KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: THIẾT LẬP QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT (Phần phụ)

LỜI CẢM TẠ
CHÚNG TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN
Công ty Bio – Rad đã tài trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện đề tài
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ
Chí Minh
Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong suốt thời gian thực tập để
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
CHÚNG TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN
Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi
hoàn thành khóa luận này.
Thầy Trần Nhật Phương đã giúp đỡ chúng tôi rất nhiều về kinh phí và hóa chất
để thực hiện đề tài này.
Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực tập
tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh.
Chị Phan Thị Thu Hiền đã tận tình chỉ dạy chúng tôi các thao tác, kĩ năng phòng
thí nghiệm.
Anh Nguyễn Đức Thành và anh Phương (Trung tâm Y Tế Quận 9) đã nhiệt tình
chỉ dẫn chúng tôi trong kỹ thuật rửa phim X- quang.
Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ
môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp
đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận.
Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi
trong thời gian thực tập.
i
TÓM TẮT
LÊ MINH KHA, NGUYỄN VĂN LẪM, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Tháng 09/2005. “THIẾT LẬP QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT”.
Giảng viên hướng dẫn:

TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN
Đề tài là một hướng nghiên cứu phát triển của phương pháp lai phân tử trong điều kiện
phòng thí nghiệm, mà bước đầu là hoàn thiện phương pháp Southern blot áp dụng trên
vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được thực hiện theo qui trình của Kurt Weising và
ctv (1995) và qui trình của kit Gene Image AlkPhos Direct Labelling and Detection
System Amersham. Qui trình trải qua các giai đoạn từ bước chuẩn bị mẫu lai như tăng
sinh vi khuẩn; ly trích genomic DNA; thực hiện phản ứng cắt; điện di chuyển lên màng
và làm khô màng đến tạo được phân tử đánh dấu từ sản phẩm PCR của gen phlD sau khi
đã được tinh sạch bằng phương pháp cắt gel, cuối cùng thực hiện phản ứng lai và phát
hiện sản phẩm lai trên phim X-ray. Với kết quả đạt được là:
- Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn
- Đánh dấu probe từ sản phẩm PCR trên cặp primer B2BF, BRR4
- Thiết lập được phản ứng lai và cho phát hiện kết quả lai trên phim X – ray.
Tuy nhiên, đề tài vẫn chưa được hoàn thiện trên các mẫu là genomic DNA đã
được cắt bằng enzyme giới hạn.
Tóm lại, chúng tôi đã thiết lập được qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens nhưng vẫn chưa hoàn thiện được qui trình ở mức genomic
DNA. Kết quả này là cơ sở ban đầu trong việc hoàn thiện phương pháp lai phân tử để
phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật.
MỤC LỤC
ii
Trang
Trang tựa
Lời cảm tạ........................................................................................................................i
Tóm tắt ...........................................................................................................................ii
Mục lục............................................................................................................................iii
Danh mục các chữ viết tắt .............................................................................................vi
Danh mục các hình........................................................................................................vii
Danh mục các bảng.........................................................................................................ix
Phần 1. MỞ ĐẦU .........................................................................................................1

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU – PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT........3
2.1 Lịch sử phát triển của phương pháp Southern blot...................................................3
2.2 Nguyên tắc của phương pháp Southern blot.............................................................4
2.3 Một số ứng dụng của phương pháp Southern blot....................................................4
2.4 Sự khác nhau giữa Southern blot, Northern blot, và Western blot............................5
2.5 Một số phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn ...................................................5
2.5.1 Phương pháp sử dụng SDS ................................................................................6
2.5.2 Phương pháp sử dụng CTAB.............................................................................7
2.5.3 Phương pháp sử dụng Phase Lock Gel
TM
(Jones và Bartlet, 1990)...................8
2.6 Một số phương pháp định tính và định lượng DNA.................................................9
2.6.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế.....................................................9
2.6.2 Điện di (Electrophoresis)....................................................................................10
2.6.3 Định lượng DNA bằng phân tử Mass.................................................................11
2.7 Enzyme giới hạn (Restriction enzyme)....................................................................12
2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn .............................................................................12
2.7.2 Các loại enzym giới hạn ....................................................................................13
2.7.3 Các kiểu cắt của enzym giới hạn........................................................................13
2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng.......................................................................15
2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)....................................................15
2.8.1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA Polymerase ..................16
2.8.2 Ứng dụng phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn Pseudomonas fluorescense
định cư trong đất và trong vùng rễ cây trồng............................................................16
2.9 Phương pháp tinh sạch DNA....................................................................................17
iii
2.9.1 Phương pháp tinh sạch DNA bằng phenol.........................................................17
2.9.2 Phương pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX .....................................................17
2.10 Các phương pháp chuyển DNA lên màng ...........................................................................19
2.10.1 Phương pháp mao dẫn hướng lên (Upward Capillary Transfer)......................19

2.10.2 Phương pháp mao dẫn hướng xuống (Downward Capillary Transfer)............21
2.10.3 Phương pháp mao dẫn hai chiều
(Simultaneous Transfer to Two Membranes)..................................................21
2.10.4 Phương pháp chuyển bằng điện (electrophoresis transfer)...............................22
2.10.5 Phương pháp chuyển bằng chân không ...........................................................23
2.11 Đánh dấu probe.......................................................................................................24
2.11.1 Tác nhân đánh dấu............................................................................................24
2.11.1.1 Hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ............................................................24
2.11.1.2 Hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ.................................................25
2.11.2 Phương pháp đánh dấu ....................................................................................29
2.11.2.1 Phương pháp nick – translation.................................................................29
2.11.2.2 Phương pháp random priming (thiết lập mồi ngẫu nhiên)........................30
2.11.2.3 Phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi)..........................32
2.11.2.4 Phương pháp photobiotin .........................................................................32
2.12 Các phương pháp lai phân tử...................................................................................35
2.12.1 Cơ sở của sự lai phân tử ................................................................................35
2.12.1.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA.............................................35
2.12.1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA......................36
2.12.1.3 Khái niệm về lai phân tử ..........................................................................37
2.12.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử..................................................37
2.12.2 Các kiểu lai phân tử .......................................................................................37
2.12.2.1 Lai trong pha lỏng.....................................................................................37
2.12.2.2 Lai trên pha rắn ........................................................................................38
2.12.2.3 Lai tại chổ (in situ hybridization).............................................................39
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................40
3.1 Thời gian và địa điểm................................................................................................40
3.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................................40
3.3 Phương pháp nghiên cứu...........................................................................................40
iv
3.3.1 Vật liệu thí nghiệm..............................................................................................40

3.3.2 Phương pháp tiến hành .......................................................................................43
3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB.............42
3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens..........42
3.3.2.3 Hiệu chỉnh nồng độ và định lượng DNA bằng phân tử Mass......................45
3.3.2.4 Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng ezyme giới hạn.......................46
3.3.2.5 Thực hiện phản ứng PCR trên hai cặp primer B2BF, BRR4........................48
3.3.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel...................................50
3.3.2.7 Thực hiện đánh dấu sản phẩm PCR của cặp primer B2BF, BRR4..............51
3.3.2.8 Tạo mẫu lai...................................................................................................52
3.3.2.9 Lai Southern.................................................................................................55
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................57
4.1 Kết quả tăng sinh, ly trích và định lượng DNA........................................................57
4.1.1 Kết quả ly trích genomic DNA.........................................................................57
4.1.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ..............................................................................58
4.1.3 Kết quả định lượng bằng phân tử Mass............................................................59
4.2 Kết quả phản ứng cắt DNA bằng enzyme giới hạn..................................................59
4.3 Kết quả phản ứng PCR với hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b...........61
4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel ...................................62
4.5 Kết quả lai Southern..................................................................................................63
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................69
5.1 Kết luận.....................................................................................................................69
5.2 Đề nghị......................................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................75
Phụ lục 1..........................................................................................................................77
Phụ lục 2..........................................................................................................................79
Phụ lục 3 .........................................................................................................................82
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
v