc.
Phytate cũng có ở hạt phấn (Jackson và ctv.,1982; Helsper và ctv., 1984), bào tử
túi (DeMaggio và Stetler, 1985) và mô sinh dƣỡng nhƣ rễ, cuống và lá (Roberts và
Loewus, 1968; Brearly và Hanke, 1996 ).
Bảng 2.1. Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng
Ở lúa và lúa mì Ngô Đậu castor Đậu hà lan
Mầm: 10%
Aleurone: 90%
Nội nhũ: rất ít
Mầm: 90%
Aleurone: 10%
Nội nhũ: rất ít
Phôi: 3%
Nội nhũ: 97%
Lá mầm: 89%
Mầm: 2,5%
Vỏ hạt: 0,1%

Sự tổng hợp và vai trò sinh lý của phytate trong hạt gần đây đƣợc xem lại
bởi Greenwood (1989), Lásztity (1990), Loewus (1990), Raboy (1990 ), Lott và
ctv. (1995 ) và Raboy và Gerbasis ( 1996 ). Axit phytic đƣợc tổng hợp duy nhất ở
trong tế bào nơi nó đƣợc dự trữ , có thể liên quan đến lƣới nội chất, và sự di
chuyển những túi nhỏ đến những thể protein đang hình thành để dự trữ
(Greenwood và Bewley, 1984 ).
Và một khi ở thể protein đang phát triển, những túi nhỏ này bằng cách nào
đó kết tụ thành dạng lớn hơn và dạng quả cầu bề mặt giàu electron gọi là globoid.
Nơi đó xuất hiện sự tƣơng quan tốt giữa kích thƣớc và tần xuất của những quả cầu
và tỷ lệ ( Mg + Ca )/K của mô hạt trƣởng thành trên cơ sở trọng lƣợng khô (Lott
và ctv.,1985,1994; Lott và Ockenden, 1986). Tỷ lệ ( Mg + Ca )/ K càng cao thì tần
xuất xuất hiện của những quả cầu cũng càng cao. Ở những hạt có nồng độ K cao,
Phytate bị phân tán trong hỗn hợp của những protein (Prattley và Stanley, 1983).
Ngƣời ta cho rằng những yếu tố giống nhƣ Ca và Mg có thể tạo thành những
cation đa trị, có thể gắn với những nhóm photphate mang điện tích âm của những
axit phytic gần đó. Những cầu nối đó là yếu tố chính tạo nên những globoid.
Globoid không phải là những cấu trúc dự trữ tĩnh mà hoạt động nhƣ những
hạt trao đổi ion có thể thay đổi thành phần trong quá trình tạo hạt và nảy mầm của


6
hạt. Nói chung, khi mà hạt hình thành thì lƣợng K gia tăng ở globoid trong khi
lƣợng Ca thì giảm (Ogawa và ctv.,1979). Trong suốt quá trình nảy mầm của hạt
thì lƣợng K ở những globoid giảm nhanh chóng và những nguyên tố cation hai trị
và ba trị có xu hƣớng tăng một cách hữu hiệu ( Lott và ctv.,1995;Beecroft và Lott,
1996; Pitterman và ctv.,1996; Wada và Lott, 1997). Ngƣời ta cũng phát hiện ra
rằng trong suốt quá trình nảy mầm, ở một số tế bào lá mầm xác định, globoid phát
triển gấp bốn lần ở hạt khô (Pitt và Lott, 1996).

2.2.1. Axit phytic đối với cây trồng.

Axit phytic là nguồn dự trữ Photpho chính trong cơ thể thực vật. Axit
phytic có thể kết hợp với các cation tạo thành dạng muối, gọi là phytate hay
phytin. Phytate có một số vai trò nhất định trong hạt và cây mầm, trong đó 2 vai
trò sau đây có ý nghĩa nhất.Vai trò rõ nhất của phytate là nguồn dự trữ inositol,
photphate, K, Mg, Ca, Mn, Fe và Zn cho mầm cây (Batten và Lott, 1986 ; Lott và
Buttrose, 1978a, 1978b ;Chen và Lott, 1992; Wada và Lott, 1997). Những hợp
chất dự trữ này đƣợc giải phóng cho cây mầm đang phát triển bởi hoạt động của
những phytase (Chen và Pan, 1977). Vai trò thứ hai là nó điều khiển lƣợng
photphate vô cơ cả ở hạt đang phát triển và cây mầm ( Strother, 1980 ). Hiện nay
các nhà khoa học trong nông nghiệp đang chọn tạo giống cây trồng có hàm lƣợng
axit phytic thấp, đặc biệt là ở những cây tạo ra hạt dùng làm lƣơng thực thực
phẩm. Tuy nhiên vấn đề đƣợc đặt ra là liệu phát triển những cá thể cây trồng có
hàm lƣợng axit phytic thấp có ảnh hƣởng đến những tính trạng nông học của cây
không nhƣ: năng suất cây trồng, khả năng sinh trƣởng và phát triển của cây
trồng…, đặc biệt là ở những vùng mà đất đai có hàm lƣợng photpho thấp
(Graham và welch ,1996). Tuy nhiên những nghiên cứu cho thấy những cây trồng
có tính trạng axit phytic thấp thì lƣợng photpho tổng của chúng vẫn ở mức bình
thƣờng, không ảnh hƣởng đến khả năng hấp thụ P từ đất và năng suất cây trồng
(Raboy, 1996). Ngoài ra những dạng đột biến axit phytic thấp này còn có khả năng
ngăn không cho hạt tổng hợp P thành axit phytic.


7
2.2.2. Axit phytic với con ngƣời, vật nuôi và môi trƣờng
2.2.2.1. Ảnh hƣởng của axit phytic đối với con ngƣời
Axit phytic có trong những thực phẩm đƣợc làm từ những nguyên liệu
nhƣ ngũ cốc, gạo, cây họ đậu làm ngăn cản sự hấp thu ion kim loại nhƣ sắt (Fe
3+
),
Magie (Mg

2+
), Canxi (Ca
2+
), kẽm (Zn
2+
). Sự kém hấp thu những ion kim loại này
đã tạo ra sự thiếu hụt những vi khoáng lƣợng cần thiết. Ở trẻ em sự dinh dƣỡng
khoáng đặc biệt quan trọng trong giai đoạn cai sữa. Giai đoạn này cơ thể đang phát
triển nhanh chóng và nhu cầu cần ion rất cao. Lúc này ngƣời ta thƣờng cho trẻ ăn
những loại cháo bột. Do đó sự hấp thu ion của trẻ đƣợc lấy từ cháo bột là chủ yếu
vì hàm lƣợng ion có trong sữa mẹ thì thấp.Vì vậy khi thức ăn cháo bột này có hàm
lƣợng axit phytic cao sẽ dẫn đến sự thiếu ion khoáng cho trẻ.
Phytate còn có khả năng ảnh hƣởng đến sự tiêu hóa tinh bột, protein liên
kết với tinh bột, Ca (hoạt hóa enzym amylase). Phytate còn tạo phức với những
protein và ức chế enzym trypsinogen.

2.2.2.2. Ảnh hƣởng của axit phytic đối với vật nuôi và môi trƣờng
Tháng 12 năm 2002 cơ quan bảo vệ môi trƣờng Mỹ đƣa ra những quy
định mới trong việc quản lý nguồn chất thải trong chăn nuôi. Trong vòng 30 năm
qua các nhà chăn nuôi đã thay đổi từ hình thức trang trại nhỏ, thiếu tập trung đến
trang trại lớn hơn và tập trung hơn. Và vì thế một lƣợng lớn chất thải trong chăn
nuôi cũng đƣợc thải ra ngoài môi trƣờng. Vấn đề đặt ra là làm sao gia tăng việc
hấp thu dinh dƣỡng tối đa ở thú để giảm lƣợng dinh dƣỡng thải ra ngoài môi
trƣờng và tạo cân bằng dinh dƣỡng ở nông trại.
Khoảng 85% Photpho (P) có trong thực phẩm có nguồn gốc từ ngũ cốc
dùng làm thức ăn cho heo thì không đƣợc sử dụng bởi vì Photpho liên kết ở dạng
Phytate photphat (Veum và ctv., 2001). Heo thiếu enzym tiêu hóa phytase giữ vai
trò trong việc giải phóng photpho liên kết từ vòng phytate inositol. Vì vậy một
lƣợng lớn P vô cơ thƣờng đƣợc sử dụng để bổ sung vào khẩu phần ăn cho heo, đáp
ứng nhu cầu P cho cơ thể đang phát triển của nó. Tuy nhiên khi khẩu phần ăn đƣợc

8
cung cấp thêm P vô cơ, lƣợng photpho mà heo không sử dụng (liên kết trong hợp
chất phytate) đƣợc thải vào môi trƣờng và nếu không đƣợc quản lý tốt sẽ có thể
gây nên những thiệt hại tiềm tàng cho môi trƣờng.



(Nguồn: Vũ Văn Vụ và ctv.,2000. Sinh lý học thực vật.)
Hình 2.4. Sơ đồ chu trình photpho trong tự nhiên
Ở gà cũng nhƣ những động vật dạ dày đơn khác (trong đó có cả heo) không thể
tiêu hóa đƣợc axit phytic khi đƣợc cho ăn với khẩu phần có chứa ngô và đậu nành.
Kết quả là chúng bài thải axit phytic ra khỏi cơ thể chúng ở dạng phân có chứa P.
Nếu nhƣ đậu nành, ngô, gạo chứa lƣợng axit phytic thấp thì chúng sẽ thải ra lƣợng
P ít hơn trong phân. Hiện nay các nhà công nghệ sinh học đã tạo ra giống ngô, đậu
nành, gạo có hàm lƣợng axit phytic thấp nhằm làm giảm sự ô nhiễm do P có trong
phân.
Ngoài mục tiêu tạo ra những hạt có hàm lƣợng axit phytic thấp, ngành
công nghệ sinh học cũng sản xuất đƣợc enzym phytase có nguồn gốc vi sinh vật
Các đá
trầm tích
Photphat

Thủy Nguyên
Sự kết cấu
lai hóa đá
Granit

ĐẤT

Động vật
Apatit
Đá Macma
Thực vật


9
biến đổi gen dùng làm nguồn bổ sung vào trong khẩu phần ăn. Phytase là enzym
làm phá vỡ cấu trúc của phytate. Enzym này đƣợc sản xuất ở mức rất giới hạn ở
động vật có vú, nhƣng nó đƣợc tạo ra nhiều ở vi khuẩn. Sự thêm phytase vào khẩu
phần ăn của thú dạ dày đơn cho thấy khả năng sử dụng P (Nelson và ctv., 1968;
Cromwell và ctv., 1991), cũng nhƣ những khoáng chất khác ( Biehl và ctv., 1995;
Radcliffe và ctv., 1995; Simpson và Wise, 1990), protein và amino axit (Johnston,
2000; johnston và ctv., 2004) gia tăng. Bằng việc sử dụng enzym phytase bổ sung
vào khẩu phần ăn cho động vật giúp làm giảm hàm lƣợng Photpho có trong phân.
So với công nghệ sinh học ứng dụng trong chăn nuôi thì công nghệ sinh
học ứng dụng trong thực vật chiếm ƣu thế hơn. Tuy nhiên các nhà công nghệ sinh
học trong nông nghiệp đã tạo đƣợc giống heo biến đổi gen có thể tạo ra enzym
phytase có trong nƣớc bọt và nó có thể tiêu hóa đƣợc axit phytic có trong thức ăn,
chuyển từ dạng photpho không tiêu hóa đƣợc sang dạng photpho có thể sử dụng
đƣợc. Vì vậy lƣợng photpho trong phân đƣợc thải ra giảm đáng kể, khoảng 64%
đến 67%.
Phân gà đƣợc thải ra ngoài môi trƣờng là nguồn phân bón cho cây trồng.
Tuy nhiên, nhiều P có trong phân thì không thể sử dụng đƣợc cho cây trồng bởi vì
nó nhanh chóng bị gắn kết ở trong đất. Điều này đặc biệt đúng với phytate.
Nếu nhƣ cây trồng có thể sử dụng photpho ở trong đất một cách hữu hiệu,
thì ngƣời ta có thể dùng phân gà bón cho cây trồng mà không gây ảnh hƣởng hoặc
nếu có thì cũng không đáng kể đối với môi trƣờng. Các nhà công nghệ sinh học
cũng đang nghiên cứu tạo ra những giống cây trồng có thể sử dụng photpho ở
trong đất có nguồn gốc từ phân một cách hiệu quả nhằm giảm bớt sự ô nhiễm môi

trƣờng do lƣợng phân thải ra trong chăn nuôi.

2.3 Công nghệ sinh học phân tử trên cây lúa.
Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trên thực vật không chỉ giải quyết những
vấn đề khó khăn trong cải tiến giống cây trồng, an toàn lƣơng thực thực phẩm,
phát triển kinh tế mà còn bảo đảm sự bảo tồn, đa dạng hóa nguồn gen và sự bền


10
vững. Công nghệ sinh học đang đóng vai trò nhƣ là công cụ sẵn sàng phục vụ cho
các nhà chọn giống thực vật, nhằm ứng dụng và tạo ra nhiều định hƣớng để gia
tăng sản lƣợng, đa dạng hóa cây trồng và sử dụng sản phẩm nguồn gen trong nông
nghiệp ngày càng phát triển bền vững (IAEA, Wienna, 2002). Sự phát triển không
ngừng với nhiều kỹ thuật hiện đại và ngày càng đƣợc cải tiến, đƣợc các nhà chọn
giống và các nhà sinh học phân tử ứng dụng. Các ứng dụng bắt đầu từ việc chọn
vật liệu để tạo ra các các tổ hợp lai, thiết lập hay liên kết bản đồ gen trên các tính
trạng quan trọng có ý nghĩa kinh tế qua di truyền số lƣợng (QTL). Thiết lập bản đồ
QTL và sự liên kết các gen dựa trên sự chọn lọc nhờ vào các đánh dấu phân tử
(MAS) ứng dụng trên quần thể hồi giao, quan hệ phả hệ và quần thể cận giao.
Thông qua sự so sánh của các hệ thống gen trên sinh vật, phƣơng pháp đánh dấu
phân tử cho phép khám phá và tìm ra sự đa dạng sinh học và tiến hóa của sinh vật
(IAEA, Wienna, 2002).
Chiến lƣợc chọn giống nhờ vào đánh dấu phân tử là phƣơng pháp tác động
mạnh đến hiệu quả chọn giống. Các đánh dấu có kết quả kỹ thuật cao trên cơ sở
PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu
đƣợc thế giới ủng hộ từ năm 1995. Chọn giống trên cơ sở đánh dấu phân tử từ
nguyên lý cơ bản là chứng minh, đánh dấu liên kết với gen nằm đúng vị trí (locus)
trên nhiễm sắc thể và vị trí này phản ánh đƣợc đặc tính mong muốn. Các đánh dấu
đƣợc chia thành hai nhóm: đánh dấu trên cơ sở PCR và đánh dấu thăm dò và lai
DNA ( Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Các kỹ thuật đánh dấu phân tử

nhƣ RFLP, AFLP, RAPD, SSR, ISSR, AFL, SCAR và STS cho phép chọn lọc
trực tiếp nhiều tính trạng trên quần thể F2, quần thể cận giao, những dòng đơn bội
kép và những dòng tái tổ hợp (IAEA, Wienna, 2002). Ứng dụng đánh dấu phân tử
trên cây lúa (Oryza sativa L.) thành công trong chọn giống chống chịu một số sâu
bệnh hại quan trọng nhƣ lập bản đồ gen kháng bệnh đạo ôn (Yu và ctv.,1991), gen
kháng bệnh bạc lá (Mc couch, 1991), lập bản đồ gen kháng rầy nâu (Nguyễn Thị
Lang và ctv., 2002), gen kháng sâu đục thân (Tan và ctv., 1993). Đánh dấu phân tử
RFLP đã đƣợc ứng dụng để thiết lập bản đồ gen trên cây lúa. Bản đồ phủ trên 12


11
nhiễm sắc thể và có chiều dài tổng cộng 1389cM từ cặp lai IR34538 (Indica) và
Bulu Dalam (Mc couch và ctv, 1998).
Trong những thập niên qua, di truyền Menden đã và đang bƣớc vào thời đại
mới, đƣợc gọi là hệ gen (Genomics), nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các
gen. Những thông tin về chuỗi mã DNA đã đƣợc giải mã trên một số loài điển
hình nhƣ lúa và Arapidopsis, nhƣng chức năng của các gen tìm thấy chƣa đƣợc
biết nhiều. Việc tạo ra đột biến trên cây trồng kết hợp với đánh dấu phân tử đang
đóng một vai trò quan trọng để giải quyết vấn đề trên, khi tác nhân gây đột biến
làm thay đổi các tính trạng mang gen mục tiêu. Các đánh dấu ứng dụng hiện nay
đƣợc xem nhƣ có hiệu quả đáng tin cậy là đánh dấu “siêu vệ tinh” hay còn gọi là
SSR (simple sequence repeats) và đang đƣa vào ứng dụng rộng đánh dấu “các thể
đa hình nucleotide đơn” hay SNP (Single nucleotid polymorphism) để xác định
đột biến.

2.4. Nghiên cứu di truyền gen axit phytic thấp
Kiểu gen và môi trƣờng là những nhân tố chính làm thay đổi tổng lƣợng
photpho trong hạt.Trong tự nhiên các kiểu gen điều khiển sự thay đổi lƣợng
photpho trong hạt chủ yếu là tăng hay giảm hàm lƣợng axit phytic mà các thành
phần chứa photpho khác không thay đổi. Ngƣời ta đã tạo đƣợc một số gen lặn

(lpa) làm giảm hàm lƣợng axit phytic bằng phƣơng pháp gây đột biến bằng hoá
chất và phân lập gen này ở trên cây bắp và cây lúa mạch. Các gen này làm thay
đổi rất lớn giữa các thành phần chứa photpho trong hạt nhƣ axit phytic, các
inositol photphate khác và photphate tự do.Trong đó gen đột biến lpa1 làm giảm
hàm lƣợng axit phytic bằng cách tự cân bằng sinh học trong phân tử với photphat
tự do (tức là làm tăng hàm lƣợng photphat tự do). Gen này đƣợc xác định nằm trên
chromosome 1S của cây bắp và trên chromosome 2H của cây lúa mạch. Tƣơng tự
đối với gen lpa2 thì axit phytic giảm cùng với các dạng inositol photphate khác và
làm tăng lên photphate tự do. Gen đột biến lpa2 đƣợc xác định nằm trên
chromosome 1S của cây bắp và chromosome 2H của cây lúa. Nhƣ vậy cho đến


12
nay tất cả các gen đột biến cho hàm lƣợng axit phytic thấp đều làm tăng lƣợng
photphate tự do. Đây chính là chỉ thị trong việc chọn lọc các dòng lúa đột biến có
hàm lƣợng axit phytic thấp.
Đột biến axit phytic thấp đƣợc tạo ra do các tác nhân đột biến trên các loài cây
trồng nhƣ bắp, lúa gạo, lúa mạch và đậu nành ( Ras-mussen và Hatzack, 1998;
Larson và ctv., 2000; Raboy và ctv., 2000; Wilcox và ctv., 2000) và đƣợc ứng
dụng trong nghiên cứu chọn giống di truyền (Raboy và ctv., 2001). Có hai loại đột
biến ảnh hƣởng đến axit phytic thấp trên bắp là đột biến lpa1 làm giảm lƣợng axit
phytic nhƣng không tích lũy inositol polyphotphate và đột biến lpa2 cũng làm
giảm lƣợng axit phytic nhƣng hạt đột biến này tích lũy InsP
3
, InsP
4
và InsP
5
(Raboy và ctv., 2000). Dạng đột biến lpa2 ở ngô (Zea mays) xảy ra do sự đột biến
ở gen inositol phosphate kinase. Gen inositol phosphate kinase ở ngô (ZmIpk)

đƣợc xác định thông qua sự so sánh trình tự với gen Ins(1,3,4)P
3
5/6-kinase ở
ngƣời và Arabidopsis. Dạng mRNA của gen ZmIpK biểu hiện ở trong phôi, nơi
mà hàm lƣợng axit phytic gia tăng ở hạt ngô. Phân tích Southern-blot, cloning, đọc
trình tự gen ZmIpK từ dạng đột biến lpa2 cho thấy alen lpa2-1 đƣợc tạo ra do sự
sắp xếp lại trình tự ở locus của gen ZmIpK và alen lpa2-2 đƣợc tạo ra do sự đột
biến nucleotide làm xuất hiện một codon stop ở đầu N của gen ZmIpK. Và điều
này cho thấy ZmIpK là một trong những enzym kinase tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp axit phytic trong giai đoạn phát triển của hạt. Sinh tổng hợp axit phytic
thấp trong hạt và sự xác định gen thông qua con đƣờng phân lập các nhân bản
cDNA trên bắp. Các nhân bản này có chuỗi mã di truyền giống với nhiều inositol
photphat kinase từ động vật và nấm men. Ứng dụng kỹ thuật bất hoạt chèn đoạn
mã đột biến (Mutator insertion knockout) để điều tra chức năng của gen. Sau khi
bất hoạt những gen này, hàm lƣợng axit phytic trong hạt sẽ giảm, hạt sẽ tích lũy
myo-inositol, inositol photphat và photphat tự do.
Trong sự phát triển của hạt, axit phytic đƣợc tổng hợp từ quá trình đƣờng phân
(Gluco-6-P). Enzym Ins(3) P
1
synthase (MIPS) xúc tác quá trình Glucose-6-
photphate để tạo ra Ins(3) P
1
.


13
Phân tích clone MIPS ở cây yến mạch (Avena sativa) cho thấy clone này chứa
1936 bp (accession no. AB059557) mã hóa cho polypeptid có số lƣợng amino axit
là 510 và có tính tƣơng đồng cao với nhiều loại cây trồng khác. Theo Yoshida và
ctv. cho thấy độ tƣơng đồng amino axit giữa protein MIPS ở cây yến mạch với

protein MIPS của các cây khác vào khoảng 77 đến 88% (Yoshida và ctv..1999,
Hageman và ctv.. 2001). Protein MIPS có trọng lƣợng 56.13 kD. Phân tích bằng
phƣơng pháp Northern blot cho thấy gen MIPS biểu hiện cao trong suốt giai đoạn
đầu trƣởng thành của hạt và giảm hoạt động ở cuối giai đoạn trƣởng thành. Nồng
độ axit phytic cũng tăng từ từ cùng với sự trƣởng thành của hạt. RNA của gen
MIPS ít đƣợc phát hiện thấy ở hoa và không phát hiện đƣợc ở thân và lá. Nồng độ
RNA MIPS cao nhất đƣợc phát hiện ở những hạt giai đoạn chƣa trƣởng thành của
hạt và giảm từ từ theo quá trình phát triển của hạt.

Hình 2.5. Phân tích bằng phƣơng pháp Northern-blot ở cây yến mạch.
A: biểu hiện của gen MIPS ở hạt chƣa trƣởng thành (1), lá (2) và thân (3) sau
5 ngày trổ hoa. B: Biểu hiện gen MIPS ở hạt đang phát triển lúc 0, 5, 10, 15
và 25 ngày sau khi trổ hoa.

(Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm)


14

Hình 2.6. Sự thay đổi nồng độ P tổng, axit phytic và và P vô cơ sau khi trổ
hoa ở cây yến mạch.

(Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm)
Phân tích hàm lƣợng P tổng số, axit phytic cho thấy nồng độ P tổng số ở hoa là
3,51 mg/g trọng lƣợng khô (DW), và tăng từ từ với sự trƣởng thành của hạt (Hình
2.6). Nồng độ P tổng số ở hạt trƣởng thành đạt 10,15 mg/g trọng lƣợng khô lúc 65
ngày sau khi ra hoa (giai đoạn trƣởng thành đầy đủ ). Axit phytic bắt đầu tăng ở
giai đoạn đầu và tăng nhanh cùng sự trƣởng thành của hạt với nồng độ 5,97 mg/g
trọng lƣợng khô. Nồng độ P vô cơ là 1,58 mg/g trọng lƣợng khô ở hoa và tăng đến
3,3 mg/g trọng lƣợng khô sau 30 ngày trổ hoa, sau đó giảm nhanh cùng với sự

tăng lên của axit phytic. Những hợp chất chứa P khác ngoại trừ axit phytic và axit
vô cơ thì nồng độ tƣơng đƣơng với nồng độ P vô cơ ở giai đoạn phát triển ban đầu
của hạt. Hợp chất P khác chứa P tế bào đƣợc định nghĩa là những hợp chất đƣờng
có chứa P, trọng lƣợng phân tử thấp tham gia vào thành phần cấu tạo của màng tế
bào. Những hợp chất này là những tiền chất quan trọng trong sinh tổng hợp axit
phytic và inositol photphat. P đƣợc hấp thụ bởi cây trồng sẽ đƣợc chuyển trực tiếp
vào hạt và đóng vai trò quan trọng cho việc tổng hợp những hợp chất hữu cơ chứa
P ở giai đoạn đầu của quá trình trƣởng thành. Những kết quả nghiên cứu này cho
thấy enzym MIPS biểu hiện mạnh trong hạt và đóng vai trò sinh tổng hợp axit
phytic trong suốt quá trình phát triển của hạt.


15
2.5. Đánh dấu siêu vệ tinh (Microsatellite)
Đánh dấu siêu vệ tinh hay SSR đƣợc ứng dụng thành công từ năm 1995 (Mc
couch và ctv., 1996). Đó là tập hợp các đoạn chuỗi mã rất ngắn từ 2-10bp. Các
đoạn này xuất hiện trên chuỗi mã DNA đƣợc lặp đi lặp lại nhất định, sắp xếp ngẫu
nhiên, rất khác nhau đƣợc phân tán khắp nơi trên bộ gen động vật thực vật và con
ngƣời (Gunter Kahl, 2001). Những chuỗi mã ngắn này có thể ở dạng lặp lại của
hai, ba hay bốn nucleotid và đƣợc xắp xếp ngẫu nhiên trên một dãy của 5-50 bản
sao (copy) chẳng hạn nhƣ (AT)
29
, (CAC)
16
hay (GACA)
32
. SSR xuất hiện rất nhiều
trên bộ gen thực vật và có mặt trung bình sau mỗi 6-7kb (Cardle và ctv., 2000).
Các đoạn này đƣợc khuyếch đại trong phản ứng PCR nhờ vào mồi xuôi và mồi
ngƣợc. Sản phẩm PCR chứa các alen SSR đƣợc tách rời thông qua điện di trên gel

agarose hay gel acrylamide.
SSR hữu ích trong việc thiết lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lý và bản đồ chuỗi
mã cơ bản (Sequence-based) trên cây lúa. Ngoài ra SSR còn cung cấp cho nhà
chọn giống và nhà di truyền công cụ đáng tin cậy và hiệu quả để liên kết sự khác
biệt giữa kiểu gen và kiểu hình .

2.6. Quá trình sinh tổng hợp axit phytic
Con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic có thể tóm tắt gồm 2 phần sau: sự cung
cấp Ins và sự tổng hợp Ins polyphotphat sau đó. Nguồn tổng hợp vòng Ins duy
nhất là enzym Ins(3) P
1
synthase (MIPS). Enzym này chuyển Glc-6-P thành Ins(3)
P
1
(Loewus và Murthy, 2000). Hoạt tính enzym Ins(3) P
1
synthase ở những hạt
đang phát triển cung cấp Ins cũng nhƣ Ins(3)P
1
(Yoshida và ctv., 1999) mà sau đó
sẽ đƣợc chuyển thành axit phytic qua sự photphoryl hóa của hai hay nhiều enzym
kinase (Biswas và ctv., 1978; Stephens và Irvine, 1990 ). Bƣớc photphoryl hóa
Inositol đầu tiên đƣợc xúc tác bởi enzym Inositol kinase. Enzym này cũng xúc tác
tạo ra Ins(3)P
1
(English

và ctv., 1966; Loewus và ctv., 1982). Con đƣờng tổng hợp
axit phytic khởi đầu bằng cơ chất ban đầu là Ins, hoạt động của enzym Ins kinase
và trải qua nhiều giai đoạn photphoryl hóa thông qua những hợp chất trung gian đã

16
đƣợc miêu tả lần đầu tiên thông qua những nghiên cứu ở nấm nha bào
Dictyostelium discoideum (Stephens

và Irvine, 1990) và những nghiên cứu sau này
ở tập đoàn đơn bào

Spirodela polyrhiza (Brearley và Hanke, 1996, 1996b. Con
đƣờng sinh tổng hợp ở D. Discoideum tiến hành thông qua những hợp chất trung
gian Ins(3)

P
1
, Ins(3,6) P
2
, Ins(3,4,6) P
3
, Ins(1,3,4,6) P
4
, và Ins(1,3,4,5,6)

P
5
. Con
đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở S. Polyrhiza tiến hành thông qua những hợp
chất trung gian Ins(3) P
1
, Ins(3,4) P

2
, Ins(3,4,6) P
3
, Ins(3,4,5,6) P
4
, và
Ins(1,3,4,5,6)

P
5
. Những con đƣờng này có điểm chung ở những hợp chất trung
gian đầu và cuối. Những Ins photphat này vẫn chƣa đƣợc biết với vai trò là những
chất truyền tín hiệu thứ cấp.
Sự tổng hợp axit phytic cũng có thể tiến hành một phần qua những con đƣờng
liên quan đến những chất truyền tín hiệu bao gồm photphatidylinositol (PtdIns),
những photphat trung gian và Ins(1,4,5)P
3
(Bƣớc 6 và 7; Van der kayy và ctv.,
1995; York và ctv., 1999). Ins photphat bị photphoryl hóa ở mức độ cao hơn axit
phytic nhƣ là InsP
7
và InsP
8
, là những hợp chất đƣợc ghi nhận là xảy ra phổ biến ở
tế bào eukaryotic (steps 12 và 13; Mayr

và ctv., 1992; Menniti và ctv., 1993;
Stephens và ctv., 1993; Brearley

và Hanke, 1996c; Safrany và ctv., 1999)

Những nghiên cứu còn cho thấy (Biswas và ctv., 1978b; Phillippy và ctv.,
1994; Brearley và Hanke, 1996b) Ins(1,3,4,5,6) P
5
còn đóng vai trò là chất Ins
photphat sau cùng trong con đƣờng tổng hợp axit phytic ở tế bào eukaryotic.


17

Hình 2.7. Sơ đồ con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở trong tế bào
eukaryo: (1), D-Ins(3)-P
1
(or L-Ins[1]-P
1
) synthase; (2), D-Ins 3-phosphatase
(or L-Ins 1-phosphatase); (3), D-Ins 3-kinase (or L-Ins 1-kinase); (4), Ins P- or
polyP kinases; (5), Ins (1,3,4,5,6) P
5
2-kinase hay phytic acid-ADP
phosphotransferase; (6), PtdIns synthase; (7), PtdIns và PtdIns P kinases,
theo sau bởi PtdIns P-specific phospholipase C, và Ins P kinases; (8), D-
Ins(1,2,3,4,5,6) P
6
3-phosphatase; (9) D-Ins(1,2,4,5,6) P
5
3-kinase; (10), D-
Ins(1,2,3,4,5,6) P
6
5-phosphatase; (11), D-Ins(1,2,3,4,6) P
5

5-kinase; (12),
pyrophosphate-forming Ins P
6
kinases; (13), pyrophosphate-containing Ins
PolyP-ADP -phosphotransferases.

Nguồn:


18
CHƢƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1 thánh 8 năm
2005 tại phòng phân tích sinh hóa và phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc Bộ
Môn Di Truyền và Chọn Giống của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, quận
Ô Môn, TP. Cần Thơ.

3.2. Vật liệu
Tên của các giống lúa trong thí nghiệm
Bảng 3.1. Tên các giống lúa đƣợc phân tích

Số thứ tự Tên giống
1
2
3
4
5
6
OM 1490 dạng bố mẹ

OMCS 2000 dạng bố mẹ
OM 1490 đột biến
OMCS 2000 đột biến
Lúa mùa
Lúa cao sản



3.3. Nguồn gốc vật liệu
Các quần thể lúa đột biến, lúa mùa và lúa cải tiến trên đƣợc lấy tại ngân
hàng lúa của viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong đó:
OMCS 2000, OM 1490, AS996, NTCĐ-5 đƣợc Bộ môn di truyền Viện
Lúa Đồng Bằng sông Cửu Long phát triển bằng phƣơng pháp lai tạo và tạo biến dị
soma.


19
OM CS2000 đƣợc phát triển từ cặp lai OM1738/MRC19399 và OM 1490
đƣợc phát triển từ cặp lai OM606/IR44592-62-1-3-3 . Đây là hai giống đƣợc chọn
số dòng nhiều để đánh giá và phân tích hàm lƣợng axit phytic .
Quần thể lúa đột biến OM1490 và OMCS2000 đƣợc tạo ra bằng việc gây
đột biến bằng tia gamma với 5 Kr và phát triển thông qua chọn lọc ở các thế hệ
M
0
M
1
, M
2
, M
3

và M
4
....
AS996 đƣợc phát triển từ phƣơng pháp lai xa và cứu sống phôi mầm IR 64/
O. Rufipogon và đƣợc phóng xạ bằng tia gamma với 3Kr
Nàng thơm Chợ Đào -5 đƣợc đột biến bằng tế bào soma và tiếp tục đƣợc
đột biến với tia phóng xạ gamma với cƣờng độ 5 Kr .
Qui trình phát triển dòng đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ( Lang
2004)

















OM O OM 606 x IR44592 – 62 – 1 – 3 – 3
OM 1490
M
0

M
1

M
2

M
3

M
4

Tia Gamma với 5 Kr
OM 1738 x MRC 19399
OMCS 2000
M
0

M
1

M
2

M
3

M
4

Tia Gamma với 5 Kr